拉曼光譜檢測(cè)食源性致病菌生物被膜的研究進(jìn)展

朱華劍,董慶利,申佳琪,牛洪梅,胡敏敏,竇鑫,賈凱,李代禧,劉陽(yáng)泰*

1(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院,上海,200093)2(上海理工大學(xué) 光電信息與計(jì)算機(jī)工程學(xué)院,上海,200093)

食品生產(chǎn)加工、儲(chǔ)藏等過(guò)程中,部分食源性致病菌可在不銹鋼、塑料、玻璃等食品接觸表面生成胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS),形成呈三維膜狀結(jié)構(gòu)特征的生物被膜[1-2]。在由多糖、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物大分子組成的EPS保護(hù)下,生物被膜狀態(tài)的菌群更難以被清除,且會(huì)通過(guò)釋放菌體,加劇食源性致病菌的傳播[3]。因此,生物被膜被認(rèn)為是食品安全的重大威脅之一,需要在食品生產(chǎn)供應(yīng)鏈中持續(xù)監(jiān)測(cè)[4]。

生物被膜的檢測(cè)具有挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)定性檢測(cè)主要采用結(jié)晶紫、剛果紅、銀染等染色方法,但樣品處理過(guò)程復(fù)雜,可重復(fù)性差,誤判率高[5-6];定量檢測(cè)則常用微生物培養(yǎng)計(jì)數(shù)法,但培養(yǎng)周期長(zhǎng),無(wú)法快速獲得檢測(cè)結(jié)果[7-9]。隨著光學(xué)技術(shù)、電化學(xué)傳感技術(shù)等發(fā)展迅速,其也被初步應(yīng)用于生物被膜的快速可視化檢測(cè)。例如,光學(xué)、力學(xué)、電子顯微鏡技術(shù)可用于觀測(cè)生物被膜的三維結(jié)構(gòu)和分布,但難以定量生物被膜及其組成[10];核磁共振方法可獲取生物被膜基質(zhì)中物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息,但對(duì)樣本制備和數(shù)據(jù)分析要求高[11];光譜方法理論上可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物被膜的實(shí)時(shí)、無(wú)損、原位定量分析,但常見(jiàn)的紅外光譜方法會(huì)因—OH抑制生物被膜組分的特征帶,水信號(hào)過(guò)強(qiáng),信噪比較低[12]。近年來(lái),拉曼光譜技術(shù)逐漸被應(yīng)用于生物被膜的檢測(cè)中,其通過(guò)光的非彈性散射,無(wú)探針原位分析識(shí)別化學(xué)特征,避免了上述技術(shù)的缺點(diǎn)。光譜中的每個(gè)拉曼峰都是特定分子鍵的特征,可作為每個(gè)生化成分特定的“指紋”,易于對(duì)包含各種分子和分子基團(tuán)(如蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)和核酸)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)分析,且拉曼峰的偏移不受水的影響[13-14]。

基于此,本文從拉曼光譜的技術(shù)原理出發(fā),介紹了拉曼光譜采集生物被膜分子信息的技術(shù)和數(shù)據(jù)分析方法,歸納了拉曼光譜可識(shí)別的生物被膜特征物質(zhì)及對(duì)應(yīng)關(guān)系,并總結(jié)了該技術(shù)在檢測(cè)細(xì)菌黏附、生物被膜形成、信號(hào)分子調(diào)控等過(guò)程中的應(yīng)用研究進(jìn)展,最后討論了通過(guò)結(jié)合其他技術(shù),進(jìn)一步提升拉曼光譜獲取生物被膜特征能力的可行性。

1 拉曼光譜原理與主要技術(shù)

1.1 拉曼光譜原理

拉曼光譜是一種基于拉曼散射效應(yīng)的光譜分析技術(shù)[15]。當(dāng)樣品暴露在可見(jiàn)單色光下時(shí),樣品會(huì)吸收光線,大部分光會(huì)透過(guò)樣本,小部分光會(huì)被樣品散射到各個(gè)方向。當(dāng)特定頻率的入射光與其散射光頻率一致時(shí),則被稱為瑞利散射。由于該過(guò)程沒(méi)有發(fā)生能量交換,也被稱為彈射散射。總散射光中大約有1%,其頻率和入射光不同,這部分稱為拉曼散射或非彈性散射。拉曼散射又分為斯托克斯散射和反斯托克斯散射,二者均勻的分布于瑞利散射的兩側(cè)。當(dāng)分子跳回到電子振動(dòng)基態(tài)的較高能級(jí)時(shí),入射光的頻率大于散射光,光子發(fā)生紅移,稱為斯托克斯散射;當(dāng)分子跳回到基態(tài)能級(jí)時(shí),入射光頻率小于散射光頻率,激光光子發(fā)生藍(lán)移,則稱為反斯托克斯散射。瑞利散射和拉曼散射的能級(jí)圖如圖1所示。由于散射光子的頻率取決于分子鍵的類型,因此,每個(gè)分子的拉曼光譜是唯一的,可以作為該分子的指紋譜。

