“金花菌”(Aspergillus chevalieri)發(fā)酵牡丹花瓣過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)及酚酸類(lèi)物質(zhì)變化

李學(xué)震,劉光鵬,馬艷蕊,姚旖旎,孟園,趙巖,和法濤

(中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社 濟(jì)南果品研究所,山東 濟(jì)南,250220)

牡丹花(PaeoniasuffruticosaAndr.)作為食用性花卉深受大眾的喜愛(ài),尤其在女性群體中還可用作傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療月經(jīng)不調(diào)和腹痛[1]?，F(xiàn)代研究表明,牡丹花瓣中富含多酚和黃酮類(lèi)物質(zhì),這些物質(zhì)與清除自由基[2]、抑制癌細(xì)胞[3]、消炎[4]和降低血糖[5]等活性密切相關(guān)。酚酸類(lèi)物質(zhì)在植物中的合成途徑主要包括磷酸戊糖途徑、莽草酸途徑和苯丙素途徑,它們通常帶有一個(gè)或多個(gè)芳香環(huán),且至少有一個(gè)羥基基團(tuán)[6]。黃酮類(lèi)物質(zhì)是通過(guò)至少2個(gè)碳原子連接多個(gè)酚羥基苯環(huán)結(jié)構(gòu),它們是牡丹花瓣中主要的天然色素,特別是花青素能應(yīng)用到食品中[7]。牡丹花的香氣主要由醛類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)和烷烴類(lèi)構(gòu)成,還有少數(shù)酮類(lèi)、酸類(lèi)、烯烴類(lèi)物質(zhì),這些香氣成分中醇類(lèi)物質(zhì)對(duì)牡丹香氣有較大貢獻(xiàn)[8-9]。

茯磚茶在我國(guó)有400多年的歷史,“金花菌”是從其中分離出來(lái)的一類(lèi)有益菌,它也是茯磚茶漫長(zhǎng)發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌[10]。有研究表明,在茯磚茶發(fā)酵過(guò)程中“金花菌”能顯著降低碳水化合物、氨基酸、有機(jī)酸、核苷等化合物的含量,增加有機(jī)酸類(lèi)化合物含量,同時(shí)提供木香、花香、冬青油香、蘑菇香和果香[11-12]。目前,“金花菌”的研究大多集中在茯磚茶發(fā)酵、菌株胞外活性物質(zhì)鑒定和菌種分類(lèi)學(xué)的研究上[13]。因此,“金花菌”在花茶發(fā)酵、酒類(lèi)、醋類(lèi)、調(diào)味品的釀造與功能食品的開(kāi)發(fā)方面還有待進(jìn)一步研究。在之前的研究中,我們?cè)谲虼u茶中分離出“金花菌”,該菌株能在牡丹花瓣上生長(zhǎng),并能提高牡丹花瓣多酚、黃酮的提取得率,并賦予花瓣“金花菌”的清香。因此,我們進(jìn)一步研究該菌株發(fā)酵牡丹花瓣過(guò)程中酚類(lèi)物質(zhì)和香氣的變化規(guī)律,為牡丹花瓣的加工和品質(zhì)控制提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

“金花菌”(Aspergilluschevalieri)分離自茯磚茶,保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC),保藏號(hào):CGMCCNo.23051;牡丹花(干燥),山東省悅?cè)甾r(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司;馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose broth,PDB)培養(yǎng)基,北京索萊寶生物科技有限公司;甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純,上海麥克林生化科技有限公司;NaCl(分析純),天津大茂化學(xué)試劑廠;沒(méi)食子酸、兒茶素、阿魏酸等分析標(biāo)準(zhǔn)品,上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPL-250型氣相離子遷移色譜儀,德國(guó)G.A.S.公司;Thermo Vanquish UHPLC型高效液相色譜儀、Q-Exactive HF型高分辨質(zhì)譜,賽默飛世爾科技有限公司;ME-104型分析天平,梅特勒托利多儀器有限公司;BSC-150型恒溫培養(yǎng)箱、YXQ-LS-100A型立式壓力蒸汽滅菌器,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;ZWYR-2112B型恒溫調(diào)速搖床柜,上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 “金花菌”種子液的制備

取保藏于-80 ℃冰箱的“金花菌”液體種子,接入PDB培養(yǎng)基中活化5～7 d,培養(yǎng)溫度28 ℃,搖床轉(zhuǎn)速180 r/min,待菌絲布滿搖瓶中,根據(jù)GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》,得到菌落數(shù)約為1.8×109CFU/mL的種子液。

