基于腸道類器官解析益生菌調(diào)節(jié)腸嗜鉻細(xì)胞合成5-HT的效應(yīng)物質(zhì)

汪錚,田培郡,朱然,王剛,陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)作為一種神經(jīng)遞質(zhì),在調(diào)節(jié)腸道蠕動和神經(jīng)功能方面扮演著重要的角色[1-2]。5-HT是以色氨酸為前體,在色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase,TPH)和芳香族氨基酸脫羧酶的催化下生成的[3];TPH是其合成途徑中的關(guān)鍵限速酶,包括TPH1和TPH2兩種亞型。前者存在于腸嗜鉻(enterochromaffinl,EC)細(xì)胞內(nèi),后者主要在大腦中縫核中發(fā)現(xiàn)[4]。EC細(xì)胞占比不到腸上皮細(xì)胞總數(shù)的1%,卻合成了人體內(nèi)超過90%的5-HT[3]。EC細(xì)胞還能夠接受腸腔內(nèi)環(huán)境的化學(xué)、機械等刺激,在基底部位或頂膜附近釋放5-HT,將腸內(nèi)信號傳導(dǎo)至大腦[5]。

腸道菌群及其分泌的代謝產(chǎn)物能夠刺激EC細(xì)胞來調(diào)控5-HT的合成。YANO等[6]發(fā)現(xiàn)無菌小鼠腸道內(nèi)5-HT含量比正常老鼠低約60%,當(dāng)重新定殖產(chǎn)孢細(xì)菌后,能夠恢復(fù)其腸道內(nèi)5-HT的水平;進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),菌群代謝產(chǎn)物是誘導(dǎo)EC細(xì)胞釋放5-HT的關(guān)鍵因素,包括α-生育酚、丁酸鹽、膽鹽、脫氧膽酸鹽、對氨基苯甲酸、丙酸鹽和酪胺等。另有研究表明,與SPF小鼠相比,無菌小鼠結(jié)腸內(nèi)Tph1表達(dá)水平顯著降低,而恢復(fù)腸道菌群可顯著逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象;菌群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸是影響Tph1表達(dá)和5-HT合成的必要因素[7]。此外,在異硫氰酸烯丙酯、異戊酸、兒茶酚胺等腸道菌群代謝產(chǎn)物的刺激下,EC細(xì)胞分別通過TRPA1離子通道、Olfr558受體和Adrα2A受體—TRPC4通道信號級聯(lián)通路對其作出興奮反饋,激活EC細(xì)胞的L型電壓門控鈣離子通道來釋放血清素[8]。

益生菌也被證明具有調(diào)節(jié)腸道5-HT合成的能力。例如,乳雙歧桿菌TY-S01能夠通過調(diào)節(jié)腸道微生物群和代謝產(chǎn)物來維持腸道內(nèi)5-HT水平,對洛哌丁胺誘發(fā)便秘具有一定的預(yù)防效果[9]。此外,齒雙歧桿菌的定殖可以提高腸道短鏈脂肪酸受體FFAR2和5-HT轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)5-HT的外分泌水平[10]?？梢钥闯?現(xiàn)有關(guān)于益生菌調(diào)節(jié)宿主5-HT合成的機制,仍停留在調(diào)節(jié)腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的宏觀層面。至于益生菌本身對5-HT合成的影響機制,尚未有深入研究。

本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)一株短雙歧桿菌——CCFM1025,能夠顯著提高EC細(xì)胞模型(RIN14B)的5-HT合成能力;尤其是使用發(fā)酵上清液孵育30 min后,能夠顯著提高RIN14B細(xì)胞Tph1基因的轉(zhuǎn)錄水平[11]。但是,何種代謝產(chǎn)物、通過何種途徑提高EC細(xì)胞合成5-HT仍然是未知的。本研究擬基于益生菌與腸道類器官共培養(yǎng)和量效分析的方法,解析短雙歧桿菌CCFM1025調(diào)節(jié)5-HT合成的特征效應(yīng)物,從而闡明益生菌發(fā)揮生理功能的分子機制,為該類功能益生菌的定向篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