圖1 瑞利散射與拉曼散射的能級(jí)圖Fig.1 Energy level diagram of Rayleigh scattering and Raman scattering

1.2 獲取生物被膜拉曼光譜的主要技術(shù)

1.2.1 顯微共聚焦拉曼光譜

由于生物被膜的尺度在微米至納米水平,因此傳統(tǒng)拉曼光譜的檢測(cè)分辨率無(wú)法滿足相關(guān)檢測(cè)的要求。如圖2所示,顯微共聚焦拉曼光譜(confocal Raman microscopy,CRM)將拉曼光譜與激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy,CLSM)集成,可為微生物研究提供納米級(jí)的空間分辨力[16]。拉曼顯微光譜最初常用于微生物培養(yǎng)物的單細(xì)胞分析[17],VIRDIS等[18]則首次實(shí)驗(yàn)證明CRM可以用于監(jiān)測(cè)生物被膜的形成過(guò)程,且不會(huì)影響其結(jié)構(gòu)或代謝活動(dòng)。對(duì)不同種類生物被膜的研究表明,CRM可以將生物被膜內(nèi)的各種結(jié)構(gòu)外觀與其化學(xué)成分的變化相關(guān)聯(lián),并推斷生物被膜基質(zhì)中復(fù)雜組成物質(zhì)的化學(xué)信息。

圖2 顯微共聚焦拉曼光譜結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Structure diagram of confocal Raman microscopy

1.2.2 表面增強(qiáng)拉曼散射

在利用拉曼光譜技術(shù)開(kāi)展生物被膜檢測(cè)過(guò)程中,常發(fā)生信號(hào)強(qiáng)度過(guò)低導(dǎo)致檢測(cè)失敗的情況,表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)技術(shù)的開(kāi)發(fā)則很好地解決了這一問(wèn)題。SERS是一種依靠納米結(jié)構(gòu)金屬在光激發(fā)下產(chǎn)生的大電場(chǎng)來(lái)增強(qiáng)金屬附近分子對(duì)光子的非彈性散射的技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn),使用貴金屬納米結(jié)構(gòu)可以大大增強(qiáng)微弱的拉曼散射信號(hào),并可通過(guò)電磁增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)機(jī)制進(jìn)行解釋[19]。IVLEVA等[20]率先研發(fā)了應(yīng)用SERS檢測(cè)生物被膜的方法,其使用鹽酸羥胺還原銀納米顆粒(nano particles,NPs)作為SERS基底,將生物被膜包裹的載玻片浸入銀膠體懸浮液后,進(jìn)行SERS測(cè)量。隨著技術(shù)優(yōu)化,目前主要有2種方法制備SERS實(shí)驗(yàn)用生物被膜樣品[21-22]:一是將生物被膜與金、銀為主的金屬膠體或離子溶液簡(jiǎn)單混合,然后將溶液滴注到固體基底上待測(cè),但該方法的局限性在于拉曼信號(hào)增強(qiáng)僅限于膠體附近的生物被膜表面,結(jié)果的可重復(fù)性和穩(wěn)定性均較差;二是將浮游菌體附著于NPs修飾過(guò)的表面形成生物被膜,該方法得到的光譜圖重復(fù)性更高,數(shù)據(jù)結(jié)果更穩(wěn)定,因此也是目前的主流方法[13]。

SERS為檢測(cè)生物分子信號(hào)開(kāi)辟了新的可能性,但目前SERS基底制備缺少標(biāo)準(zhǔn)化操作,SERS基底的化學(xué)性差異直接影響不同物質(zhì)的準(zhǔn)確鑒定。同時(shí),SERS光譜采集中,一些金屬(尤其是銀)對(duì)微生物具有一定抑制作用,長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)和高濃度的NPs,可能導(dǎo)致活菌數(shù)量顯著減少,影響檢測(cè)結(jié)果[23]。因此,應(yīng)根據(jù)細(xì)菌種類和環(huán)境條件,進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)置基底制備步驟和細(xì)菌-NPs濃度比,降低檢測(cè)誤差,提高SERS檢測(cè)生物被膜的魯棒性。

