代謝工程改造大腸桿菌生產(chǎn)氫咕啉酸

董寧,房歡,趙瑩,姜平濤,趙江華,4,張同存,張大偉*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)2(中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所,低碳合成工程生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津,300308)3(國家合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心,天津,300308)4(中國科學(xué)院大學(xué),北京,300192)5(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津,300457)

維生素B12,又名鈷胺素,是唯一含有金屬元素的維生素,也是結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的維生素。其主要包括氰鈷胺素、腺苷鈷胺素、甲鈷胺素和羥鈷胺素四類,其中腺苷鈷胺素和甲鈷胺素是生物體中具有活性的分子[1-2]。維生素B12只能通過細(xì)菌和古細(xì)菌生成,人體不能合成[3]。它是微生物代謝以及人類生長發(fā)育所必須的營養(yǎng)成分。工業(yè)生產(chǎn)維生素B12主要利用脫氮假單胞菌(Pseudomonasdenitrifican)、弗氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudennreichii)和苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)等微生物發(fā)酵[4-6]。而近幾年通過合成生物學(xué)和代謝工程技術(shù)構(gòu)建的大腸桿菌已經(jīng)可以用來生產(chǎn)維生素B12[7-8]。維生素B12作為生物體中DNA、氨基酸代謝等重要的輔酶,已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品行業(yè)。

氫咕啉酸(hydrogenobyrinic acid,HBA)外觀呈橙紅色,是維生素B12合成途徑中比較穩(wěn)定的中間體[9],合成途徑如圖1所示。提高HBA的產(chǎn)量對(duì)維生素B12產(chǎn)量提高有至關(guān)重要的作用。我們前期構(gòu)建了合成HBA的大腸桿菌工程菌[7-9],雖然產(chǎn)量較高,但是工程菌具有抗性,不利于生產(chǎn)。選擇穩(wěn)定、表現(xiàn)良好的宿主細(xì)胞對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)目的分子至關(guān)重要[10]。輔因子和前體途徑優(yōu)化、減少副產(chǎn)物合成是構(gòu)建工業(yè)微生物生產(chǎn)菌株的常用策略[11-13]。

圖1 維生素B12生物合成途徑Fig.1 Vitamin B12 biosynthetic pathway

本研究選取了6種不同的大腸桿菌作為宿主,分別是BL21(DE3)、BL21 Star(DE3)、MG1655(DE3)、BW25113(DE3)、JM109(DE3)和shuffie T7-K12。將HBA合成質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到上述6種大腸桿菌宿主細(xì)胞中,發(fā)酵并進(jìn)行HPLC檢測,發(fā)現(xiàn)BW25113(DE3)是最佳宿主。為了緩解質(zhì)粒表達(dá)對(duì)菌株所帶來的代謝負(fù)擔(dān),采取一系列代謝工程策略,如將HBA模塊整合到BW25113(DE3)基因組的hsdR基因位點(diǎn),引入合成前體尿卟啉原Ⅲ模塊,敲除代謝副產(chǎn)物乙酸合成基因ackA-pta,引入苜蓿中華根瘤菌和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵假單胞菌(Zymomonasmobilis)兩種來源的Entner-Doudoroff(ED)途徑提高還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)供給,得到了無抗生產(chǎn)HBA高產(chǎn)菌種,為下一步高產(chǎn)維生素B12工程菌的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與質(zhì)粒

論文中涉及的菌株見表1,質(zhì)粒見表2。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用菌株Table 1 Strains used in this study

表2 本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this study

1.1.2 引物

本實(shí)驗(yàn)所涉及的基因序列均來自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),使用Primer Premier 6或SnapGene設(shè)計(jì)所用引物,由北京擎科生物公司合成(表3)。

表3 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 3 Primers used in this study

1.1.3 主要培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母抽提物5,NaCl 10,pH 7.5,121 ℃滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基:在調(diào)好pH值的LB液體培養(yǎng)基加入15 g/L的瓊脂粉,121 ℃滅菌20 min。

TYGly培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5、胰蛋白胨10、KH2PO45、甘氨酸2、甘油10、琥珀酸10、甜菜堿15,用NaOH調(diào)節(jié)初始pH值至7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

