覆膜鐵罐裝食品中聚對苯二甲酸乙二醇酯及聚對苯二甲酸丁二酯環(huán)狀低聚物的測定研究

吳剛,潘家杰,徐彤彤,路秋勉,馮佳寧,孟鎮(zhèn),仇凱*,郭新光

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015)2(全國食品直接接觸材料及制品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會金屬制品分技術(shù)委員會,北京,100015)3(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司,浙江 杭州,310009)4(河北工程大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,河北 邯鄲,056009)

覆膜鐵的表面聚酯薄膜材料主要有聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)、聚對苯二甲酸丁二醇酯(polybutylene terephthalate,PBT)、聚丙烯(polypropylene,PP)等,其中以PET最為常見、綜合性能最優(yōu)、應(yīng)用最為廣泛[9-14]。這些聚酯材料在由單體發(fā)生縮聚反應(yīng)合成聚合物的生產(chǎn)過程中,由于聚合的不完全或發(fā)生熱降解或水解等作用均可能產(chǎn)生低聚物[15-16]。這些低聚物的種類眾多、分子質(zhì)量大小不一,主要分為線性和環(huán)狀結(jié)構(gòu),且具有不同的毒理學(xué)特征[17]。目前國內(nèi)外均無PET和PBT環(huán)狀低聚物毒理學(xué)的研究報道,GB 2762—2022 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中也無環(huán)狀聚酯低聚物的限量要求,但根據(jù)毒理學(xué)關(guān)注閾值(threshold of toxicological concern,TTC)決策樹方法可將其歸為Cramer Ⅲ類結(jié)構(gòu)[18],大量攝入也可能存在健康風(fēng)險。

盡管國內(nèi)外對低聚物的遷移及相關(guān)問題進(jìn)行了大量研究[19-22],但是還未有覆膜鐵實(shí)罐中低聚物含量檢測的相關(guān)報道。食品中的低聚物的檢測較為復(fù)雜,不同的食品基質(zhì)對低聚物檢測的影響未知,因此迫切需要探索一種簡單易行的樣品前處理方法并確定基質(zhì)效應(yīng)的影響,以對覆膜鐵實(shí)罐中的低聚物進(jìn)行檢測分析。本研究采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)對國內(nèi)外市場上的31種覆膜鐵罐裝食品中的PET及PBT環(huán)狀低聚物進(jìn)行檢測,并對其建立了樣品前處理方法,以便評估目前市面上覆膜鐵罐裝食品的安全性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑:PET環(huán)狀二聚體標(biāo)準(zhǔn)品、PET環(huán)狀三聚體標(biāo)準(zhǔn)品、PET環(huán)狀四聚體標(biāo)準(zhǔn)品、PET環(huán)狀五聚體標(biāo)準(zhǔn)品,北京匯科同創(chuàng)科學(xué)儀器有限公司;PBT環(huán)狀二聚體標(biāo)準(zhǔn)品、PBT環(huán)狀三聚體標(biāo)準(zhǔn)品,北京百靈威科技有限公司;乙腈、甲醇,均為質(zhì)譜純,上?；裟犴f爾貿(mào)易有限公司;六氟異丙醇(色譜純),上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;二氯甲烷、正己烷、無水乙醇,均為色譜純,德國Meck公司;甲酸、甲酸銨,質(zhì)譜純,上?；裟犴f爾貿(mào)易有限公司;2,2,2-三氟乙醇(色譜純),西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司;無水MgSO4、NaCl,均為色譜純,中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司;PSA、Al2O3,均為色譜純,上海安譜公司。

儀器:Agilent 1290 UPLC-Agilent 6546 UHD QTOF,美國安捷倫儀器公司;KQ-500DE超聲波清洗儀,江蘇昆山超聲波儀器有限公司;TG18K高速離心機(jī),上海舜制儀器制造有限公司;VORTEX05渦旋混勻器,上海達(dá)姆實(shí)業(yè)有限公司;AB204-N分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;UGC-45C圓形水浴氮吹儀,北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司;QSE-12D固相萃取儀,上海比朗儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品