1.3 分析生物被膜拉曼光譜數(shù)據(jù)的方法

由于微生物樣品中蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸、脂質(zhì)等化學(xué)鍵的分子振動(dòng)所獲得的光譜通常非常相似,這使得拉曼光譜數(shù)據(jù)分析成了一個(gè)難點(diǎn)。為了降低冗余數(shù)據(jù)的影響,一般先對(duì)光譜圖進(jìn)行基線扣除、平滑降噪、消除宇宙射線、歸一化等預(yù)處理[24]。預(yù)處理后的數(shù)據(jù),進(jìn)一步采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法實(shí)現(xiàn)生物被膜化學(xué)組成的分析。

在微生物化學(xué)計(jì)量分析中,通常分為有監(jiān)督和無(wú)監(jiān)督2種基本方法。根據(jù)定性或定量的任務(wù)需求,監(jiān)督方法又分為分類和回歸兩類模型。監(jiān)督方法需要樣本的先驗(yàn)知識(shí),例如偏最小二乘回歸(partial least-squares regression, PLSR)、支持向量機(jī)(support vector machine, SVM)判別分析、線性判別分析(linear discriminant analysis, LDA)等。SHEN等[25]建立了一種基于纖維探針拉曼光譜的細(xì)菌生物被膜分類方法,利用大腸桿菌等5種細(xì)菌建立主成分分析(principal component analysis,PCA)-LDA模型,對(duì)未知細(xì)菌生物被膜的識(shí)別率最高可達(dá)97.5%。KUSI等[26]利用拉曼顯微光譜結(jié)合SVM,對(duì)自來(lái)水中作為浮游細(xì)胞和生物被膜生長(zhǎng)的9種細(xì)菌(如銅綠假單胞菌等)進(jìn)行鑒別測(cè)定。EBERT等[27]將47例不同疾病背景患者的臨床金黃色葡萄球菌的拉曼光譜圖與其生物被膜形成特征相關(guān)聯(lián)。對(duì)生物被膜形成的拉曼光譜進(jìn)行PLSR分析,可以獲得拉曼光譜與生物被膜吸光度值的線性相關(guān)性。PLSR負(fù)載系數(shù)突出了高生物被膜量和低生物被膜量之間代表核酸、碳水化合物和蛋白質(zhì)的拉曼譜帶的光譜差異;無(wú)監(jiān)督分類方法不需要樣本的先驗(yàn)知識(shí),如PCA和層次聚類分析(hierarchical cluster analysis, HCA)。由于PCA具有去除冗余重疊光譜信息的能力,因此是用于區(qū)分不同生物被膜EPS成分差異的最常用的有力工具。TAHIR等[14]用拉曼光譜結(jié)合PCA表征和比較9種細(xì)菌生物被膜分泌出的2種不同種類的胞外多糖:葡聚糖和果聚糖。DU等[28]采集了不同耐干燥水平的阪崎克羅諾桿菌菌株形成的生物被膜的拉曼光譜圖,PCA結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同耐干燥水平的菌株主要成分存在差異,證明了多糖、蛋白質(zhì)和類胡蘿卜素的水平可能在菌體耐干燥環(huán)境中起重要作用。CHOO-SMITH等[29]對(duì)不同位置、深度的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生物被膜光譜進(jìn)行HCA,發(fā)現(xiàn)菌落中存在不同的層,進(jìn)一步的研究表明,從菌落表面獲得的光譜顯示出比菌落深層更高的糖原水平,來(lái)自較深層的光譜具有比表面層更高的RNA水平。

