氨基脫氧分支酸合成酶對(duì)谷氨酸棒桿菌生長(zhǎng)和產(chǎn)L-絲氨酸的影響

劉安倩,顏文斌,肖文翰,張曉梅*,史勁松,許正宏

1(江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214112)2(宜興市食品與生物技術(shù)研究院,江蘇 無(wú)錫,214122)3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214112)4(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)

L-絲氨酸被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及化妝品等領(lǐng)域。目前,全球L-絲氨酸需求量約為3 000 t,市場(chǎng)價(jià)格約為20萬(wàn)元/t[1-4]。L-絲氨酸也是世界氨基酸行業(yè)中工業(yè)化生產(chǎn)難度較大的氨基酸。目前國(guó)內(nèi)多采用蛋白水解法工業(yè)化生產(chǎn),該方法引起的環(huán)境污染問(wèn)題不容忽視[5]。微生物利用廉價(jià)的糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸正成為研究熱點(diǎn)[6]。

目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-絲氨酸的研究主要集中于谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌[1-6]。MUNDHADA等[7-8]將大腸桿菌進(jìn)行代謝改造及適應(yīng)性進(jìn)化,經(jīng)補(bǔ)料分批發(fā)酵,L-絲氨酸的產(chǎn)量達(dá)到50 g/L。谷氨酸棒桿菌是FDA認(rèn)可生產(chǎn)食品及藥品的安全菌株[9-10],L-絲氨酸在谷氨酸棒桿菌中的代謝涉及3個(gè)合成途徑關(guān)鍵酶和2個(gè)降解途徑關(guān)鍵酶[11],即甘油酸脫氫酶(PGDH,編碼基因serA)、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(PSAT,編碼基因serC)和磷酸絲氨酸磷酸化酶(PSP,編碼基因serB)[8];絲氨酸脫氫酶(SerDH,編碼基因sdaA)及絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT,編碼基因glyA)[12]。目前對(duì)L-絲氨酸重組菌株的構(gòu)建集中于合成途徑關(guān)鍵酶的加強(qiáng)表達(dá)與降解途徑關(guān)鍵酶的敲除,同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)降解途徑關(guān)鍵酶SHMT對(duì)L-絲氨酸產(chǎn)量影響最為重要[3,12],而在谷氨酸棒桿菌中敲除SHMT會(huì)導(dǎo)致菌株無(wú)法生長(zhǎng)。德國(guó)PETERS-WENDISCH研究發(fā)現(xiàn),在L-絲氨酸合成過(guò)程中,四氫葉酸(tetrahydrogen folic acid,THFA)是SHMT的輔酶,pabAB編碼的氨基脫氧分支酸合成酶(aminodeoxychorismate synthase,ADC synthase)是葉酸合成途徑的關(guān)鍵酶,他們通過(guò)敲除pabAB減少輔酶構(gòu)建了重組菌,但是該重組菌為葉酸缺陷型,在添加0.1 mmol/L葉酸時(shí)L-絲氨酸的產(chǎn)量為8.51 g/L,在20 L發(fā)酵罐L-絲氨酸的最終產(chǎn)量為36.26 g/L[3-4]。本課題組以1株能夠直接利用糖發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌SSAAI為出發(fā)菌株[13],通過(guò)常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變得到高產(chǎn)突變菌株A36[14],對(duì)出發(fā)菌株SSAAI和突變菌株A36進(jìn)行全基因組測(cè)序及比較基因組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)菌株A36中葉酸代謝途徑關(guān)鍵酶氨基脫氧分支酸合成酶編碼基因pabAB426位發(fā)生突變(T426I),而氨基脫氧分支酸合成酶基因突變對(duì)酶活力、菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)L-絲氨酸影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

本文在以谷氨酸棒桿菌SSAAI及其誘變菌株A36作為研究對(duì)象,根據(jù)誘變前后基因測(cè)序的結(jié)果對(duì)SSAAI中氨基脫氧分支酸合成酶編碼基因pabAB426位進(jìn)行定點(diǎn)突變(T426I),構(gòu)建突變重組菌Kp,通過(guò)酶活力及發(fā)酵實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)pabAB基因點(diǎn)突變對(duì)酶活力、菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)L-絲氨酸的影響。同時(shí)采用不同強(qiáng)度啟動(dòng)子替換高產(chǎn)菌株A36中氨基脫氧分支酸合成酶的啟動(dòng)子,考察調(diào)控氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)L-絲氨酸的影響,為進(jìn)一步構(gòu)建L-絲氨酸高產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和引物

產(chǎn)L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌SSAAI與突變菌株A36為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保藏[15-17],敲除質(zhì)粒pK18 mobsacB和大腸桿菌JM109為本實(shí)驗(yàn)室保藏。本文所用引物如表1,所用菌株與質(zhì)粒如表2所示。所用重組酶購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司,膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司。限制性內(nèi)切酶EcoR I,XbaI,NdeI,BamH I和BglII購(gòu)于TaKaRa公司。

表1 本文使用的引物Table 1 Primers used in this paper

表2 本文使用的菌株與質(zhì)粒Table 2 Strains and plasmids used in this paper

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

(1)種子固體培養(yǎng)基(g/L):腦心浸液(brain heart infusion,BHI) 37,葡萄糖20,(NH4)2SO410,K2HPO40.2,NaH2PO40.3,MgSO4·7H2O 0.5,瓊脂粉20。

(2)種子液體培養(yǎng)基(g/L):BHI 37,葡萄糖20,(NH4)2SO410,K2HPO40.2,NaH2PO40.3,MgSO4·7H2O 0.5;裝液量20 mL/250 mL三角瓶。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖100,(NH4)2SO430,KH2PO43,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 0.02,MnSO4·H2O 0.02,原兒茶酸(PCA) 0.03,生物素5×10-5,維生素B14.5×10-4,CaCO360。

(4)培養(yǎng)方法:挑取種子接種至種子液體培養(yǎng)基中,于30 ℃,120 r/min往復(fù)式搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中,裝液量為25 mL/250 mL三角瓶,初始OD562值約為1,于30 ℃,120 r/min往復(fù)式搖床培養(yǎng)120 h,每隔12 h取樣測(cè)定生物量及L-絲氨酸產(chǎn)量。

1.3 pabAB基因定點(diǎn)突變質(zhì)粒構(gòu)建

以菌株A36的基因組為模板,選擇pabAB基因點(diǎn)突變前500 bp和后500 bp為擴(kuò)增目標(biāo),利用引物pabAB-F、pabAB-R擴(kuò)增含點(diǎn)突變的同源臂基因片段。通過(guò)單片段同源重組酶將含同源臂的目的片段與經(jīng)EcoRI和XbaI雙酶切的質(zhì)粒pK18 mobsacB連接,構(gòu)建定點(diǎn)突變質(zhì)粒。

1.4 替換啟動(dòng)子質(zhì)粒的構(gòu)建

以替換pabAB啟動(dòng)子為Pkan為例,采用質(zhì)粒pK18 mobsacB,以A36的基因組為模板,分別利用pK-18-Pkan-1/2,pK-18-Pkan-3/4(引物上設(shè)計(jì)替換啟動(dòng)子序列)分別擴(kuò)增除去pabAB啟動(dòng)子的上下游同源臂片段,片段與酶切過(guò)的質(zhì)?；厥辗椒ň唧w見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū),回收得到的上下游同源片段用多片段同源重組酶與經(jīng)EcoR I和XbaI雙酶切的質(zhì)粒pK18 mobsacB連接得到重組質(zhì)粒。

1.5 氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力測(cè)定

總蛋白濃度的測(cè)定:參照碧云天的Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒所示方法,對(duì)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白濃度與OD曲線方程為y=0.575 2x+0.461,R2=0.996 1。

氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力測(cè)定:采用科晶生物科技有限公司氨基脫氧分支酸合成酶ELISA試劑盒進(jìn)行酶活力測(cè)定,酶活力與OD曲線方程為y=0.101 3x-0.005 3,R2=0.998。菌液于4 ℃,12 000 r/min離心10 min,用0.9%的生理鹽水清洗3～4次,除去培養(yǎng)基,稱取菌體約0.25 g,用5 mL 0.9%的生理鹽水充分懸浮菌體,使用超聲波破碎約30 min,4 ℃,12 000 r/min離心10 min,棄去沉淀取上清液,將上清液稀釋一定倍數(shù),采用Synergy H4多功能酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到對(duì)應(yīng)的酶活力。

1.6 分析方法

生物量的測(cè)定:采用1 mol/L的鹽酸稀釋發(fā)酵液至適當(dāng)濃度,然后利用紫外分光光度計(jì)于562 nm處測(cè)定OD562值作為生物量。

L-絲氨酸的測(cè)定:采用HPLC測(cè)定樣品中L-絲氨酸的含量[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基脫氧分支酸合成酶編碼基因pabAB突變菌株的構(gòu)建

以谷氨酸棒桿菌SSAAI及其誘變菌株A36作為研究對(duì)象,根據(jù)誘變前后基因測(cè)序的結(jié)果對(duì)SSAAI中氨基脫氧分支酸合成酶編碼基因pabAB426位進(jìn)行定點(diǎn)突變(T426I),構(gòu)建突變重組菌Kp。即以菌株A36基因組為模板,利用相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增相應(yīng)基因片段pabAB,擴(kuò)增片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證;將線性化的pK18 mobsacB質(zhì)粒連接pabAB基因片段構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞;提取質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,并將擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌SSAAI,電泳驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示,經(jīng)過(guò)測(cè)序比對(duì),成功獲得pabAB突變株,將其命名為Kp。

M-Marker;1-pabAB PCR片段

菌株A36是本課題組前期對(duì)出發(fā)菌株SSAAI進(jìn)行ARTP誘變結(jié)合高通量篩選得到的高產(chǎn)突變株,其生物量和L-絲氨酸產(chǎn)量比出發(fā)菌株SSAAI均有提高[13-14]。本課題組通過(guò)對(duì)突變菌株A36與出發(fā)菌株SSAAI進(jìn)行全基因組測(cè)序及比較基因組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)誘變菌株A36中有11個(gè)基因發(fā)生非同義突變,分別為假定的轉(zhuǎn)座酶編碼基因K07497、UPF0176和K07146,腺苷琥珀酸裂解酶編碼基因purB,假定的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因ABC.CD.P,內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因rhtA,酪氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因tyrP,DNA氧化脫甲基酶編碼基因alkB,ATP結(jié)合蛋白編碼基因cydC,脂肪酸合酶編碼基因fas,葉酰聚谷氨酸合酶編碼基因folC以及氨基脫氧分支酸合成酶編碼基因pabAB[7]。其中pabAB編碼的氨基脫氧分支酸合成酶是葉酸合成途徑的關(guān)鍵酶,其與L-絲氨酸降解密切相關(guān),PETERS-WENDISCH通過(guò)敲除pabAB構(gòu)建的重組菌L-絲氨酸的產(chǎn)量有顯著提高[3-4],而氨基脫氧分支酸合成酶基因突變對(duì)酶活力、菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)L-絲氨酸的影響有待進(jìn)一步研究。

2.2 pabAB基因點(diǎn)突變對(duì)其酶活力的影響

出發(fā)菌株SSAAI及其突變株Kp在發(fā)酵60 h(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)和120 h(發(fā)酵結(jié)束)時(shí)氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力如圖2所示。從圖2-a可以看出,在60 h時(shí),出發(fā)菌株SSAAI與pabAB突變株Kp的比酶活力分別為1.45和1.23 U/g,突變株Kp的比酶活比SSAAI下降15.2%。從圖2-b可以看出,在120 h時(shí),出發(fā)菌株SSAAI與定點(diǎn)突變株Kp的比酶活力分別為0.59和0.51 U/g,定點(diǎn)突變后氨基脫氧分支酸合成酶的比酶活下降13.6%;說(shuō)明pabAB基因426位的點(diǎn)突變(T426I)導(dǎo)致其酶活力下降。

a-60 h;b-120 h

本課題組前期研究比較了產(chǎn)L-絲氨酸的谷氨酸棒桿菌SYPS-062以及模式菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中氨基脫氧分支酸合成酶的活力,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)L-絲氨酸菌株中該酶的比活力比模式菌株低46.6%;同時(shí)采用反義RNA技術(shù)下調(diào)控葉酸合成關(guān)鍵酶基因pabAB的表達(dá),構(gòu)建的重組菌與出發(fā)菌株SYPS-062相比生長(zhǎng)緩慢,L-絲氨酸產(chǎn)量卻有所提高[18]。這些研究說(shuō)明氨基脫氧分支酸合成酶與菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)L-絲氨酸密切相關(guān)。

2.3 pabAB基因定點(diǎn)突變對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)L-絲氨酸的影響

pabAB基因426位的點(diǎn)突變(T426I)對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)L-絲氨酸的影響如圖3所示。從圖3-a可以看出,突變菌株Kp在120 h時(shí)最大OD562為32,比出發(fā)菌株SSAAI下降29.3%。從圖3-b可以看出,突變菌株Kp在0～36 h時(shí)的比生長(zhǎng)速率高于出發(fā)菌株SSAAI,但在36～120 h則顯著低于出發(fā)菌株SSAAI。

出發(fā)菌株SSAAI及其突變菌株KpL-絲氨酸產(chǎn)量情況如圖3-c所示。從圖3-c可以看出,突變株Kp的L-絲氨酸產(chǎn)量為30.4 g/L,而出發(fā)菌株SSAAI的L-絲氨酸產(chǎn)量為26.25 g/L;說(shuō)明pabAB基因426位的點(diǎn)突變(T426I)導(dǎo)致L-絲氨酸產(chǎn)量有所提高。從圖3-c還可以看出,與出發(fā)菌株SSAAI相比,在發(fā)酵前期,Kp菌株L-絲氨酸產(chǎn)量變化不明顯;而在發(fā)酵72 h后,L-絲氨酸產(chǎn)量逐漸提高,最終突變菌株Kp的L-絲氨酸產(chǎn)量提高15.9%。

以上研究表明,氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力降低有利于產(chǎn)L-絲氨酸,而不利于菌株生長(zhǎng)。該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室前期及PETERS-WENDISCH的研究結(jié)果相一致[4],pabAB基因單點(diǎn)突變導(dǎo)致的酶活力及菌株生長(zhǎng)變化為其他研究提供了參考。

2.4 調(diào)控氨基脫氧分支酸合成酶對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)L-絲氨酸的影響

采用不同強(qiáng)度啟動(dòng)子在L-絲氨酸高產(chǎn)突變株A36中調(diào)控氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力,考察其對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)L-絲氨酸的影響。首先登陸http://www.fruitfly.org/seq-tools/ promoter.html在線網(wǎng)站,預(yù)測(cè)基因氨基脫氧分支酸合成酶的啟動(dòng)子,然后在已報(bào)道谷氨酸棒桿菌啟動(dòng)子庫(kù)中選取強(qiáng)度不同的兩個(gè)啟動(dòng)子(啟動(dòng)子強(qiáng)度差異如圖4-a所示)替換菌株A36中氨基脫氧分支酸合成酶的啟動(dòng)子。

從圖4-a可以看出,啟動(dòng)子Pkan強(qiáng)度明顯弱于啟動(dòng)子Dap-e。利用pK18 mobsacB-Pkan/Dap-e敲除質(zhì)粒在A36上進(jìn)行pabAB啟動(dòng)子的替換,得到重組菌株A36-Pkan和A36-Dap-e。菌株在120 h時(shí)氨基脫氧分支酸合成酶的比酶活力測(cè)定結(jié)果如圖4-b所示,重組菌株A36-Pkan和A36-Dap-e的氨基脫氧分支酸的比酶活力比出發(fā)菌株A36分別提高16.9%和32.6%。而采用啟動(dòng)子Dap-e替換導(dǎo)致重組菌株A36-Dap-e平均蛋白濃度有所下降,分析原因可能是蛋白測(cè)定過(guò)程中細(xì)胞的破碎程度不完全一致所導(dǎo)致;盡管總蛋白含量偏低,但是替換后氨基脫氧分支酸合成酶的總酶活力及比酶活力仍然較高。

重組菌株A36-Pkan和A36-Dap-e發(fā)酵結(jié)果如圖5所示。從圖5-a可以看出,重組菌株A36-Pkan和A36-Dap-e的最大OD562值比出發(fā)菌株A36分別提高8.3%和16%。從圖5-b可以看出,重組菌株A36-Pkan在96 h前L-絲氨酸積累量高于A36,96 h后開(kāi)始下降,發(fā)酵120 h時(shí)L-絲氨酸下降18.2%;重組菌株A36-Dap-e在72 h前L-絲氨酸積累量高于A36,在72 h時(shí)開(kāi)始下降,發(fā)酵120 h時(shí)L-絲氨酸的積累量下降22.6%。

a-菌株生長(zhǎng)的;b-L-絲氨酸產(chǎn)量

以上研究結(jié)果說(shuō)明,較高的氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力有利于菌株生長(zhǎng),但不利于菌株生產(chǎn)L-絲氨酸;該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室前期及PETERS-WENDISCH的研究結(jié)果相一致[4,18]。盡管本文采用了實(shí)驗(yàn)室保藏的最弱的啟動(dòng)子Pkan替換改造了菌株A36,但是啟動(dòng)子替換后氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力仍然比A36高,說(shuō)明谷氨酸棒桿菌A36氨基脫氧分支酸合成酶的啟動(dòng)子強(qiáng)度較弱,這也為谷氨酸棒桿菌提供了新的可以選擇的弱啟動(dòng)子。有研究表明啟動(dòng)子強(qiáng)度受到背景基因的影響較大,同時(shí)基因表達(dá)還受到多元件的協(xié)同調(diào)控[19-22]。今后可以研究采用多元件調(diào)控氨基脫氧分支酸合成酶,為構(gòu)建高產(chǎn)L-絲氨酸的菌株奠定基礎(chǔ)。

3 結(jié)論與討論

本文以谷氨酸棒桿菌SSAAI及其誘變菌株A36為研究對(duì)象,根據(jù)誘變前后基因測(cè)序的結(jié)果對(duì)SSAAI中氨基脫氧分支酸合成酶編碼基因pabAB426位進(jìn)行定點(diǎn)突變(T426I),研究該突變對(duì)酶活力、L-絲氨酸產(chǎn)量及菌株生長(zhǎng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)氨基脫氧分支酸合成酶426位的T426I突變導(dǎo)致酶比活力下降,同時(shí)發(fā)現(xiàn)該點(diǎn)突變有利于菌株產(chǎn)L-絲氨酸,不利于菌株生長(zhǎng)。進(jìn)一步選擇不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子調(diào)控高產(chǎn)菌株A36中氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)弱啟動(dòng)子Pkan替換后氨基脫氧分支酸合成酶的酶活力仍然比A36高,說(shuō)明菌株A36中氨基脫氧分支酸合成酶的啟動(dòng)子強(qiáng)度更弱。本研究的結(jié)果為谷氨酸棒桿菌提供了新的可以選擇的弱啟動(dòng)子,同時(shí)為進(jìn)一步構(gòu)建L-絲氨酸高產(chǎn)菌株奠定了基礎(chǔ)。