MRS肉湯培養(yǎng)基、TRIzol RNA Isolation Reagents,美國Invitrogen公司;SYBR Green Supermix,美國Bio-Rad公司;Tph1特異性引物、D601037-0050抗小鼠/兔FITC免疫熒光檢測試劑盒,上海生工有限公司;色氨酸羥化酶1(TPH1;Cat#DF6465),美國Affinity抗體公司;06005 IntestiCultTM類器官生長培養(yǎng)基,加拿大StemCell公司;356231基質(zhì)膠,美國Corning公司;C0221D D-PBS,碧云天;E-EL-0033c血清素/5-羥色胺(serotonin/5-HT)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒,武漢伊萊瑞特生物科技有限公司;36254 DMEM/E12培養(yǎng)基,加拿大Stemcell公司。

1.2 材料和設(shè)備

5417R冷凍離心機,德國Eppendorf公司;CFX384實時熒光定量PCR儀,美國Bio-Rad公司;SX-300型滅菌鍋,日本Tomy Digital Biology公司;CO2培養(yǎng)箱,美國Thermo Scientific Forma公司;T1-SAM倒置熒光顯微鏡,日本Nikon公司;恒溫水浴鍋;厭氧工作站;SCIENTZ-48高通量組織研磨器,寧波新芝生物科技有限公司;BSC-1004IIA2生物安全柜,蘇州安泰。

1.3 擬試驗菌株

BifidobacteriumbreveCCFM1025分離自西藏某一健康成人糞便,保藏于江南大學(xué)生物技術(shù)中心菌種庫(-80 ℃,30%甘油中)。

1.4 菌株活化和發(fā)酵液制備

使用前,以無菌接種環(huán)挑取適量菌液,在MRS瓊脂平板上劃線活化2次(37 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h)。挑取單菌落,CCFM1025接種于含有1 g/L半胱氨酸鹽酸鹽的MRS液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃的厭氧工作站進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。取對數(shù)生長后期的發(fā)酵液,離心(4 ℃、6 000×g、10 min)收集上清液得到發(fā)酵液。

1.5 菌株發(fā)酵產(chǎn)物非靶向代謝組學(xué)分析

取對數(shù)生長后期的發(fā)酵液,離心(4 ℃、6 000×g、10 min)收集上清液后過0.22 μm濾膜得到發(fā)酵液,經(jīng)400 μL甲醇沉淀蛋白質(zhì)后,4 ℃、15 000 r/min離心15 min,取上清液于真空濃縮儀蒸發(fā)至干,最后以100 μL甲醇水(4∶1,體積比)復(fù)溶待測。

采用Ultra-performance liquid chromatography &Q-Exactive high-resolution mass spectrometer系統(tǒng)進(jìn)行代謝組學(xué)檢測:使用C18柱(Waters UPLC BEH C18-2.1 mm×100 mm,1.7 μm)進(jìn)行梯度洗脫。流動相包括:(A)0.1%甲酸水溶液和(B)乙腈用于正離子模式;(A)5 mmol/L乙酸銨水溶液和(B)乙腈用于負(fù)離子模式。進(jìn)樣量5 μL,流速350 μL/min。梯度洗脫程序:0～1.5 min,99%(A);1.5～16 min,從99%～0%(A);16～18 min,0%(A);18～18.1 min,從0%到99%(A);18.1～25 min,99%(A)。采用MS/MS-scan模式(70～1 050m/z),分辨率70 000。采用Compound Discover 3.3軟件進(jìn)行樣本的峰識別、提取、對齊和整合。之后,通過mzCloud數(shù)據(jù)庫對91個(負(fù)離子模式)和185個(正離子模式)發(fā)酵液代謝物的名稱和化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行二次比對,刪去重復(fù)合并后共259個代謝物進(jìn)行后續(xù)分析。

1.6 小腸類器官構(gòu)建

1.6.1 腸道隱窩分離、培養(yǎng)

取6周齡雄性C57BL/6小鼠約20 cm的小腸,用鑷子和剪刀去除腸系膜、血管和脂肪,并用D-PBS沖洗多次,沿著腸腔軸向剪開腸道,轉(zhuǎn)移至含有10 mL D-PBS的培養(yǎng)皿中清洗干凈。用鑷子將腸道懸于含有預(yù)冷D-PBS的50 mL離心管口,剪成約2 mm的小段。用移液槍反復(fù)吹打,待組織塊自然沉降后,棄去上清液,加入15 mL預(yù)冷的D-PBS,反復(fù)吹打3次,靜置。重復(fù)操作15次或是等到上清液變澄清,棄去上清液加入細(xì)胞解離液搖床上低速孵育10 min,待自然沉降棄去上清液,用含有0.1%(體積分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白的D-PBS重懸,70 μm濾網(wǎng)過濾后,低速低溫離心后重懸于DMEM/F-12培養(yǎng)基。顯微鏡下挑選質(zhì)量較好、密度適中的隱窩數(shù)。用類器官培養(yǎng)基和基質(zhì)膠各150 μL重懸腸隱窩,吸取50 μL懸液,加入到提前預(yù)熱的24孔板的中心部位,在37 ℃培養(yǎng)箱中靜置10 min讓基質(zhì)膠凝固成一個圓頂結(jié)構(gòu),使用移液槍沿著孔側(cè)壁向每個孔加入750 μL類器官培養(yǎng)基,并在37 ℃和5% CO2下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.6.2 小腸類器官換液和傳代