共收集了31種覆膜鐵罐裝食品,包括水果罐頭、肉類罐頭、飲料和啤酒4種食品類型。其中水果罐頭8種,包括黃桃罐頭4種、橘子罐頭3種、山楂罐頭1種,國內(nèi)相關(guān)生產(chǎn)企業(yè);肉類罐頭8種,包括畜禽肉罐頭和水產(chǎn)類罐頭,國內(nèi)相關(guān)企業(yè);飲料樣品共8種,包括國內(nèi)3種水果汁飲料(桃汁、芒果汁、桔子汁),國內(nèi)相關(guān)生產(chǎn)企業(yè);國外5種水果汁飲料(菠蘿汁、蘋果汁、百香果汁、獼猴桃汁、椰果汁),國內(nèi)海關(guān);啤酒7種(其中國內(nèi)啤酒4種,國內(nèi)啤酒企業(yè)提供的精釀啤酒;國外精釀啤酒3種,日本)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別準(zhǔn)確稱取各低聚物標(biāo)準(zhǔn)品10 mg至10 mL容量瓶中,用六氟異丙醇(hexafluoroisopropanol,HFIP)溶解并定容至刻度線,得到1 000 mg/L的6種低聚物標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別從6種低聚物標(biāo)準(zhǔn)儲備液中吸取0.1 mL至10 mL容量瓶中,然后用乙腈定容至刻度線,得到10 mg/L的6種低聚物混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制完成后在20 ℃下儲存,最長可以穩(wěn)定存放4個月。標(biāo)準(zhǔn)工作液配制完成后在4 ℃下儲存,每隔2周制備1份新的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。由于低聚物性質(zhì)不太穩(wěn)定,標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液均貯存在棕色玻璃瓶中,以防止光誘導(dǎo)降解或異構(gòu)體轉(zhuǎn)化。

目前，南海航海保障中心已啟動海區(qū)MF-DSC電路改造工作，計(jì)劃于2018年底完成并正式啟動廣州通信中心統(tǒng)一值守海區(qū)MF-DSC電路工作。

1.4 樣品前處理方法

將樣品內(nèi)容物全部均質(zhì),然后稱取均質(zhì)樣品2.0 g,置于50 mL離心管中,加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。加入8 mL乙腈(肉類罐頭加入10 mL乙腈和10 mL正己烷),將混合物渦旋振蕩5 min,然后超聲處理20 min,后于4 000×g離心10 min,離心結(jié)束后,將離心管取出靜置10 min,吸取上清液(肉類罐頭吸取下層溶液)在常溫下氮吹至干,再用1 mL乙腈復(fù)溶,然后過PTFE濾膜,使用UPLC-QTOF-MS檢測分析。

1.5 儀器條件與參數(shù)設(shè)置

色譜條件:采用了UPLC系統(tǒng)與四極桿飛行時間(time of flight,TOF)質(zhì)譜儀耦合。分析柱為ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 2.1 mm×50 mm,1.8 μm,溫度控制在40 ℃。流動相(A)為含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的水,(B)為含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸銨的乙腈,流速為300 μL/min,梯度程序設(shè)置如下:0 min(20% B)、3 min(50% B)、15 min(100% B)。設(shè)置3 min的平衡時間使流動相達(dá)到初始條件。進(jìn)樣量設(shè)置為5 μL。

質(zhì)譜條件:質(zhì)譜選用正電離模式,離子源為帶有安捷倫噴射流技術(shù)的Jet Stream ESI源。毛細(xì)管電壓3 500 V,離子源溫度325 ℃,鞘氣溫度350 ℃,流速11 L/min,霧化器壓力35 psi,干燥氣流速6 L/min,噴嘴電壓500 V,分裂壓力120 V,錐口壓力65 V,Oct 1 RF Vpp為750 V。TOF-MS的采集模式為全掃描MS,在100～1 700 Da的m/z范圍內(nèi)采集數(shù)據(jù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019處理試驗(yàn)數(shù)據(jù),采用Origin 2019進(jìn)行圖表處理與制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的選擇與優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別考察了乙腈、甲醇和二氯甲烷對樣品中PET和PBT環(huán)狀低聚物的提取效果,同類樣品平行測定3次,結(jié)果如圖1所示,使用甲醇和二氯甲烷作為提取溶劑時,6種低聚物的回收率均較低,尤其是PET環(huán)狀二聚體和PBT環(huán)狀二聚體的回收率低于80%,當(dāng)使用乙腈作為提取溶劑時,6種目標(biāo)物的回收率較好,均在80%～120%,因此,本實(shí)驗(yàn)采用乙腈作為PET和PBT環(huán)狀低聚物的提取溶劑。

圖1 乙腈、甲醇和二氯甲烷三種提取溶劑對目標(biāo)物回收率的影響Fig.1 Effect of three extraction solvents of acetonitrile, methanol and dichloromethane on the recovery rate of the target product