1.3.2 “金花菌”發(fā)酵牡丹花瓣的制備

取20 g牡丹花瓣于三角瓶中,置于滅菌鍋中100 ℃滅菌10 min,加入16 mL“金花菌”種子液,發(fā)酵溫度28 ℃,分別設(shè)置A組(未發(fā)酵)、B組(發(fā)酵3 d)、C組(發(fā)酵5d)、D組(發(fā)酵7 d)、E組(發(fā)酵9 d)、F組(發(fā)酵11 d)(每組設(shè)置3個(gè)平行)。發(fā)酵好的牡丹花瓣放入50 ℃干燥箱內(nèi)烘干,研磨過(guò)60目篩,置于干燥器內(nèi)備用。

1.3.3 GC-IMS檢測(cè)揮發(fā)性成分

參考劉強(qiáng)等[14]的方法并稍作修改。分別稱(chēng)取0.5 g各組別花瓣粉末于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中,加入1 mL飽和NaCl溶液,每組設(shè)置3個(gè)平行,以500 r/min的轉(zhuǎn)速,在60 ℃條件下孵育15 min后開(kāi)始進(jìn)樣。

GC-IMS條件:MXT-5氣相色譜柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm),IMS溫度45 ℃,色譜柱溫度60 ℃,進(jìn)樣針溫度85 ℃,載氣/漂移氣N2(純度99.999%),分析時(shí)間20 min,進(jìn)樣體積500 μL。

氣相色譜條件:0～2 min,漂移氣150 mL/min,載氣2 mL/min;2～10 min,漂移氣150 mL/min,載氣2～10 mL/min;10～20 min,漂移氣150 mL/min,載氣10～100 mL/min。

1.3.4 HPLC-MS酚類(lèi)物質(zhì)定性和定量檢測(cè)

參考GARCIA等[15]的方法并稍作修改。分別稱(chēng)取0.1 g各組別花瓣粉末加入4 mL 70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶液超聲波提取10 min,提取2次,1 mL上清液過(guò)0.22 μm濾膜裝入進(jìn)樣瓶中,每組設(shè)置3個(gè)平行。色譜條件:色譜柱為Sigma HPLC Column色譜柱(500 mm×3.0 mm×2.7 μm),柱溫30 ℃,流速0.3 mL/min,0.1%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇水為流動(dòng)相A,乙腈為流動(dòng)相B,進(jìn)樣量10 μL。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

GC-IMS儀器中配備的Vocal軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)查看、定性和圖譜分析,使用軟件內(nèi)置的IMS數(shù)據(jù)庫(kù)和Hanon數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物質(zhì)定性分析;Gallery插件、Reporter插件和Dynamic PCA插件分別用于指紋圖譜的繪制、圖譜差異對(duì)比和主成分分析(principal component analysis,PCA)。SPSS 22.0軟件用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹花瓣發(fā)酵前后揮發(fā)性成分定性分析

圖1是不同發(fā)酵時(shí)間的牡丹花瓣GC-IMS二維圖譜,分離的每個(gè)點(diǎn)代表一種物質(zhì)[16]。表1中顯示了通過(guò)GC-IMS技術(shù)在不同發(fā)酵時(shí)間的牡丹花瓣中共檢測(cè)出51種揮發(fā)性成分,定性檢出33種,其中包括醛類(lèi)9種、醇類(lèi)8種、萜烯類(lèi)6種、酸類(lèi)4種、酮類(lèi)3種、吡嗪類(lèi)2種、酯類(lèi)1種。3-辛醇、2-呋喃甲醇、2-甲基-1-丁醇、順-3-己烯醇(葉醇)、己醛、α-蒎烯等物質(zhì)在牡丹花香氣檢測(cè)的文章中鮮有報(bào)道[8-9]。