待腸隱窩培養(yǎng)2～3 d后,培養(yǎng)基逐漸變黃,用移液槍沿著孔側(cè)壁吸去培養(yǎng)基,再吸去750 μL新的培養(yǎng)基,沿著孔側(cè)壁緩慢加入。

等培養(yǎng)5～7 d后進(jìn)行傳代,準(zhǔn)備好所有試劑進(jìn)行解凍,在每個需要傳代的孔中小心吸去培養(yǎng)基,不要破壞基質(zhì)膠結(jié)構(gòu),每孔加入1 mL細(xì)胞裂解液,室溫孵育1 min,用潤洗后的槍頭對類器官進(jìn)行反復(fù)吹打20次,注意不要產(chǎn)生氣泡,用同一根槍頭將所有需要傳代的類器官轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中。之后再用新的細(xì)胞裂解液潤洗培養(yǎng)孔,再轉(zhuǎn)移到15 mL離心管,其余需要傳代的孔均按上述操作。搖床低速孵育10 min,低速低溫離心5 min后棄去上清液,加入10 mL DMEM/F-12培養(yǎng)基,混勻后低速低溫離心,棄去上清液。將類器官培養(yǎng)基和基質(zhì)膠以1∶1的質(zhì)量比重懸腸隱窩,吸取50 μL懸液,加入到提前預(yù)熱的24孔板的中心部位,在37 ℃培養(yǎng)箱中靜置10 min讓基質(zhì)膠凝固成一個圓頂結(jié)構(gòu),使用移液槍沿著孔側(cè)壁向每個孔加入750 μL類器官培養(yǎng)基,并在37 ℃和5% CO2下進(jìn)行培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)5～7 d后的類器官形態(tài),成熟且具有明顯多芽結(jié)構(gòu),即可進(jìn)行物質(zhì)刺激實驗。

1.7 刺激小腸類器官Tph1基因轉(zhuǎn)錄實驗

以發(fā)酵產(chǎn)物中每種代謝產(chǎn)物的實際濃度,配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,并設(shè)置0.1×、1×、10×三個濃度梯度。無菌0.22 μm濾膜過濾除菌,每個孔用移液槍吸去培養(yǎng)基,加入含有一定濃度草酰乙酸、乳酸或檸檬酸的1 mL D-PBS,孵育一定時間后收集類器官。進(jìn)行后續(xù)的基因表達(dá)和免疫熒光的分析。通過qRT-PCR檢測小腸類器官中Tph1的基因表達(dá)情況。

樣本RNA按照TRIzol法提取,收集完類器官加入TRIzol充分裂解、振蕩,加入氯仿提取RNA,然后通過異丙醇沉淀,體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗脫得到RNA,室溫干燥15 min后加入DEPC水溶解RNA。采用Vazyme反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA,在熒光定量擴增儀器上進(jìn)行檢測。以管家基因Gapdh作為內(nèi)參,每個樣本設(shè)立3個平行孔。反應(yīng)結(jié)束后,取各個擴增循環(huán)數(shù)(Cq)進(jìn)行計算分析。相對表達(dá)量以目的基因?qū)τ诠芗一虻谋稊?shù)(2-ΔΔCq)表示,其中-ΔΔCq=(Cq目的基因-Cq管家基因)實驗組-(Cq目的基因-Cq管家基因)對照組。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.8 小腸類器官TPH1蛋白免疫熒光分析

腸類器官收取:腸類器官培養(yǎng)在24孔中,吸取培養(yǎng)基,用冷的D-PBS洗一遍,然后每個孔加入1 mL的預(yù)冷細(xì)胞裂解液,用潤濕的槍頭輕輕吹打,將腸類器官和基質(zhì)膠從孔底部吹下來,轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中自然沉降在底部。冰上孵育約20 min直到基質(zhì)膠基本被融解,腸類器官在離心管中自然沉降在底部。