培養(yǎng)基在接種前按需添加相應(yīng)抗生素,其中氨芐青霉素(ampicillin,Amp)質(zhì)量濃度為100 μg/mL,硫酸卡那霉素(kanamycin sulfate,Km)質(zhì)量濃度為50 μg/mL,氯霉素(chloramphenicol,Cm)質(zhì)量濃度為34 μg/mL。

1.1.4 儀器與設(shè)備

TC-XP-G PCR儀,BioER;EYETMII凝膠自動(dòng)成像儀,法國VILBER LOURMAT;V-1600可見分光光度計(jì),上海美譜達(dá)儀器有限公司;DYY-6c電泳儀,北京市六一儀器廠;HPX-9162 MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;ND 2000 NanoDrop超微量分光光度計(jì),Thermo Fisher;LDZX-50 KB立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HBA合成途徑與宿主適配篩選

1.2.1.1 HBA合成質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不同宿主細(xì)胞

將BL21(DE3)、BL21 Star(DE3)、MG1655(DE3)、BW25113(DE3)、JM109(DE3)和shuffie T7-K12六種菌株做成大腸桿菌化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài),將表達(dá)HBA合成途徑基因的質(zhì)粒pET28-HBA[7]分別轉(zhuǎn)化這6種不同的大腸桿菌宿主細(xì)胞中,挑取長出的菌落用YZ-RCcobH-F,YZ-RCcobH-R引物進(jìn)行驗(yàn)證,正確的轉(zhuǎn)化子接入終質(zhì)量濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h后保藏。

1.2.1.2 菌株生物量的測定

采用紫外分光光度法測定大腸桿菌生物量。取100 μL菌液,用無菌水稀釋合適倍數(shù),混勻后測定其在600 nm處的光密度(OD),測量生物量。待發(fā)酵結(jié)束后再次稀釋合適倍數(shù)測定大腸桿菌生物量。

1.2.1.3 發(fā)酵條件以及發(fā)酵樣品處理

從保藏這6種大腸桿菌的-80 ℃凍存管中取適量菌液分別劃線于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行活化,挑取新鮮的單菌落于含有卡那霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃、220 r/min搖床振蕩過夜培養(yǎng)。按照初始OD600值為0.05接種于含有終質(zhì)量濃度為50 μg/mL卡那霉素的50 mL TYGly發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中,在37 ℃,220 r/min條件下培養(yǎng),當(dāng)OD600值增長到0.8時(shí)加入1 mmol/L誘導(dǎo)劑IPTG,并將溫度調(diào)至32 ℃誘導(dǎo)T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá),待32 h發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行發(fā)酵樣品處理。

使用5 mL移液器取發(fā)酵液10 mL于15 mL離心管中,4 000 r/min離心10 min棄上清液,并用移液器吸干殘留液體。加去離子水,定容至2 mL,混勻菌體。蓋好離心管蓋后,將離心管放置于滅菌鍋100 ℃處理30 min。取出離心管,4 000 r/min離心10 min,轉(zhuǎn)移上清液于1.5 mL EP管中。13 000 r/min離心10 min,用1 mL注射器吸取上清液,通過0.22 μm的水系濾膜過濾至新的1.5 mL EP管。最后,吸取200 μL樣品通過HPLC檢測HBA的含量。

在發(fā)酵3、6、12、18、24、30、36 h取樣稀釋,測量OD600值,繪制生長曲線。

在發(fā)酵6、12、18、24、30、36 h取樣700 μL,離心取上清液,通過0.22 μm的水系濾膜過濾至新的1.5 mL EP管。最后,吸取200 μL樣品通過HPLC檢測乙酸的含量。

1.2.1.4 HPLC定量檢測HBA

在安裝有Agilent SB-aq柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)的Agilent 1260液相色譜儀上進(jìn)行分析。樣品進(jìn)樣量10 μL。液相條件參考FANG等[7]文獻(xiàn)報(bào)道。所用流動(dòng)相成分為:A相為1‰甲酸,B相為含有1‰甲酸的甲醇。流速1.0 mL/min,色譜柱溫度35 ℃,檢測波長329 nm。梯度洗脫條件:0～2 min,0～25% buffer B;2～4 min,25%～34% buffer B;4～12 min,34%～70% buffer B;12～17 min,70%～100% buffer B;17～23 min,100% buffer B;23～25 min,0～100% buffer B;25～27 min 0% buffer B。