化學(xué)計(jì)量學(xué)模型建立后還需對(duì)模型的準(zhǔn)確率進(jìn)行驗(yàn)證,驗(yàn)證的主要方法可分為交叉驗(yàn)證(又稱內(nèi)部驗(yàn)證)和獨(dú)立驗(yàn)證(又稱外部驗(yàn)證)。交叉驗(yàn)證使用建立模型的光譜數(shù)據(jù)測(cè)試模型預(yù)測(cè)能力,例如K-fold交叉驗(yàn)證(K-fold Cross-validation)方法將數(shù)據(jù)集隨機(jī)劃分為K個(gè)子集,訓(xùn)練模型時(shí)隨機(jī)選擇K-n份作為訓(xùn)練集,剩下的n份作為測(cè)試集,是目前最常用的交叉驗(yàn)證技術(shù)之一[30]。交叉驗(yàn)證常用于檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目芍貜?fù)性,可防止模型過(guò)擬合,還可用于插補(bǔ)數(shù)據(jù)缺失值;獨(dú)立驗(yàn)證根據(jù)未用于構(gòu)建模型的數(shù)據(jù)評(píng)估模型的性能,主要用于考察模型的可遷移性和泛化能力,其結(jié)果對(duì)于將該模型推向?qū)嶋H應(yīng)用至關(guān)重要。

2 生物被膜研究中的拉曼光譜應(yīng)用

在已實(shí)現(xiàn)的拉曼光譜生物被膜研究與應(yīng)用中,主要涉及生物被膜基質(zhì)組成的快速、無(wú)損檢測(cè),浮游菌體與生物被膜的差異比較,生物被膜形成和代謝過(guò)程的物質(zhì)變化監(jiān)測(cè),以及生物被膜的抗逆機(jī)理探究等方面。

2.1 生物被膜基質(zhì)組成的檢測(cè)

食品中常見(jiàn)的沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌、阪崎克羅諾桿菌等食源性致病菌均能在一定環(huán)境條件下形成生物被膜。與浮游菌體相比,生物被膜的拉曼譜帶特征峰存在差異,通過(guò)關(guān)聯(lián)不同特征峰對(duì)應(yīng)的官能團(tuán),如糖類、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等,即可用于識(shí)別細(xì)菌的生物被膜。表1概括了常見(jiàn)食源性致病菌生物被膜拉曼特征峰與其基質(zhì)內(nèi)主要生物大分子的對(duì)應(yīng)關(guān)系。需要注意的是拉曼光譜和SERS光譜特征反映了相似的生化性質(zhì),但SERS的增強(qiáng)效應(yīng)可能導(dǎo)致譜帶的偏移,兩者并非完全一致。

表1 食源性致病菌生物被膜基質(zhì)的代表性拉曼特征峰Table 1 Representative Raman characteristic peaks of biofilm substrates of foodborne pathogens

2.2 生物被膜形成過(guò)程的檢測(cè)

目前,一般認(rèn)為細(xì)菌生物被膜的形成有5個(gè)階段的動(dòng)態(tài)過(guò)程:菌體附著于介質(zhì)表面;細(xì)菌分泌EPS;微菌落形成;微菌落發(fā)展成成熟的生物被膜;生物被膜中浮游態(tài)細(xì)菌分散到周圍環(huán)境中[38-39]。由于拉曼光譜特征可用于識(shí)別某一時(shí)間點(diǎn)的生物被膜基質(zhì)中生物分子及含量,因此通過(guò)分析EPS拉曼特征的動(dòng)態(tài)變化,理論上可以對(duì)應(yīng)確認(rèn)細(xì)菌生物被膜的代謝活動(dòng)及其形成過(guò)程階段,表2總結(jié)了部分食源性致病菌生物被膜形成的各階段拉曼特征峰的變化。

TAN等[41]利用拉曼光譜監(jiān)測(cè)了副溶血性弧菌生物被膜的形成,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)48 h后,生物被膜形成致密結(jié)構(gòu),拉曼譜圖對(duì)應(yīng)EPS中的碳水化合物和核酸含量顯著上升,這一EPS拉曼譜圖特征的變化同樣被發(fā)現(xiàn)于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生物被膜的形成過(guò)程[26]。CHEN等[37]對(duì)食源性致病菌生物被膜中EPS利用超聲探針?lè)ㄟM(jìn)行提取,研究了副溶血性弧菌和單增李斯特菌形成的單一和混合物種生物被膜的特征的動(dòng)態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)混合物種生物被膜中EPS的碳水化合物、蛋白質(zhì)、核酸所對(duì)應(yīng)的拉曼峰均有所下降。再通過(guò)苯酚-硫酸法[42]和Lowry法[43]對(duì)碳水化合物和蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行量化,證實(shí)混合物種生物被膜與表面的黏附會(huì)降低,胞外多糖和蛋白質(zhì)的濃度降低。通過(guò)微生物分析與拉曼光譜譜圖特征相結(jié)合,為拉曼光譜對(duì)EPS的定量分析提供了理論依據(jù)。該團(tuán)隊(duì)還研究了副溶血性弧菌在玻璃材料表面形成的生物被膜EPS的化學(xué)成分,首次發(fā)現(xiàn)在副溶血性弧菌生物被膜的形成過(guò)程中類胡蘿卜素起協(xié)助作用[35]。