免疫熒光染色參照上海生工FITC免疫熒光試劑盒說明書進(jìn)行:將收集的類器官用PBS清洗3遍,加入4%多聚甲醛(paraformaldehycle,PFA)進(jìn)行固定,再次用PBS清洗3遍加入0.5% Triton-100溶液進(jìn)行腸細(xì)胞破膜。隨后PBS清洗2遍后加入5%牛血清白蛋白進(jìn)行抗體封閉。將一抗TPH1(1∶200)稀釋到合適的比例加入后4 ℃過夜,PBS清洗后加入FITC標(biāo)記的二抗和DAPI進(jìn)行染色。最后加入一滴抗熒光淬滅劑混勻封片,封好的片子4 ℃避光保存。在FITC和DAPI通道下,用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行掃描拍照,分析蛋白在腸類器官中的表達(dá)定位情況。最后用Image J對類器官免疫熒光實驗結(jié)果進(jìn)行平均免疫熒光強度測定。

1.9 5-HT檢測方法

用小鼠5-HT ELISA試劑盒檢測各組腸類器官分泌5-HT的水平變化,具體實驗步驟參考生產(chǎn)商的說明書進(jìn)行。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法

數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,采用Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計分析和圖形繪制。顯著性標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為P<0.05;其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 小腸類器官構(gòu)建及CCFM1025發(fā)酵液對小腸類器官的影響

小腸隱窩經(jīng)分離提取培養(yǎng),幾個小時到一天培養(yǎng)時間內(nèi)形成閉合的圓形囊狀結(jié)構(gòu),并且具有相對光滑的邊緣(圖1-a),通常在培養(yǎng)2～4 d后,開始萌芽,位于小腸隱窩底部的干細(xì)胞不斷增殖和分化,向囊狀結(jié)構(gòu)四周擴散,培養(yǎng)第5～7天閉合囊狀結(jié)構(gòu)形成復(fù)雜的多葉結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂卸鄠€向外凸起芽體的立體結(jié)構(gòu)(圖1-a),此時形成了小腸類器官的成熟結(jié)構(gòu),一般可達(dá)到每個孔約200個類器官(圖1-b)。繼續(xù)培養(yǎng)2～4 d,腸上皮細(xì)胞將會死亡脫落于腸腔內(nèi),中部變黑,直至類器官裂解破碎凋亡。

團隊前期檢測了CCFM1025發(fā)酵上清液對RIN14B細(xì)胞Tph1轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。在刺激時間為30 min時,較于空白組Tph1的表達(dá)有顯著提高。我們設(shè)置了不同濃度梯度的CCFM1025發(fā)酵液,觀察對小腸類器官Tph1表達(dá)和5-HT外分泌水平的影響。結(jié)果顯示發(fā)酵液干預(yù)60 min后,小腸類器官Tph1基因表達(dá)和5-HT外分泌水平呈劑量依賴性。如圖1-c所示,較于105CFU/mL發(fā)酵液干預(yù)組,107、109CFU/mL發(fā)酵液干預(yù)組中小腸類器官Tph1基因表達(dá)顯著上調(diào);如圖1-d所示,較于105CFU/mL發(fā)酵液干預(yù)組,109CFU/mL發(fā)酵液干預(yù)組中小腸類器官5-HT分泌水平顯著上調(diào)(P<0.05)。

2.2 CCFM1025發(fā)酵液非靶向代謝組分析

根據(jù)Compound Discover 3.3軟件對樣本的峰識別、提取、對齊和整合(如圖2-a所示),篩選出符合數(shù)據(jù)庫配比得分>80等條件的所有代謝物,得到91個(負(fù)離子模式)和185個(正離子模式)發(fā)酵液代謝物,刪去重復(fù)合并后共有259個代謝物。并根據(jù)含量對對數(shù)后期CCFM1025發(fā)酵液中能檢測到的代謝物進(jìn)行排序,發(fā)酵液中含量排序前10的物質(zhì)如圖2-b、圖2-c所示,前10種物質(zhì)的m/z的離子圖和峰面積圖如圖2-b所示。

a-CCFM1025發(fā)酵液非靶向代謝譜圖;b-CCFM1025發(fā)酵液非靶向代謝物離子圖(m/z)和峰面積圖;c-CCFM1025發(fā)酵液非靶向代謝物峰面積圖(前10)