1.2.1.5 HPLC定量檢測乙酸

在安裝有Bio-Red Aminex HPX-87H柱(7.8 mm×300 mm, 9 μm)的Agilent 1260液相色譜儀上進(jìn)行分析。樣品進(jìn)樣量20 μL。所用流動(dòng)相成分:C相5 mmol/L H2SO4,流速0.5 mL/min,色譜柱溫度60 ℃。

1.2.1.6 酶標(biāo)儀定量檢測ATP

在發(fā)酵6、12、18、24、30、36 h取樣200 μL,4 ℃、12 000 r/min離心2 min后棄上清液,采用上海碧云天生物技術(shù)有限公司ATP檢測試劑盒檢測,加入400 μL ATP裂解液進(jìn)行重懸,靜置5 min,4 ℃、12 000 r/min離心2 min,吸取上清液50 μL,滴入已在室溫放置5 min的含有100 μL ATP檢測工作液的Costar 96孔白色不透明板中,立刻混勻用Biotek Synergy HTX酶標(biāo)儀進(jìn)行發(fā)光檢測,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中胞內(nèi)ATP的濃度。按照文獻(xiàn)方法將OD600轉(zhuǎn)化為細(xì)胞干重(dry cell weight,DCW)并將ATP濃度換算成單位細(xì)胞干重的摩爾數(shù)[16]。

1.2.2 將HBA操縱子整合到基因組

將含有HBA合成途徑基因的質(zhì)粒pCas9-hsdR-HBAD[7]轉(zhuǎn)化目的菌株BW25113(DE3),加入終濃度為10 mmol/L的阿拉伯糖誘導(dǎo)Cas9和λ噬菌體Red重組酶表達(dá),誘導(dǎo)18 h后劃線到含有氨芐青霉素和阿拉伯糖的LB固體培養(yǎng)基的板子上,挑取長出的菌落進(jìn)行驗(yàn)證,驗(yàn)證且測序正確后接入無抗的LB培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)移到42 ℃、220 r/min搖床進(jìn)行傳代培養(yǎng)使質(zhì)粒丟失,影印后對(duì)HBA操縱子整合的位點(diǎn)進(jìn)行DNA測序,確保整合到目的菌株相應(yīng)的位點(diǎn)。

1.2.3ackA-pta基因的敲除

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的同源重組結(jié)合CRISPR-Cas9的方法進(jìn)行無痕敲除[17]。實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了敲除ackA-pta位點(diǎn)的Cas9質(zhì)粒[7]。基因組上ackA-pta基因的上下游與相應(yīng)的Cas9質(zhì)粒上序列設(shè)計(jì)成一致。再將相應(yīng)的Cas9質(zhì)粒導(dǎo)入到目的菌株化學(xué)轉(zhuǎn)化的感受態(tài)中,分別挑取單菌落于5 mL含有終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素中,在30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)2 h后,添加終濃度為10 mmol/L的阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)18 h后劃線于含有氨芐青霉素和阿拉伯糖的LB固體培養(yǎng)基的板子上,挑取長出的菌落用YZ-ackA-pta-F/R引物進(jìn)行驗(yàn)證,驗(yàn)證且測序正確后接入無抗的LB培養(yǎng)基中,在42 ℃、220 r/min搖床進(jìn)行傳代培養(yǎng)使Cas9質(zhì)粒丟失后保藏。

1.2.4S.meliloti和Z.mobilis兩種來源的ED途徑的整合

ED途徑的整合采用標(biāo)準(zhǔn)化基因編輯方法進(jìn)行(未發(fā)表)。在endA位點(diǎn)引入S.meliloti和Z.mobilis兩種來源的ED途徑,構(gòu)建了pDonor01-endA-SmED、pDonor01-endA-ZmED和pCas9g-endA三個(gè)質(zhì)粒。以引入S.meliloti來源的ED途徑為例,以MG1655基因組為模板,擴(kuò)增endA基因的上下游,并膠回收純化,得到片段endA-up和endA-dn。將endA-up與質(zhì)粒pMXLK-pFa進(jìn)行Golden Gate組裝,將endA-dn與質(zhì)粒pMXLK-bFq進(jìn)行Golden Gate組裝,化學(xué)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株,藍(lán)白斑篩選涂板后,挑取白色單菌落進(jìn)行驗(yàn)證,正確的轉(zhuǎn)化子接入終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的卡那霉素中培養(yǎng)12～16 h提質(zhì)粒并送測序,得到質(zhì)粒pMXLK-pFa-endA-up和pMXLK-bFq-endA-dn。