a-未發(fā)酵;b-發(fā)酵3 d;c-發(fā)酵5 d;d-發(fā)酵7 d;e-發(fā)酵9 d;f-發(fā)酵11 d

2.1.1 牡丹花發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)差異性分析

利用Vocal軟件內(nèi)置的Reporter插件制作不同發(fā)酵時(shí)間牡丹花瓣樣品中揮發(fā)性物質(zhì)差異圖譜(經(jīng)過(guò)歸一化處理)。如圖2所示,選取未發(fā)酵的牡丹花瓣圖譜作為參比,若二者所含揮發(fā)性物質(zhì)相似,扣除背景色后顯示為白色,若呈現(xiàn)藍(lán)色則代表該物質(zhì)的濃度低于參比,若呈現(xiàn)紅色則代表該物質(zhì)濃度高于參比[17]。圖2中可以看到發(fā)酵牡丹花瓣中出現(xiàn)了紅色斑點(diǎn)(圖2-a),隨著發(fā)酵時(shí)間的遷移,紅色斑點(diǎn)逐漸增多(圖2-c～圖2-f),這表明發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了揮發(fā)性物質(zhì)并與發(fā)酵時(shí)間密切相關(guān)。

a-未發(fā)酵;b-發(fā)酵3 d;c-發(fā)酵5 d;d-發(fā)酵7 d;e-發(fā)酵9 d;f-發(fā)酵11 d

2.1.2 牡丹花發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)變化規(guī)律分析

為了更好地分析牡丹花瓣發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律,采用了指紋圖譜比較牡丹花發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)的差異,檢出但未能定性的揮發(fā)性物質(zhì)用數(shù)字表示[18]。如圖3(a區(qū)域)所示,發(fā)酵前后牡丹花瓣含量相似的揮發(fā)性物質(zhì)有2-己酮、2-呋喃甲醇、異戊醇、2-甲基丁酸甲酯、莰烯、丙醛、順式已烯-3-醇(葉醇)、2-庚酮、α-蒎烯、正壬醛等物質(zhì)。圖3(b區(qū)域)顯示的是發(fā)酵后含量減少的物質(zhì),其中環(huán)己酮、2-甲基-1-丁醇和物質(zhì)12是在發(fā)酵5 d開(kāi)始減少,β-蒎烯、庚醛、戊烯酸、丁酸和物質(zhì)4、13在發(fā)酵3 d開(kāi)始減少,值得注意的是牡丹花瓣中的丁酸在發(fā)酵后(特別是5～11 d)完全消失,這表明牡丹花瓣的揮發(fā)性物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中可能發(fā)生了轉(zhuǎn)化。圖3(c區(qū)域)中2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪和月桂烯等物質(zhì)在發(fā)酵5 d后開(kāi)始增加,2-乙基-1-己醇、2-甲基戊醇、2-糠醛和丙烯醛等物質(zhì)在發(fā)酵3 d開(kāi)始增加,然而3-辛醇只有在發(fā)酵11 d的牡丹花瓣中有明顯檢出。

2.1.3 牡丹花發(fā)酵前后主成分分析

PCA已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品品質(zhì)控制中,它是通過(guò)將多個(gè)變量進(jìn)行正交變換,將原有復(fù)雜信息簡(jiǎn)化成少量綜合性指標(biāo)的同時(shí)保證原信息損失少,進(jìn)而在原始變量中闡明變量之間元素的突出關(guān)系[19]。如圖4所示,PC1和PC2貢獻(xiàn)值分別為65%和13%,解釋累積貢獻(xiàn)值為78%,能將未發(fā)酵、發(fā)酵3 d和發(fā)酵5～11 d的牡丹花瓣清晰區(qū)分,證明發(fā)酵前后的牡丹花瓣中揮發(fā)性物質(zhì)有明顯區(qū)別,特別是發(fā)酵5～11 d。

a-沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖;b-兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖;c-阿魏酸的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖;d-蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖;e-沒(méi)食子酸的樣品色譜圖;f-兒茶素的樣品色譜圖;g-阿魏酸的樣品色譜圖;h-蘆丁的樣品色譜圖