生物被膜形成過(guò)程中,包括碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等在內(nèi)的代謝產(chǎn)物和生物大分子含量通常是逐漸增加的。因此,在生物被膜初期,大多數(shù)細(xì)菌和EPS化合物的拉曼信號(hào)比較微弱,對(duì)方法的檢測(cè)限要求較高。LIU等[36]報(bào)道了一種快速且新穎的SERS檢測(cè)方法,用于研究金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。通過(guò)使用帶有金納米粒子的便攜式拉曼光譜儀收集結(jié)晶紫染色生物被膜的拉曼光譜,發(fā)現(xiàn)測(cè)量的拉曼峰強(qiáng)度與生物被膜的數(shù)量呈良好的線性關(guān)系。NGUYEN等[44]自制等離子體納米間隙增強(qiáng)了拉曼散射信號(hào),綠膿素檢測(cè)限達(dá)到了10 ng/mL,能夠檢測(cè)銅綠假單胞菌早期生物被膜的形成過(guò)程。

在對(duì)細(xì)胞間群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)過(guò)程的信號(hào)分子檢測(cè)方面,SERS由于具備識(shí)別金屬陽(yáng)離子的高靈敏度特性,也體現(xiàn)出了良好的效率和性能[45-46]。QS是一種細(xì)胞間通信現(xiàn)象,細(xì)菌通過(guò)分泌和感應(yīng)特定的信號(hào)分子來(lái)監(jiān)測(cè)和響應(yīng)自身所處的環(huán)境和種群密度,從而在細(xì)菌種群范圍內(nèi)同步調(diào)節(jié)基因表達(dá)[47]。目前,傳統(tǒng)檢測(cè)生物被膜QS的手段主要是針對(duì)代謝物的同位素標(biāo)記法和熒光法,但兩者都需繁瑣的預(yù)處理步驟。SERS由于具備識(shí)別金屬陽(yáng)離子的高靈敏度特性,體現(xiàn)出了良好的效率和性能。GUO等[48]在2片六角形氮化硼層之間封裝金納米星,開(kāi)發(fā)了一種具有三明治結(jié)構(gòu)的柔性黏滯便箋,該黏滯便箋可以黏貼在細(xì)菌生物被膜上,通過(guò)高靈敏度的SERS成像可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分泌的信號(hào)分子。綠膿素是銅綠假單胞桿菌的一種QS信號(hào)分子,在生物被膜形成過(guò)程中起著重要作用。BODELN等[49]以聚N-異丙基丙烯酰胺修飾的金納米粒子(Au@pNIPAM)、二氧化鈦修飾的金納米粒子(Au@TiO2)、二氧化硅修飾的金納米粒子(Au@SiO2)作為基底,得到綠膿素在550～900 nm段有明顯特征的SERS譜圖,3種基底分別對(duì)應(yīng)檢測(cè)限為10-10、10-9、10-14mol/L。?；呓z氨酸內(nèi)酯類(acyl-homoserine lactones,AHLs)為革蘭氏陰性細(xì)菌QS的一類重要信號(hào)分子,研究發(fā)現(xiàn)AHLs的SERS譜圖主要由酰氨分子譜峰組成,其中酰胺I、酰胺II、酰胺III和酰胺IV的峰分別位于1 648、1 570、1 308、771 cm-1處[50]。

此外,也有研究表明SERS可以實(shí)現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌EPS的定量檢測(cè)[51-52]。然而,生物被膜樣品的拉曼光譜易受到熒光強(qiáng)干擾的影響,所以需要對(duì)激發(fā)光波長(zhǎng)、采集時(shí)間、物鏡放大倍數(shù)、聚焦模式等測(cè)量參數(shù)不斷優(yōu)化。未來(lái)可從拉曼峰強(qiáng)度與面積的角度,進(jìn)一步完善基于拉曼光譜的生物被膜的定量分析。

2.3 生物被膜逆環(huán)境過(guò)程的檢測(cè)