以YX18基因組為模板,分別擴(kuò)增edd、eda基因,膠回收純化,2片段與質(zhì)粒pMXLK-aFb進(jìn)行Golden Gate組裝后化學(xué)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,藍(lán)白斑篩選涂板,處理方法同上,得到質(zhì)粒pMXLK-aFb-SmED。其與pMXLK-pFa-endA-up、pMXLK-bFq-endA-dn和pDonor01共4個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行Golden Gate組裝,處理方法同上,得到質(zhì)粒pDonor01-endA-SmED。引物endA-N20-F、endA-N20-R退火后與質(zhì)粒pCas9gB進(jìn)行Golden Gate組裝。處理方法同上,得到質(zhì)粒pCas9g-endA。

向目的菌株中用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入pDonor01-endA-SmED、pCas9 g-endA,挑取單菌落于5 mL含有終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的氯霉素和50 μg/mL卡那霉素中,在30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)2 h后,添加終濃度為10 mmol/L的阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)18 h后劃線到含有氯霉素、卡那霉素和阿拉伯糖的LB固體培養(yǎng)基的板子上,挑取長出的菌落進(jìn)行驗(yàn)證,驗(yàn)證且DNA測序正確后丟雙質(zhì)粒后保藏。

2 結(jié)果與分析

2.1 氫咕啉酸合成途徑與宿主適配篩選

選擇合適的宿主是實(shí)現(xiàn)目的基因功能表達(dá)的關(guān)鍵,大腸桿菌因具有生長快和遺傳操作工具成熟等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用。有文獻(xiàn)報(bào)道,大腸桿菌是合成維生素B12的前體5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)的優(yōu)良菌種[18],具有代替?zhèn)鹘y(tǒng)菌種生產(chǎn)維生素B12的潛力。由于HBA操縱子是T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá),這里以6種含有T7RNA聚合酶的大腸桿菌作為篩選對(duì)象,即BL21(DE3)、BL21 Star(DE3)、MG1655(DE3)、BW25113(DE3)、JM109(DE3)和shuffie T7-K12。將含有HBA合成途徑的質(zhì)粒pET28-HBA[7]通過化學(xué)法轉(zhuǎn)化到這6種大腸桿菌中,進(jìn)行發(fā)酵和HPLC液相檢測,如圖2-a所示。

a-不同宿主HBA產(chǎn)量;b-不同宿主生長情況

BL21(DE3)和BL21 Star(DE3)作為宿主合成HBA的產(chǎn)量比較高,但是如圖2-b所示,生長曲線顯示它們的生物量過低,生物量太低會(huì)影響以后工業(yè)化生產(chǎn)。MG1655(DE3)作為宿主合成HBA的產(chǎn)量最低。BW25113(DE3)作為宿主的生物量和HBA產(chǎn)量都比較好,HBA的產(chǎn)量可以達(dá)到0.49 mg/L,OD600值為6.60。

2.2 HBA操縱子整合到染色體

為了避免質(zhì)粒表達(dá)給菌株造成代謝負(fù)擔(dān),利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)將HBA操縱子整合到BW25113(DE3)染色體hsdR位點(diǎn)上,菌株命名為BW01。將BW25113(DE3)和BW01進(jìn)行發(fā)酵以及HPLC檢測,如圖3所示。BW01的HBA產(chǎn)量得到顯著提高,從0.49 mg/L增長到6.38 mg/L,提升了12倍;去除質(zhì)粒后,細(xì)胞生長狀態(tài)有了明顯改善,OD600值從6.60增長到18.58。

圖3 HBA操縱子質(zhì)粒表達(dá)與染色體表達(dá)菌株發(fā)酵結(jié)果Fig.3 Fermentation results of strains HBA operon expressed on plasmid or chromosome