2.1.2 其他條件的優(yōu)化

在實(shí)驗(yàn)過程中,發(fā)現(xiàn)將樣品僅僅經(jīng)過渦旋處理后,并不能達(dá)到很好的提取效果,因此嘗試了在渦旋步驟后對樣品再進(jìn)行超聲處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)將樣品超聲處理20 min后可以取得相對更好的提取效果。對于氮吹步驟后所使用的復(fù)溶試劑也進(jìn)行了考察,分別使用了乙腈、甲醇和含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸銨的乙腈溶液3種試劑進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用乙腈作為復(fù)溶試劑時,所得的溶解效果最好,因此本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為氮吹處理后的復(fù)溶劑。另外,對于肉類食品,由于其內(nèi)容物基質(zhì)比較復(fù)雜,含有油脂,因此需要選擇合適的有機(jī)試劑對肉類樣品進(jìn)行脫脂處理,經(jīng)過實(shí)驗(yàn)比對以及對樣品和目標(biāo)物的綜合考慮,實(shí)驗(yàn)最終決定使用正己烷作為脫脂試劑。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相的選擇與優(yōu)化

將甲醇和乙腈分別作為流動相和有機(jī)相,對相應(yīng)條件下低聚物的色譜行為進(jìn)行比較,如圖2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)以甲醇作為有機(jī)相時,部分目標(biāo)物的響應(yīng)值較低(圖2-a),而使用乙腈為有機(jī)相時,6種目標(biāo)物的相應(yīng)值均較好,分離效果也很好(圖2-b)。根據(jù)文獻(xiàn)[23],在流動相中添加甲酸-甲酸銨緩沖溶液可以提高PET及PBT環(huán)狀低聚物的質(zhì)譜響應(yīng),因此本研究分別考察加入不同濃度甲酸和甲酸銨對目標(biāo)物峰面積的影響,結(jié)果表明,隨著甲酸和甲酸銨濃度的增加,PET及PBT環(huán)狀低聚物的峰面積先是顯著增加然后又開始下降,原因可能是隨著加入甲酸濃度的增加,流動相的pH值降低,當(dāng)流動相的pH值過低時,PET及PBT環(huán)狀低聚物在溶液中傾向于以分子型的狀態(tài)存在,不利于[M-H]ˉ的形成,因此目標(biāo)物的峰面積在甲酸濃度過高時表現(xiàn)出下降趨勢。另外,PET及PBT環(huán)狀低聚物的峰面積隨著添加甲酸銨濃度的增加表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,可能是因?yàn)橄蛄鲃酉嘀屑尤脘@鹽可以提供NH4+,這有利于PET及PBT環(huán)狀低聚物生成[M+NH4]+離子,但是,如果甲酸銨濃度過大時,分子間會產(chǎn)生競爭從而抑制電離,降低目標(biāo)物的離子化效率。因此,綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)最終選擇向流動相中加入體積分?jǐn)?shù)0.10%甲酸和5 mmol/L甲酸銨進(jìn)行目標(biāo)物的檢測分析。

a-水-甲醇;b-水-乙腈

2.2.2 其他色譜條件的優(yōu)化

由于較高的進(jìn)樣量會顯著影響色譜峰的形狀,因此將進(jìn)樣量設(shè)置為5 μL。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),目標(biāo)物在有機(jī)相達(dá)到50%以上時將開始被洗脫,因此,設(shè)置有機(jī)相在3 min內(nèi)上升到50%,然后在10 min內(nèi),目標(biāo)物逐步被洗脫,為了能夠得到更加穩(wěn)定的效果,將洗脫時間設(shè)置為15 min。并且為了達(dá)到樣品的高通量檢測要求,設(shè)置3 min的平衡時間使流動相達(dá)到初始條件。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

在樣品中除被分析物以外的組分稱為基質(zhì),基質(zhì)會干擾目標(biāo)物的分析過程,導(dǎo)致分析結(jié)果缺乏準(zhǔn)確性,這就稱為基質(zhì)效應(yīng)。本研究采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法來評估基質(zhì)效應(yīng),通過比較標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和樣品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來計(jì)算基質(zhì)效應(yīng),計(jì)算如公式(1)所示。當(dāng)-50%50%時,表明該化合物的基質(zhì)效應(yīng)明顯,不可被忽略。

C/%=(1-Sm/Ss)×100

(1)

式中:Ss,用有機(jī)溶劑配成含有系列濃度目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;Sm,用食品樣品在提取前加入與Ss相同系列濃度目標(biāo)物,再經(jīng)提取步驟后所制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)可以看出,4種罐裝食品中僅肉類罐頭中低聚物的基質(zhì)效應(yīng)會在50%以上,說明6種環(huán)狀低聚物在水果罐頭、罐裝飲料及罐裝啤酒中的基質(zhì)效應(yīng)可以忽略。而在肉類罐頭中,僅PET五聚體的基質(zhì)效應(yīng)在50%以下,其余低聚物的基質(zhì)效應(yīng)均比較明顯,因此,為了得到更為準(zhǔn)確的測試結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一采用基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線對肉類罐頭食品樣品進(jìn)行定量分析。即采用國內(nèi)同一廠家生產(chǎn)的非覆膜鐵包裝的、同一批次的同一類型肉類罐頭食品作為空白基質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3 四種食品類型中被測分析物的基質(zhì)效應(yīng)Fig.3 The matrix effect of the tested analytes in the four food types