2.2 牡丹花瓣發(fā)酵前后酚酸類(lèi)物質(zhì)變化

圖4是部分多酚物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的液相色譜圖,所有樣品含量均在檢測(cè)范圍內(nèi)。由表2可知,發(fā)酵前后的牡丹花瓣共有21種酚酸類(lèi)物質(zhì)檢出,不同組別的總酚酸物質(zhì)呈現(xiàn)出先增加后緩慢降低的變化規(guī)律,發(fā)酵5 d時(shí)總酚酸含量最高為3 449.65 μg/g。其中沒(méi)食子酸,原兒茶酸,肉桂酸,異櫟素在發(fā)酵過(guò)程中一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(P<0.05);兒茶素,原花青素B1、B2,丁香酸,綠原酸在添加“金花菌”種子液3 d后一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(P<0.05),這表明通過(guò)“金花菌”發(fā)酵可以使牡丹花瓣中酚酸類(lèi)物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化。然而,阿魏酸、蘆丁、咖啡酸、槲皮素、水楊酸、異鼠李素、山奈酚、對(duì)豆香酸和龍膽酸呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),其中,蘆丁在接種“金花菌”前后含量明顯升高(P<0.05),這有可能是“金花菌”自有的酚酸物質(zhì)。值得注意的是,只有肉桂酸是通過(guò)“金花菌”發(fā)酵產(chǎn)生的;沒(méi)食子酸甲酯在發(fā)酵前后及發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有顯著性差異(P>0.05);表兒茶素和金絲桃苷發(fā)酵前后具有顯著性差異(P<0.05),但在發(fā)酵過(guò)程中無(wú)顯著動(dòng)態(tài)變化(P>0.05)。

表2 發(fā)酵前后牡丹花瓣多酚種類(lèi)及含量Table 2 Species and content of polyphenols in peony petals before and after fermentation

2.3 牡丹花發(fā)酵前后聚類(lèi)分析

在面對(duì)較多數(shù)據(jù)指標(biāo)時(shí),單因素分析往往不能滿足綜合評(píng)價(jià)需求,這時(shí)就要考慮多因素分類(lèi)分析[20]。聚類(lèi)分析是將研究對(duì)象按照品質(zhì)特性相似程度聚合在一起,并按照綜合性多品種聚合,最終完成分析過(guò)程[21]。采用TBTools[22]軟件對(duì)發(fā)酵前后牡丹花瓣酚酸類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析,結(jié)果如圖6所示。發(fā)酵前后牡丹花瓣用21種酚酸含量作為聚類(lèi)變量,樣品可分為3類(lèi),B、C、D即發(fā)酵3、5、7 d分為第一類(lèi),總酚含量較高,酚類(lèi)物質(zhì)較為豐富;E、F即發(fā)酵9、11 d為第二類(lèi),總酚含量略低,酚類(lèi)物質(zhì)主要由原兒茶酸、沒(méi)食子酸、金絲桃苷、肉桂酸和異櫟素提供;A即未發(fā)酵的牡丹花瓣為第三類(lèi),總酚含量最低,酚類(lèi)物質(zhì)主要有原花青素B1、原花青素B2、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、丁香酸提供。PCA結(jié)果同樣能證明上述觀點(diǎn),將牡丹花瓣發(fā)酵前后及發(fā)酵過(guò)程中多酚變化較好區(qū)分,PC1和PC2的累計(jì)貢獻(xiàn)率為78.5%。

a-聚類(lèi)分析圖;b-PCA圖

3 結(jié)論

牡丹花作為藥食同源食材,其花瓣是揮發(fā)性物質(zhì)和酚酸類(lèi)物質(zhì)的主要來(lái)源。利用GC-IMS技術(shù)和HPLC-MS技術(shù)可以對(duì)發(fā)酵前后的牡丹花瓣中揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)和分析。GC-IMS在6個(gè)樣品中共檢出51種揮發(fā)性成分,定性出33種,主要為醛類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì),其次為萜烯類(lèi)和酸類(lèi)物質(zhì)。HPLC-MS技術(shù)在6個(gè)樣品中共檢出21種酚酸類(lèi)物質(zhì),發(fā)酵5 d時(shí)總酚含量最高。利用PCA和聚類(lèi)分析能將發(fā)酵前后和發(fā)酵不同階段的牡丹花瓣揮發(fā)性物質(zhì)和酚酸類(lèi)物質(zhì)變化進(jìn)行區(qū)分。綜上,發(fā)酵前后及發(fā)酵過(guò)程中的牡丹花揮發(fā)性物質(zhì)和酚酸類(lèi)物質(zhì)含量有顯著性差異(P<0.05),并隨著發(fā)酵時(shí)間的遷移牡丹花瓣中揮發(fā)性物質(zhì)和酚酸類(lèi)物質(zhì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。因此,采用聚類(lèi)分析和PCA可以為發(fā)酵牡丹花瓣茶的加工利用和揮發(fā)性物質(zhì)及酚酸類(lèi)物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化研究提供可靠依據(jù)。