2.3 加強(qiáng)前體供應(yīng)

在此之前,我們對(duì)大腸桿菌進(jìn)行了生產(chǎn)維生素B12的代謝工程研究,尿卟啉原III是HBA合成的重要前體物質(zhì)[7]。為避免因工程菌株前體供應(yīng)不充足,導(dǎo)致HBA的發(fā)酵質(zhì)量濃度以及生產(chǎn)強(qiáng)度低下,通過優(yōu)化前體尿卟啉原III供應(yīng)來解除限制,進(jìn)而提高大腸桿菌HBA合成能力。將生成尿卟啉原III的前體模塊整合到基因組PBAD位點(diǎn),得到菌株BW02,進(jìn)行發(fā)酵以及HPLC檢測,如圖4所示。HBA的產(chǎn)量從6.38 mg/L增長到11.61 mg/L,提高了82%,OD600值達(dá)到19.95。

圖4 加強(qiáng)前體供應(yīng)的菌株HBA生產(chǎn)Fig.4 HBA production of strains with enhanced precursor supply

2.4 ackA-pta基因缺失

Pta-AckA途徑在大腸桿菌體內(nèi)初級(jí)代謝過程中具有重要的作用[19],生成輔酶A,促進(jìn)糖酵解和三羧酸循環(huán),是生物體內(nèi)能量代謝的重要組成部分。中間產(chǎn)物乙酰磷酸可以使丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酸,大腸桿菌好氧發(fā)酵時(shí)會(huì)積累乙酸。乙酸作為副產(chǎn)物持續(xù)累積可能對(duì)HBA產(chǎn)量有所影響[12]。所以敲除磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因(phosphotransacetylase,pta)與乙酸激酶基因(acetokinase,ackA),破壞Pta-AckA途徑,得到BW03菌株。通過菌株搖瓶發(fā)酵和HPLC檢測,分析ackA-pta基因的失活對(duì)生長代謝和HBA產(chǎn)量的影響,如圖5-a和圖5-b所示。發(fā)現(xiàn)ackA-pta缺失后OD600值略有降低,乙酸生成量大幅降低,BW02、BW03菌株最大乙酸生成量分別為6.82和4.38 g/L。雖然敲除ackA-pta會(huì)降低乙酸積累量,但是對(duì)HBA合成不利,產(chǎn)量從11.61 mg/L下降到8.65 mg/L,可能因?yàn)榍贸齛ckA-pta的同時(shí),腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)供給減少,影響了合成HBA所需前體S-腺苷甲硫氨酸的合成。對(duì)2株菌的胞內(nèi)ATP進(jìn)行定量,如圖5-c所示,發(fā)現(xiàn)除了發(fā)酵6 h以外,敲除ackA-pta基因后ATP含量的確會(huì)有所降低。綜合來看,ATP比乙酸對(duì)HBA合成影響更大。因此放棄敲除ackA-pta,選擇BW02菌株進(jìn)行后續(xù)改造。

2.5 兩種來源ED途徑的引入

糖酵解(embden-meyerhof-parnas,EMP)途徑、磷酸戊糖途徑、ED途徑和磷酸轉(zhuǎn)酮酶途徑是主要的碳代謝途徑[20]。ED途徑主要由兩個(gè)反應(yīng)組成。第一個(gè)是由6-磷酸葡萄糖酸脫水酶(6-phosphogluconate dehydrase,EDD)催化,產(chǎn)生2-酮-3-脫氧葡萄糖酸-6-磷酸(2-keto-3-deoxygluconic acid 6-phosphate,KDPG)。第二反應(yīng)由酮-3-脫氧葡萄糖酸-6-磷酸縮醛酶(keto-3-deoxygluconic acid -6- phosphate acetalase,EDA)催化,產(chǎn)生丙酮酸和甘油醛3-磷酸。與EMP途徑相比,ED途徑的蛋白質(zhì)需求減少72%,同時(shí)提供的ATP減少一個(gè)[21]。EMP途徑只能合成NADH,不能合成NADPH,而ED途徑可以合成1個(gè)NADPH。從ALA每合成1分子維生素B12需要消耗10分子的NADPH[22]。大腸桿菌內(nèi)源的ED途徑過弱,通過引入外源的ED途徑有可能提高維生素B12合成中間體HBA產(chǎn)量。

S.meliloti是天然生產(chǎn)維生素B12的菌株,為研究天然生產(chǎn)維生素B12菌株中ED途徑的引入對(duì)HBA產(chǎn)量的影響,構(gòu)建了S.meliloti來源的ED途徑的質(zhì)粒。有研究發(fā)現(xiàn),在大腸桿菌MG1655中引入Z.mobilis來源的ED途徑,NADPH再生率提高了25倍[23],于是又構(gòu)建了Z.mobilis來源的ED途徑的質(zhì)粒。因此,選擇在BW02菌株endA位點(diǎn)分別整合S.meliloti來源和Z.mobilis來源的ED途徑,分別得到菌株BW04和BW05。以BW02菌株為對(duì)照菌株,發(fā)酵以及HPLC檢測,如圖6所示。

圖6 兩種來源ED途徑引入菌株的HBA生產(chǎn)Fig.6 HBA production of strains with two sources of ED pathways

由圖6可知,BW04產(chǎn)量有所下降,從11.61 mg/L下降到10.60 mg/L,分析原因可能是S.meliloti來源的ED途徑基因的基因表達(dá)水平不平衡導(dǎo)致的[24]。BW05的HBA產(chǎn)量從11.61 mg/L增加到14.60 mg/L。說明Z.mobilis來源的ED途徑引入對(duì)HBA產(chǎn)量的提高有較大幫助。

3 結(jié)論與討論

大腸桿菌是替代現(xiàn)有維生素B12生產(chǎn)菌種的非常有競爭力的菌種,利用無抗菌株生產(chǎn)維生素B12是未來的發(fā)展方向。本文在篩選最佳的合成HBA的宿主BW25113(DE3)基礎(chǔ)上采取多個(gè)代謝工程策略,整合HBA和前體合成途徑基因后HBA產(chǎn)量提高到11.61 mg/L,由于擺脫了質(zhì)粒對(duì)宿主帶來的代謝負(fù)擔(dān),OD600值從6.60提高到20.55。敲除乙酸合成基因ackA-pta不利于HBA合成,表達(dá)Z.mobilis來源的ED途徑基因后HBA產(chǎn)量最終達(dá)到14.60 mg/L。本研究所構(gòu)建的無質(zhì)粒重組菌發(fā)酵過程中無需添加抗生素,節(jié)省了產(chǎn)品分離提取的成本,對(duì)生產(chǎn)更有利,具有工業(yè)應(yīng)用潛力。

大腸桿菌好氧發(fā)酵有2條產(chǎn)生乙酸途徑:一是在乙酸激酶(acetokinase,ACK)和磷酸轉(zhuǎn)乙?；?phosphotransacetylase,PTA)作用下由乙酰CoA生成乙酸,主要在對(duì)數(shù)期起作用;另一條是在丙酮酸氧化酶的作用下由丙酮酸直接生成乙酸(PoxB途徑),主要在對(duì)數(shù)后期和平臺(tái)期其作用[25]。直接敲除ackA-pta不利于HBA合成暗示對(duì)于乙酸代謝途徑的控制要和HBA合成對(duì)ATP的需求相協(xié)調(diào),這樣才能達(dá)到既控制了乙酸積累量又提高HBA產(chǎn)量。由于合成HBA需要消耗大量NADPH,引入了Z.mobilis和S.meliloti來源ED途徑,但表達(dá)S.meliloti來源ED途徑基因后HBA產(chǎn)量有所下降,從11.61 mg/L下降到10.60 mg/L,分析原因可能是S.meliloti來源的ED途徑基因的基因表達(dá)水平不平衡導(dǎo)致的。

本研究在乙酸代謝和ED途徑進(jìn)行了初步改造,接下來工作包括:為避免敲除基因影響過大,精準(zhǔn)弱化ackA-pta或poxB基因,平衡乙酸生成和ATP供給;弱化糖酵解途徑以提高ED途徑代謝流,為維生素B12合成提供充足的NADPH;繼續(xù)在染色體上整合維生素B12下游合成途徑基因獲得生產(chǎn)維生素B12的工程菌。