生物被膜作為食品、醫(yī)療等領(lǐng)域的重大威脅之一,通常需要通過(guò)探究生物被膜的抗逆機(jī)理,針對(duì)性地開(kāi)發(fā)有效抑制消殺措施。通常,抑制消殺措施會(huì)以降解DNA、蛋白質(zhì)或改變官能團(tuán)構(gòu)象等方式導(dǎo)致生物被膜EPS化學(xué)成分被破壞,進(jìn)而徹底清除生物被膜。因此,可通過(guò)建立處理?xiàng)l件與生物被膜損傷引起的拉曼光譜變化間的函數(shù)關(guān)系,實(shí)現(xiàn)基于拉曼光譜方法的生物被膜抗逆過(guò)程與機(jī)理分析。

在評(píng)價(jià)抗菌劑有效性方面,拉曼光譜可通過(guò)檢測(cè)生物被膜中與DNA相對(duì)應(yīng)的拉曼譜帶,追蹤抑菌與殺菌作用的機(jī)制[53-54]。HAN等[55]評(píng)估了酸性電解水去除食源性病原體單增李斯特菌和副溶血性弧菌生物被膜的能力,并通過(guò)拉曼光譜中碳水化合物C—O—C鍵以及酪氨酸和苯丙氨酸中芳香環(huán)的變形證明酸性電解水可以引發(fā)EPS被破壞。CHEN等[56]建立了一種高效的藍(lán)光LED光動(dòng)力滅活技術(shù)(photodynamic inactivation,PDI),用光敏劑姜黃素介導(dǎo)PDI根除副溶血性弧菌及其生物被膜,并通過(guò)拉曼光譜觀測(cè)出PDI處理后顯著降低了生物被膜EPS中蛋白質(zhì)、總碳水化合物和eDNA的含量,該結(jié)果同PRABHAWATHI等[57]對(duì)功能化聚己內(nèi)酰胺作用大腸桿菌生物被膜的抗生物被膜活性和生物被膜形成的研究相符。

在評(píng)價(jià)抗生素有效性方面,傳統(tǒng)的細(xì)菌耐藥性檢測(cè)方法通常需要在與不同抗生素孵育期間監(jiān)測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況,待確定目標(biāo)病原體后,還需要額外18～24 h來(lái)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)(antimicrobial susceptibility testing,AST)[58]。LU等[59]利用拉曼光譜對(duì)比分析環(huán)丙沙星、紅霉素等抗生素抑制空腸彎曲菌生物被膜后波峰的變化,縮短了檢測(cè)時(shí)間,并通過(guò)交叉驗(yàn)證評(píng)價(jià)建立了活細(xì)胞存活數(shù)的PLSR預(yù)測(cè)模型。JUNG等[60]應(yīng)用拉曼光譜的基于判別模型的PCA和SVM能夠以100%的準(zhǔn)確率特異性分離抗生素治療生物被膜后產(chǎn)生的光譜。對(duì)于敏感菌株,由于藥物作用,細(xì)菌代謝過(guò)程受到干擾,細(xì)菌停止生長(zhǎng);對(duì)于耐藥菌株,與未治療的對(duì)照組相比,添加藥物可能沒(méi)有效果,或者由于誘導(dǎo)的抗生素耐藥性,可能導(dǎo)致細(xì)菌生化特征變化。通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析,可以從拉曼光譜中識(shí)別藥物引起的生化變化,快速準(zhǔn)確獲得AST結(jié)果,此過(guò)程進(jìn)行2～3 h即可。此外,通過(guò)分類模型或計(jì)算光譜標(biāo)記帶的比率對(duì)區(qū)可快速分敏感性菌株和耐藥性菌株。例如,NAKAR等[61]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌耐藥菌株具有較高的核酸與蛋白質(zhì)比率,結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)模型準(zhǔn)確區(qū)分耐藥菌株與敏感菌株。

3 拉曼光譜結(jié)合其他技術(shù)檢測(cè)生物被膜

為了更準(zhǔn)確、穩(wěn)定地獲得生物被膜組成、結(jié)構(gòu)和功能信息,還常采用拉曼光譜結(jié)合2種或多種不同的樣品制備、檢測(cè)、分析技術(shù),對(duì)食源性致病菌生物被膜進(jìn)行探究。

3.1 結(jié)合光譜技術(shù)