根據(jù)前期文獻(xiàn)的調(diào)研,我們選取發(fā)酵液揮發(fā)性代謝產(chǎn)物和非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物(豐度前10)。根據(jù)靶向定量的方法,確定了發(fā)酵液中含有4.8 mg/mLL-乳酸等,以發(fā)酵液所含每種物質(zhì)的濃度定為1×,根據(jù)母液濃度按梯度稀釋配制0.1×、1×、10×的工作液進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3 代謝產(chǎn)物對小腸類器官Tph1基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

以發(fā)酵產(chǎn)物中每種代謝產(chǎn)物的實際濃度配制好后,與小腸類器官共培養(yǎng)不同時間:20、40、60 min。如圖3所示,檸檬酸、亮氨酸、L-乳酸、異亮氨酸、腺嘌呤、乙酸呈時間依賴性。相較于20 min共培養(yǎng)組,較長時間共培養(yǎng)的草酰乙酸、L-乳酸、肌酐、腺嘌呤、乙酸組均能夠顯著提高小腸類器官Tph1基因的表達(dá),而較長時間共培養(yǎng)的檸檬酸、亮氨酸、異亮氨酸組顯著抑制了小腸類器官Tph1基因的表達(dá)。我們根據(jù)每種物質(zhì)在發(fā)酵液中的含量設(shè)置了3個不同的濃度梯度的工作液,統(tǒng)一為0.1×、1×(CCFM1025發(fā)酵液所含該物質(zhì)濃度)、10×;與小腸類器官共培養(yǎng)相應(yīng)的最適時間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-乳酸、乙酸均具有劑量依賴性,并且在10×濃度下能夠顯著提高小腸類器官Tph1基因的表達(dá)(L-乳酸:P<0.000 1;乙酸P<0.001)。

2.4 乙酸、乳酸對小腸類器官TPH1蛋白免疫熒光的表現(xiàn)

上述結(jié)果顯示,L-乳酸、乙酸能夠顯著刺激小腸類器官Tph1基因的表達(dá),因此我們又對小腸類器官進(jìn)行TPH1免疫熒光實驗觀察。DAPI透過細(xì)胞膜和細(xì)胞核中雙鏈DNA結(jié)合發(fā)揮標(biāo)記作用,經(jīng)等濃度DAPI染色后各組間熒光強度沒有顯著差異,結(jié)果體現(xiàn)了實驗樣本和檢測條件的一致性(圖4-a)。將最適濃度的乙酸(1×)、L-乳酸(1×)與小腸類器官共培養(yǎng),對小腸類器官進(jìn)行TPH1免疫熒光染色處理,結(jié)果顯示L-乳酸和乙酸體外刺激小腸類器官導(dǎo)致TPH1表達(dá)顯著增強(如圖4-b、圖4-c所示)。綜上,L-乳酸和乙酸激活了小腸類器官TPH1的表達(dá),與上述基因表達(dá)結(jié)果一致。

a-各組小腸類器官DAPI染色的平均免疫熒光強度;b-不同代謝物刺激小腸類器官TPH1的平均免疫熒光強度;c-不同代謝物刺激小腸類器官TPH1的免疫熒光表達(dá)

3 結(jié)論與討論

明確益生菌特定的代謝產(chǎn)物與腸道細(xì)胞的互作機制可能是未來實現(xiàn)特定功能益生菌定向篩選的前提。但由于研究方法的局限性,探究益生菌與宿主的直接互作機制仍具有挑戰(zhàn)。以往的研究,都是在單一時間點和特定范圍內(nèi)進(jìn)行橫斷面式研究,通過不同實驗組橫向比較得到差異結(jié)果[12-13],比如只通過某一時間點的橫向比較來判斷服用益生菌的積累效應(yīng);其次,在劑量維度上,往往采用單一劑量來評價益生菌的效果,然而它可能處于濃度與效果評價曲線中的任意一點[14]?？梢?傳統(tǒng)的實驗設(shè)計存在一定的局限性。益生菌功效研究亟待擺脫脫離劑量、時間限定來研究其效果的現(xiàn)狀。