2.4 線性關(guān)系及檢出限、定量限

向食品樣品基質(zhì)中分別加入20、50、100、200、500、1 000 μg/L 6種不同質(zhì)量濃度的低聚物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按照2.1節(jié)的前處理方法進(jìn)行處理后使用UPLC-QTOF-MS分析,每個濃度平行試驗(yàn)3次。然后以目標(biāo)物的峰面積(y)為縱坐標(biāo),相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果樣品濃度高出線性范圍,則將溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后再進(jìn)行測定。結(jié)果表明,6種低聚物在20～1 000 μg/L線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.99。檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ)的估計(jì)基于信噪比(signal to noise ratio,SNR),LOD=3×SNR,LOQ=10×SNR,得出目標(biāo)物檢出限為0.11～44.12 μg/L,定量限為0.36～147.06 μg/L,結(jié)果詳見表1,表明該方法具有較好的靈敏度。

表1 六種PET及PBT低聚物的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢測限和定量限Table 1 Linear range, standard curve, correlation coefficient (R2), detection limit and quantification limit of six PET and PBT oligomers

2.5 加標(biāo)回收率和精密度

采用空白樣品加標(biāo)方法進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)。分別對水果、飲料、啤酒和肉類進(jìn)行3個水平(50、100、200 μg/L)加標(biāo),每個濃度平行測定6次,計(jì)算方法平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD),所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。從結(jié)果可以看出,各類食品中低聚物的加標(biāo)回收率在80.80%～102.71%,RSD在0.37%～9.26%,表明該實(shí)驗(yàn)的回收率和穩(wěn)定性良好。

表2 水果、肉類、飲料和啤酒四種食品類型中目標(biāo)物的平均加標(biāo)回收率和精密度Table 2 The average recovery rate and precision of target substances in the four food types of fruits, meat, beverages, and beer

2.6 真實(shí)樣品檢測

從國內(nèi)外市場上共收集了31種覆膜鐵罐裝食品,包括水果罐頭、肉類罐頭、飲料和啤酒4種食品類型,其中水果罐頭8種、飲料8種、啤酒7種、肉類罐頭8種,采用優(yōu)化后的前處理方法對這31種食品樣品分別進(jìn)行檢測,檢測結(jié)果見表3。在4種食品類型中,PET環(huán)狀三聚體的含量均是最多的,PET環(huán)狀三聚體的平均含量從水果罐頭中17.14 μg/L到肉類罐頭中1 155.22 μg/L,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他種類的低聚物。

表3 四種食品類型中6種低聚物的含量 單位:μg/L

本課題組此前已采用不同食品模擬物對覆膜鐵空罐中的PET及PBT環(huán)狀低聚物進(jìn)行了檢測[22],詳見表4。采用食品模擬物對覆膜鐵空罐進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)時,PET環(huán)狀三聚體的遷移量也是最多的,和本文覆膜鐵罐裝食品中的檢測結(jié)果一致。

表4 覆膜鐵樣品中的環(huán)狀PET和PBT低聚物的定量結(jié)果 單位:μg/L

在實(shí)驗(yàn)所測試的4種食品類型中,低聚物的含量大小順序?yàn)?肉類>飲料>水果>啤酒。分析原因可能是肉類罐頭在加工過程中,殺菌溫度約為121 ℃,溫度較高,高溫促使聚合物發(fā)生降解,從而使得食品中的PET和PBT環(huán)狀低聚物含量增加。水果罐頭和飲料的殺菌溫度相對于肉類罐頭較低,而啤酒一般為巴氏殺菌,殺菌溫度約為65 ℃,因此,啤酒中的低聚物含量最低。另外,啤酒的pH值相較于其他3種食品類型也較高,這使得其對內(nèi)壁覆膜的腐蝕相對較輕,低聚物的遷出量即隨之減少。

3 結(jié)論與討論

本研究通過優(yōu)化提取溶劑及液相條件,建立了液液萃取-超高效液相色譜-四極桿飛行時間-質(zhì)譜法對四類覆膜鐵罐裝食品中6種PET及PBT環(huán)狀低聚物的測定方法,并對該方法的準(zhǔn)確度、精密度及提取效果進(jìn)行充分驗(yàn)證及評價,又將該方法成功應(yīng)用于4種覆膜鐵罐裝食品類型的實(shí)際樣品測定過程。該方法成本較低、操作簡單、加標(biāo)回收率高、重復(fù)性良好,能夠?yàn)楦材よF罐裝食品中PET及PBT低聚物的檢測提供可靠的技術(shù)支持。