紅外光譜和拉曼光譜作為2種互補(bǔ)的分子振動(dòng)技術(shù),結(jié)合后可共同描述生物被膜的固有化學(xué)信息[10, 62]。紅外光譜可檢測(cè)到改變分子永久偶極矩的振動(dòng),拉曼光譜則可在光譜中看到改變極化率的振動(dòng),紅外光譜與拉曼光譜所涉及的分子振動(dòng)分別通過(guò)光的吸收或非彈性散射激發(fā)。WANG等[31]通過(guò)將傅里葉變換衰減全反射紅外光譜(attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy,ATR-FTIR)和拉曼光譜結(jié)合對(duì)不銹鋼表面培養(yǎng)的沙門(mén)氏菌生物被膜進(jìn)行分析,揭示了沙門(mén)氏菌生物被膜和相應(yīng)的浮游細(xì)胞之間完全不同的化學(xué)成分,以及沙門(mén)氏菌在不同營(yíng)養(yǎng)條件下生物被膜形成之間的一些重要差異。SHARMA等[33]從FTIR技術(shù)和拉曼光譜技術(shù)獲得了阪崎克羅諾桿菌全細(xì)胞成分光譜,比較了阪崎克羅諾桿菌的生物被膜細(xì)胞與浮游細(xì)胞的成分差異。

3.2 結(jié)合顯微鏡技術(shù)

原子力顯微鏡(atomic force microscope,AFM)和拉曼光譜相結(jié)合,不獲得了超高分辨率,還避免了弱拉曼光譜信號(hào)所帶來(lái)的困擾。AFM配備導(dǎo)電金屬(如鍍金或鍍銀納米顆粒)的針尖,使其具有SERS活性。PRADHAN等[63]使用拉曼光譜揭示了微生物細(xì)胞和EPS的不同化學(xué)成分,而AFM圖像清晰顯示了EPS的分泌和包裹在EPS基質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞,兩者相結(jié)合提供了生物被膜的較為完整的成分結(jié)構(gòu)信息。NIELSEN等[64]研究精油異丁香酚涂層是否可避免細(xì)菌生物被膜通過(guò)表面轉(zhuǎn)移的問(wèn)題,并通過(guò)拉曼光譜、AFM相結(jié)合,可視化了金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌在不銹鋼和聚乙烯表面的定殖。由于拉曼光譜檢測(cè)設(shè)備穩(wěn)定可靠,標(biāo)準(zhǔn)和模塊化部件數(shù)量有限,因此拉曼光譜和AFM的結(jié)合相對(duì)較易。

同時(shí),CLSM可通過(guò)熒光染色、圖像分析等研究手段量化細(xì)菌生物被膜的結(jié)構(gòu)特征,如:生物被膜厚度、粗糙度、孔隙度、體積覆蓋率、分形維數(shù)等。但有研究表面EPS中某些分子的熒光染色特異性較低,未能被CLSM靈敏檢測(cè)[65-66]。結(jié)合拉曼光譜的分子信息后,可互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物被膜基質(zhì)的全面了解。例如,WAGNER等[67]將拉曼光譜技術(shù)與CLSM技術(shù)結(jié)合,同時(shí)獲得了生物被膜基質(zhì)內(nèi)不同物質(zhì)的化學(xué)信息、空間結(jié)構(gòu)和深度分布信息。

3.3 結(jié)合篩選標(biāo)記技術(shù)

SERS與顯微鏡、穩(wěn)定同位素標(biāo)記、微流控分析等其他工具的靈活集成,也已取得了一定進(jìn)展。利用由同位素標(biāo)記樣品與未標(biāo)記樣品的拉曼光譜的差譜分析研究標(biāo)記位置的分子結(jié)構(gòu)和相互作用的方法,它可以補(bǔ)充其他分子生物學(xué)技術(shù),用于在單細(xì)胞水平上原位研究細(xì)菌在生物被膜中的代謝過(guò)程[68]。例如,SERS與15N穩(wěn)定同位素探針相結(jié)合,可以在單細(xì)胞水平上區(qū)分微生物聚集體中的氮轉(zhuǎn)化,這為探索生物脫氮過(guò)程中的硝化、反硝化和厭氧氨氧化提供了一種方法[69]。MUHAMADALI等[70]首次將拉曼光譜和FTIR作為代謝指紋分析方法與穩(wěn)定同位素相結(jié)合,對(duì)大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行定量和區(qū)分,不同同位素?fù)饺牒蟮奶囟ü庾V位移產(chǎn)生了獨(dú)特的聚類模式,這與介質(zhì)中同位素標(biāo)記含量的比率直接相關(guān)。

此外,在傳統(tǒng)生物被膜形成過(guò)程研究中,通常局限于低剪切力和靜態(tài)培養(yǎng)的環(huán)境條件,無(wú)法滿足模擬真實(shí)動(dòng)態(tài)環(huán)境的需要。對(duì)此,研究者還可結(jié)合高可重復(fù)性和高通量的微流控技術(shù),精確控制營(yíng)養(yǎng)和流動(dòng)條件,實(shí)現(xiàn)研究生物被膜在不同剪切力與動(dòng)態(tài)營(yíng)養(yǎng)作用下的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞信號(hào)變化,且具有的特點(diǎn)。FENG等[71]通過(guò)在微流控平臺(tái)上培養(yǎng)銅綠假單胞菌生物被膜,并使用CRM以無(wú)損和連續(xù)的方式對(duì)不同發(fā)育階段的銅綠假單胞菌生物被膜原位表征。同時(shí),微流控平臺(tái)產(chǎn)生離散或連續(xù)的藥物梯度,再與拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合,也可大大縮短藥敏檢測(cè)時(shí)間。HUANG等[72]結(jié)合微流控技術(shù)、SERS構(gòu)建了AST模型,分別對(duì)敏感、耐藥的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行測(cè)試,得到的AST結(jié)果與用肉湯稀釋法培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)一致,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程僅需2 h。

4 總結(jié)與展望

拉曼光譜是一種快速、高效的檢測(cè)技術(shù),其應(yīng)用于食源性致病菌生物被膜的研究表明:拉曼光譜的特征峰可用于表征生物被膜基質(zhì)中的代表性化學(xué)物質(zhì),其特征峰的變化可用于識(shí)別生物被膜的形成階段。同時(shí),EPS、QS信號(hào)分子等拉曼譜帶的改變,還可反映生物被膜在嚴(yán)苛環(huán)境中的物質(zhì)變化與生存狀態(tài),并用于推斷生物被膜的抗逆機(jī)理。在拉曼光譜技術(shù)的基礎(chǔ)上,還可通過(guò)融入互補(bǔ)技術(shù),獲得更準(zhǔn)確、穩(wěn)定、全面的生物被膜信息。隨著拉曼儀器的小型化、自動(dòng)化、高通量化,及機(jī)器學(xué)習(xí)分析技術(shù)的成熟,將進(jìn)一步促進(jìn)該技術(shù)在細(xì)菌生物被膜中的應(yīng)用,但目前仍存在以下突出問(wèn)題:

(1)現(xiàn)有研究多基于實(shí)驗(yàn)室理想條件,尚缺少針對(duì)真實(shí)復(fù)雜食品場(chǎng)景的標(biāo)準(zhǔn)化樣品取樣與拉曼光譜預(yù)處理方法,以避免非目標(biāo)待測(cè)物質(zhì)的干擾;

(2)在多種微生物共存的生物被膜中,其基質(zhì)的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)也具有高度異質(zhì)性,可能造成拉曼光譜特征峰差異;

(3)部分拉曼特征峰與對(duì)應(yīng)的物質(zhì)結(jié)構(gòu)(官能團(tuán))關(guān)系尚不明確,且缺少可供參考的標(biāo)準(zhǔn)拉曼峰譜比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù);

(4)盡管拉曼光譜方法已初步實(shí)現(xiàn)了生物被膜的快速檢測(cè),但仍未有合適模型可用于定量預(yù)測(cè)評(píng)估其群體動(dòng)態(tài)變化和可能造成的健康風(fēng)險(xiǎn)。

綜上,未來(lái)可從以下方面開(kāi)展深入探究:

其一,優(yōu)化拉曼光譜待測(cè)樣品的獲取和預(yù)處理,通過(guò)結(jié)合微流控技術(shù),實(shí)現(xiàn)待測(cè)生物被膜的高通量分選與收集,降低雜質(zhì)干擾;

其二,結(jié)合生物信息學(xué)和分類模型,對(duì)不同亞型的生物被膜基質(zhì)光譜差異進(jìn)行比較探究,實(shí)現(xiàn)對(duì)高異質(zhì)生物被膜群體的識(shí)別與分析;

其三,通過(guò)大量積累拉曼光譜、SERS檢測(cè)未知物質(zhì)的特征譜圖,完善食源性致病菌的拉曼光譜數(shù)據(jù)庫(kù),構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)峰譜比對(duì)庫(kù);

其四,引入預(yù)測(cè)微生物學(xué)方法,建立基于拉曼光譜的生物被膜動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)模型,為進(jìn)一步考慮生物被膜的微生物定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ)。