出現(xiàn)這種現(xiàn)象是因為體內(nèi)量效關(guān)系研究的技術(shù)難度較高。近年來發(fā)展的腸道類器官培養(yǎng)技術(shù)能夠很好地解決這一問題[15-17]。腸道類器官擁有來源于腸干細(xì)胞的多種細(xì)胞類型,并復(fù)現(xiàn)了腸道組織局部的3D立體空間結(jié)構(gòu)。通過與腸道細(xì)菌或是代謝產(chǎn)物的共培養(yǎng),能夠模擬營養(yǎng)成分與多種細(xì)胞互作的真實內(nèi)環(huán)境。此外,類器官能夠長時間培養(yǎng)、穩(wěn)定傳代,有利于開展基于時間、劑量的量效分析實驗。BFLLONO等[18]通過腸類器官闡明了EC的內(nèi)在生物物理、藥學(xué)及遺傳學(xué)特性,為研究腸道微生物調(diào)節(jié)宿主5-HT合成的分子機制、效應(yīng)物篩選等奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。本研究采用腸類器官與益生菌特征性代謝產(chǎn)物共培養(yǎng)的方式,明確了能夠以時間、劑量依賴效應(yīng)刺激Tph1基因表達(dá)的代謝產(chǎn)物,從物質(zhì)層面為益生菌調(diào)節(jié)生理功能提供了更科學(xué)、更具體的證據(jù)。

針對CCFM1025發(fā)酵產(chǎn)物的非靶向代謝組學(xué)分析顯示,乳酸是其主要的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物(豐度排名前10)。此外,我們對CCFM1025主要的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物——乙酸,也進(jìn)行了量效作用分析。結(jié)果表明,乙酸、L-乳酸能夠以時間、劑量依賴效應(yīng)促進(jìn)腸道類器官Tph1基因的表達(dá)。值得注意的是,乙酸能夠參與神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié),比如調(diào)節(jié)胃腸道蠕動、食欲、情緒反應(yīng)等等。ENGEVIK等[10]研究發(fā)現(xiàn),齒雙歧桿菌的定殖可增加小鼠腸道內(nèi)乙酸的含量,通過提高5-HT轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá),促進(jìn)5-HT的分泌;此外,TSURUTA等[19]研究發(fā)現(xiàn),乙酸鹽和腸類器官共培養(yǎng)能夠顯著提高CgA陽性細(xì)胞數(shù)量以及Tph1、Htr4的基因表達(dá)水平,這與我們的研究結(jié)論一致。乳酸在調(diào)節(jié)5-HT合成方面鮮有報道,但其被證明具有一定程度的神經(jīng)活性。比如乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的過程中產(chǎn)生的NADH,能夠保護(hù)抑郁導(dǎo)致的神經(jīng)元發(fā)生障礙[20];外周注射L-乳酸能夠提高了小鼠海馬體內(nèi)Hes5的轉(zhuǎn)錄水平,激活Notch信號通路調(diào)節(jié)海馬體的神經(jīng)發(fā)生[21];此外,有研究表明在血清素相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)下,星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠在利用糖原過程中產(chǎn)生釋放乳酸鹽,并且乳酸鹽轉(zhuǎn)運到神經(jīng)元是長期記憶形成的必要因素[22]。

本研究還存在一些不足之處。首先使用代謝組學(xué)技術(shù)篩選出益生菌潛在的多種作用物質(zhì),基于小腸類器官建立了物質(zhì)與基因表達(dá)的互作量效關(guān)系,但時間和劑量的選擇范圍仍然偏窄。選擇作用時長短、時間間隔少、濃度梯度小的共培養(yǎng)方式均不能完全復(fù)現(xiàn)出益生菌與腸道細(xì)胞的動態(tài)互作關(guān)系。其次本文采用小腸類器官作為研究益生菌活性成分的模型,但是益生菌的作用部位主要在大腸。受技術(shù)所限,雖然小腸類器官是目前研究EC細(xì)胞的主要工具,但結(jié)腸類器官與益生菌共培養(yǎng)模式應(yīng)當(dāng)成為研究益生菌與宿主互作機制的第一選擇。

本研究首次采用腸道類器官技術(shù)來研究益生菌發(fā)揮生理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)并明確量效關(guān)系。發(fā)現(xiàn)短雙歧桿菌CCFM1025的發(fā)酵產(chǎn)物——L-乳酸、乙酸,能夠以劑量、時間依賴性顯著上調(diào)小鼠小腸類器官Tph1的基因表達(dá),促進(jìn)5-HT的生物合成。本文建立了益生菌特征性代謝產(chǎn)物與宿主互作的直接證據(jù),闡明了益生菌調(diào)節(jié)腸道5-HT合成的潛在分子機制,為同類功能新菌株的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。