大孔樹(shù)脂吸附法對(duì)鰱魚(yú)皮膠原肽脫腥脫苦的作用效果

梁芮涵,李博

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京,100083)

鰱魚(yú)作為一種被廣泛養(yǎng)殖的淡水魚(yú)類,2021年產(chǎn)量已達(dá)到381.29萬(wàn)t[1],而鰱魚(yú)由于肉薄刺多、土腥味重等特點(diǎn),通常被加工成魚(yú)糜制品[2]。在魚(yú)糜加工中,會(huì)產(chǎn)生大量的魚(yú)皮、魚(yú)骨等副產(chǎn)物,其中含有豐富的膠原蛋白,含量約占粗蛋白的80%左右[3]。目前,對(duì)鰱魚(yú)副產(chǎn)物的高值化利用主要是在提取膠原蛋白(明膠)的基礎(chǔ)上采用酶解法制備各種膠原活性肽。膠原蛋白經(jīng)不同的蛋白酶水解后會(huì)得到具有抗氧化[2]、促鈣吸收[4]、抗皮膚老化、抗血小板聚集[5]等多種活性的膠原肽,從而開(kāi)發(fā)成不同用途的功能性食品。但是在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)膠原酶解物往往帶有感官難以接受的腥味,主要是來(lái)源于原料中脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的揮發(fā)性醛類、酮類、酯類等物質(zhì)[6];同時(shí)在酶解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量肽、氨基酸及呈味核苷酸等[7],其中疏水性氨基酸和低分子苦味肽[8]也會(huì)使膠原肽溶液帶有一定的苦味。這些不良?xì)馕逗妥涛断拗屏四z原肽在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

目前研究人員嘗試了活性炭吸附[9]、β-環(huán)糊精包埋[10]、有機(jī)溶劑提取[11]、大孔樹(shù)脂吸附[12]等許多方法用于脫除多肽產(chǎn)品的不良風(fēng)味。然而,一些活性肽可能會(huì)因此產(chǎn)生損失從而造成生物活性的下降。陳軒[13]發(fā)現(xiàn)活性炭對(duì)鰱魚(yú)抗氧化肽有較好的脫腥效果,但脫腥后抗氧化活性下降25.38%;胡凌豪[14]采用大孔樹(shù)脂吸附法對(duì)鳳尾魚(yú)蛋白肽脫腥,脫腥前后促嗜熱鏈球菌增殖活性無(wú)顯著性差異,同時(shí)發(fā)現(xiàn)也有一定的脫色效果。總的來(lái)說(shuō),針對(duì)不同的活性肽應(yīng)該選擇不同的脫腥方式以期減少活性的損失。本文前期研究發(fā)現(xiàn)鰱魚(yú)皮膠原肽(silver carp skin collagen peptides, SCP)具有良好的抗血小板活性,但是帶有難以接受的腥味和一定程度的苦味,限制了其在功能食品中的應(yīng)用。因此本文對(duì)SCP脫腥和脫苦的品質(zhì)提升技術(shù),以及對(duì)抗血小板活性的影響進(jìn)行重點(diǎn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚(yú)皮明膠(食品級(jí)),上海即景生物科技有限公司;復(fù)合蛋白酶(1.5 AU/g,食品級(jí)),丹麥諾維信公司;SD大鼠(雄性,8周齡,280～300 g),北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、福林酚試劑,北京索萊寶公司;戊巴比妥鈉、色譜級(jí)乙腈、異硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate,PITC)、三乙胺,美國(guó)Sigma公司;活性炭、硅藻土,食品級(jí),河南博旭環(huán)?？萍加邢薰?β-環(huán)糊精,食品級(jí),河南萬(wàn)邦化工科技有限公司;大孔樹(shù)脂XAD-1600、大孔樹(shù)脂XAD-7HP,北京慧德易科技有限公司;大孔樹(shù)脂AB-8,山東東鴻化工有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004萬(wàn)分之一電子天平,HANGPING公司;HZS-HA恒溫水浴振蕩器,哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;FiveEasy pH計(jì),梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;UV-5100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;TGL-185高速離心機(jī),長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司;LBY-NJ4血小板聚集儀,北京普利生有限公司;LGJ-18冷凍干燥機(jī),北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;LC-15C高效液相色譜系統(tǒng),日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鰱魚(yú)皮膠原肽的制備

參考文獻(xiàn)[5]的方法,將鰱魚(yú)皮明膠與蒸餾水按1∶10(g∶mL)混合均勻,沸水浴加熱40 min進(jìn)行明膠的溶解,冷卻至室溫后,用1 mol/L的NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。將明膠溶液置于60 ℃恒溫水浴振蕩器內(nèi)預(yù)溫15 min后,按照2.0%酶與底物比(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的添加量向明膠溶液中加入復(fù)合蛋白酶啟動(dòng)酶解反應(yīng),酶解6.0 h后沸水加熱10 min進(jìn)行滅酶和簡(jiