基于液滴微流控技術(shù)選育超高濃釀造啤酒酵母菌株

賀秀麗,侍亞敏,謝鑫,郭立蕓,付曉芬

(北京燕京啤酒股份有限公司技術(shù)中心,啤酒釀造技術(shù)北京市重點實驗室,北京,101300)

基于降低成本、節(jié)能降耗,高濃釀造技術(shù)已成為啤酒釀造領(lǐng)域的一個重要研究方向[1],其中,高濃酵母的獲取對釀造的成功與否起到至關(guān)重要的作用,由于發(fā)酵初期較高的麥汁濃度以及發(fā)酵后期的高乙醇濃度,酵母活力降低、發(fā)酵緩慢或受阻、發(fā)酵周期延長[2],從而要求高濃酵母具備較高的抗逆性能。目前,高濃酵母的研究大多集中在提高對滲透壓的耐受性及酒精的產(chǎn)量方面[3-5],高濃酵母多通過誘變獲得,而傳統(tǒng)的誘變選育存在篩選工作量大、所用試劑多、周期長、篩選出的目標(biāo)菌株較少、效率低下等缺陷。液滴微流控是新興的菌種篩選方法[6],其利用互不相溶的兩液相產(chǎn)生分散的微液滴,并對微液滴進行操作,是一種非連續(xù)流微流控技術(shù)[7],可以在短時間內(nèi)生成大量液滴,這些液滴大小均勻、互不干擾、性能穩(wěn)定且一致,每個液滴可作為獨立的單位進行微生物的培養(yǎng)[8]。該技術(shù)在醫(yī)療領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[9],在微生物的高通量培養(yǎng)[10]、馴化[11]、篩選[12-13]等方面也展現(xiàn)出重要的應(yīng)用潛力,也有研究證明其可應(yīng)用于體外診斷裝置的開發(fā)[14]。本研究建立針對高濃菌株的液滴微流控篩選體系,結(jié)合常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma,ARTP)誘變技術(shù),對出發(fā)菌株進行誘變篩選,以期獲得1株性能穩(wěn)定的高濃釀造菌株,并進行中試規(guī)模驗證,為后續(xù)菌株在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

釀酒酵母Saccharomycespastorianus02菌株由實驗室菌種保藏中心提供。

液體麥汁培養(yǎng)基:取自產(chǎn)14 °P麥汁,115 ℃滅菌15 min備用。

固體麥汁培養(yǎng)基:液體麥汁中加入20 g/L瓊脂粉,115 ℃滅菌15 min備用。

高濃麥汁培養(yǎng)基:在18 °P麥芽汁中分別加入2、3、4 g/L葡萄糖及麥芽糖的混合物(葡萄糖∶麥芽糖=1∶6,質(zhì)量比)調(diào)節(jié)麥芽汁濃度至20～22 °P,115 ℃滅菌15 min備用。

1.1.2 實驗試劑

葡萄糖、麥芽糖,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;α-葡萄糖苷酶(α-glucosaccharase,α-GC)試劑盒、乙醇脫氫酶Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ,ADH Ⅱ)活性檢測試劑盒,索萊寶科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

MMC-B1全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)儀、ARTP-ⅡS常壓室溫等離子體誘變育種儀,無錫源清天木生物科技有限公司;IY1200自動細胞計數(shù)儀,上海睿鈺生物科技有限公司;UVmini-1280型紫外-可見光分光光度計,日本島津公司;WFJ 2100型酶標(biāo)儀,上海尤尼柯儀器有限公司;200 L中試規(guī)模糖化及發(fā)酵配套生產(chǎn)線,克朗斯股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 ARTP誘變

從斜面上挑取出發(fā)菌株于10 mL麥汁培養(yǎng)基試管中活化,18 h后取10 μL菌液均勻涂布在載片表面,將涂好的載片以及洗脫液(1.5 mL EP管中加入1 mL無菌水)轉(zhuǎn)移到ARTP誘變儀中,設(shè)置功率120 W,氣量8 L/min,時間梯度0、10、20、30、40、50、60 s[15],等離子照射處理后將載片放至裝有生理鹽水的EP管中,進行振蕩洗脫,并制成新的菌懸液,適當(dāng)稀釋后取100 μL涂布于平板上,25 ℃條件下培養(yǎng),計算致死率,選擇致死率85%～95%的處理時間為最適誘變時間。

1.2.2 全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)儀馴化

挑取出發(fā)菌株于16 °P麥汁培養(yǎng)基中(10 mL/試管),25 ℃靜置培養(yǎng)約18 h,按5%接種量進行轉(zhuǎn)接,將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入微生物液滴培養(yǎng)儀中,設(shè)定溫度梯度(12、13、14、15 ℃)、麥汁培養(yǎng)基濃度(18、20、21、22 °P)、乙醇體積分數(shù)(0%、5%、8%、10%、12%),每個條件下生成10個液滴,分別測定不同條件下菌株的生長曲線,根據(jù)生長情況確定菌株的最優(yōu)馴化條件。

將誘變后的菌液收集在5 mL新鮮的22 °P麥汁培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)入微生物液滴培養(yǎng)儀中,設(shè)定參數(shù)如表1,于最佳馴化條件下對誘變菌進行培養(yǎng),培養(yǎng)約4周后,選取生長情況最好的10個液滴進行斜面保存。

表1 實驗參數(shù)的設(shè)定Table 1 Setting of experimental parameters

1.2.3 酶活力測定

突變菌細胞內(nèi)的α-GC和ADHⅡ活力采用相應(yīng)的試劑盒進行檢測,測定方法詳見試劑盒使用說明。

1.2.4 發(fā)酵實驗

用接種環(huán)挑取優(yōu)選菌株于10 mL麥汁試管中,25 ℃培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接至100 mL麥汁中(隨發(fā)酵體系的增大,種子液的培養(yǎng)量適當(dāng)增加),25 ℃培養(yǎng)48 h后,取適量酵母泥接種至22 °P高濃新鮮麥汁中,接種量控制在1.8×107～2.0×107個/mL,14 ℃恒溫發(fā)酵至糖度為6 °P時,封罐自然升壓至(0.15±0.20) MPa,發(fā)酵8 d檢測雙乙酰,當(dāng)雙乙?！?.08 mg/L開始降溫,24 h降至(0±0.5) ℃,貯酒7 d。

1.2.5 發(fā)酵液理化風(fēng)味指標(biāo)檢測

酒精度、原麥汁濃度、發(fā)酵度、苦味值、雙乙酰、殘?zhí)恰⒖偹岷蚿H等發(fā)酵液基本理化指標(biāo)的檢測均參照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》進行檢測[16],風(fēng)味物質(zhì)參照王莉娜等[17]的方法測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及作圖使用 IBM SPSS Statistics 26.0和Excel軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變聯(lián)合微生物液滴培養(yǎng)高通量篩選體系的建立

2.1.1 ARTP誘變參數(shù)確定

將對數(shù)生長中期的出發(fā)菌株進行ARTP誘變,如圖1所示,隨著離子束照射時間的增長,酵母細胞的存活率迅速下降。當(dāng)照射時間達到60 s以上時,酵母細胞死亡率為100%;處理時間為35 s左右,致死率為87.9%。因此我們選定出發(fā)菌株進行ARTP誘變的照射處理時間為35 s。

2.1.2 微生物液滴培養(yǎng)馴化參數(shù)確定

對不同溫度、麥汁濃度、乙醇體積分數(shù)條件下菌株02的生長曲線進行測定,如圖2所示,隨著溫度的升高,菌株增殖速率加快;不同麥汁濃度下菌株生長情況差異不大,其中低濃度麥汁中菌株生長OD值偏高一些,但優(yōu)勢并不明顯;菌株02在高濃環(huán)境下生長主要受到乙醇的抑制,乙醇體積分數(shù)達到10%,對菌株生長有明顯的抑制,5%和8%時有輕微抑制;綜合考慮,微生物液滴培養(yǎng)馴化參數(shù)為:培養(yǎng)溫度為15 ℃;培養(yǎng)基為22 °P麥汁;馴化壓力乙醇體積分數(shù)為5%～10%。

a-溫度;b-麥汁濃度;c-乙醇濃度

2.2 高濃菌株的誘變選育

2.2.1 誘變及微生物液滴培養(yǎng)初篩

將出發(fā)菌株在ARTP誘變儀上處理35 s后,制成懸浮液轉(zhuǎn)入微生物液滴培養(yǎng)儀中,選擇“適應(yīng)性進化”功能模塊,按照設(shè)定參數(shù)運行。如圖3,出發(fā)菌株經(jīng)ARTP誘變后轉(zhuǎn)入微生物液滴培養(yǎng)儀中,在不添加乙醇的麥汁中培養(yǎng)2代后轉(zhuǎn)入5%乙醇體積分數(shù)的麥汁培養(yǎng)基;培養(yǎng)7代后提取生長狀態(tài)較優(yōu)的液滴然后轉(zhuǎn)入7%乙醇體積分數(shù)的麥汁培養(yǎng)基,重復(fù)操作直到9%乙醇體積分數(shù)。

圖3 微生物液滴培養(yǎng)馴化實驗結(jié)果圖Fig.3 Results of MMC domestication experiment

如圖4所示,伴隨乙醇體積分數(shù)的升高,菌株生長均受到抑制,生物量逐漸降低,各誘變菌在同一乙醇體積分數(shù)下的生長狀態(tài)不盡相同,根據(jù)不同乙醇體積分數(shù)下分選液滴的狀態(tài),篩選出40株生物量較高的誘變菌株(如圖4紅點所示)。

2.2.2 糖代謝能力復(fù)篩

α-GC與ADHⅡ是酵母糖代謝與乙醇代謝過程中重要的酶,α-GC能夠?qū)Ⅺ溠刻?、蔗糖、麥芽三糖等低寡聚糖分解為單?促進酵母對糖的吸收;乙醇在ADHⅡ作用下轉(zhuǎn)化為乙醛,進而在乙醛脫氫酶的作用下生成乙酸,有助于緩解乙醇對酵母的毒害。檢測α-GC和ADHⅡ的活性對監(jiān)測酵母糖代謝過程是否正常以及篩選高乙醇耐受菌株具有重要意義[18-19]。對2.2.1節(jié)中獲得的初篩菌α-GC及ADHⅡ活力進行檢測,結(jié)果如圖5所示。各誘變菌株的α-GC活力與乙醇梯度關(guān)聯(lián)不明顯,隨著乙醇梯度的升高,酶活力并沒有呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)或負相關(guān),而ADHⅡ活力與乙醇梯度呈正相關(guān),即隨著乙醇體積分數(shù)的升高,酶活力數(shù)值也逐漸變大。綜合酶活力和各菌株生長結(jié)果,篩選出7株糖代謝力強、耐高乙醇體積分數(shù)、生長優(yōu)勢明顯的菌株。

圖5 各誘變菌株的α-GC(a)和ADHⅡ(b)活力結(jié)果Fig.5 Enzyme activity of α-GC(a) and ADHⅡ(b) of each mutant strain

2.2.3 實驗室發(fā)酵

對2.2.2節(jié)中獲得的7株誘變優(yōu)良菌株進行2 L量筒發(fā)酵實驗,檢測發(fā)酵過程及發(fā)酵結(jié)束后的關(guān)鍵指標(biāo),結(jié)果見表2及表3。菌株8-2和9-50的增殖倍數(shù)更高,降糖速率更快,回收酵母泥的死亡率較低,這說明其在22 °P麥汁條件發(fā)酵時的細胞活性較好,耐受高濃能力更強。發(fā)酵結(jié)束后,菌株9-50的發(fā)酵度達到68.4%,發(fā)酵更完全,醇酯香氣濃郁,口感更協(xié)調(diào),所以選擇菌株9-50進行中試規(guī)模測試。

表2 誘變菌株的發(fā)酵過程指標(biāo)Table 2 Indicators of fermentation process of mutant strains

表3 發(fā)酵結(jié)束后的理化指標(biāo)與風(fēng)味指標(biāo)Table 3 Physicochemical and flavor indexes of mutant strain at the end of fermentation

2.3 中試規(guī)模發(fā)酵

如圖6所示,中試發(fā)酵過程中,菌株9-50的酵母增殖旺盛,無明顯遲滯期,細胞死亡率低于5%,達到特定酒精度的發(fā)酵周期縮短42 h,而且后期酵母沉降較快,有利于酵母泥的回收傳代,可見優(yōu)選菌株能夠快速適應(yīng)高濃環(huán)境,迅速起酵,并且在高滲透壓環(huán)境下表現(xiàn)出較好的細胞活性。吳卓凡[20]的研究也發(fā)現(xiàn)高濃釀造菌株M14在發(fā)酵后期糖利用較強,細胞性能下降較少,平板死亡率更低的現(xiàn)象,且與出發(fā)菌株相比,M14中與碳代謝及氨基酸代謝的基因發(fā)生了顯著變化。郭璇[21]發(fā)現(xiàn),高濃環(huán)境下酵母為抵抗高滲透壓高乙醇,可能會抑制某些胞內(nèi)蛋白的合成,從而造成發(fā)酵性能的改變。

從理論上講,發(fā)酵性能良好的酵母泥,可使用多代。在實際生產(chǎn)過程中,由于酵母菌種本身的變化及外界微生物的污染,隨著酵母使用代數(shù)的增加,其發(fā)酵性能和活力等會降低,死亡率、衰老比例等會有所上升,一般啤酒廠的優(yōu)良菌種回收的酵母泥需控制在能連續(xù)使用5～7代[22]。表4展示了9-50與對照酵母泥的主要性能,2組的電導(dǎo)率、活力和自溶系數(shù)無顯著性差異,菌株9-50的死亡率比對照菌低64%,與發(fā)酵過程中死亡率情況相對應(yīng),在凝聚性方面,9-50的凝聚性比對照菌高48.1%,符合發(fā)酵后期酵母沉降較快情況。

表4 回收酵母泥的相關(guān)指標(biāo)Table 4 Indicators of yeast mud

發(fā)酵結(jié)束后貯酒7 d的成品酒理化風(fēng)味指標(biāo)檢測結(jié)果(表5)顯示,與對照菌相比,菌株9-50在原麥汁濃度略低于出發(fā)菌株的情況下,發(fā)酵度比對照組提高了約2%,這表明優(yōu)選菌株9-50能更好的適應(yīng)高濃環(huán)境,發(fā)酵更完全。乙醛是影響啤酒風(fēng)味組成和風(fēng)味穩(wěn)定性最重要的醛類化合物,乙醛含量過高時會帶來不愉快的青蘋果味、青草味和氧化味等,進一步引起“上頭”等不適生理反應(yīng)[23],一般優(yōu)質(zhì)成熟的工業(yè)啤酒中乙醛質(zhì)量含量在2～10 mg/L[24],菌株9-50發(fā)酵后的成品酒乙醛含量低于對照28.8%,這表明該菌株具有較好的乙醛還原能力。本次實驗2組的總酯含量均偏高,主要是因為酯的形成與麥汁濃度息息相關(guān),12 °P以下的麥汁一般不存在酯多的問題,但是超過一定限度(如>15 °P)時,即便接種量也按比例增加,由于代謝產(chǎn)物的增加,使脂肪酸的合成減少,酯的形成增加[25]。同時,發(fā)酵在14 ℃的高溫下進行,有利于酯的生成,但優(yōu)選菌株的總酯含量顯著低于出發(fā)菌株11%。

表5 成品酒理化指標(biāo)與風(fēng)味物質(zhì)含量Table 5 Physicochemical indexes and flavor content of finished beer

2.4 遺傳及發(fā)酵穩(wěn)定性實驗

誘變選育獲得的菌株易發(fā)生優(yōu)勢性狀的回復(fù)突變,其穩(wěn)定性需要進行長時間的針對性馴化和適宜的保藏方法來維持。對優(yōu)選菌株9-50持續(xù)進行4個月的高濃麥汁馴化實驗,連續(xù)傳代20次后,分別取第0、1、2、5、10、15、20代進行發(fā)酵驗證。由圖7可知,經(jīng)過多次傳代后,菌株的增殖倍數(shù)穩(wěn)定在4左右,降糖時間穩(wěn)定在160 h,且隨著馴化傳代次數(shù)的增加,細胞死亡率在10代之后顯著降低,維持在2%～3%之間,具有良好的遺傳穩(wěn)定性。發(fā)酵結(jié)束后的關(guān)鍵理化風(fēng)味指標(biāo)結(jié)果顯示(表6),各代菌株發(fā)酵后的酒精度、發(fā)酵度無明顯差別,酒精度可達到10%vol,發(fā)酵度基本在65%左右,高級醇(總醇)波動在160～180 mg/L,揮發(fā)酯(總酯)含量在10代以后呈現(xiàn)小幅增加,但整體維持在60～80 mg/L,具有較好的發(fā)酵穩(wěn)定性。

圖7 不同代數(shù)的發(fā)酵過程指標(biāo)Fig.7 Fermentation process index of different algebras

表6 發(fā)酵結(jié)束后理化指標(biāo)與風(fēng)味物質(zhì)含量Table 6 Physicochemical index and flavor content after fermentation

3 結(jié)論

本研究基于微液滴培養(yǎng)技術(shù)選育超高濃釀造菌株,建立了ARTP誘變聯(lián)合液滴微流控技術(shù)選育高濃釀造菌株的方法,確定了微流控選育的最佳馴化條件:培養(yǎng)溫度為15 ℃,麥汁濃度22 °P,馴化的乙醇體積分數(shù)為5%～10%,應(yīng)用該方法選育得到高濃釀造菌株9-50,該菌株乙醇脫氫酶活性高,可以耐受9%的乙醇體積分數(shù)。在22 °P,14 ℃條件下發(fā)酵,與出發(fā)菌株相比,增殖旺盛,降糖時間縮短42 h,發(fā)酵度>66%,雙乙酰含量0.06 mg/L,乙醛含量降低28.8%,揮發(fā)酯含量降低11%,醇酯香氣較協(xié)調(diào),具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。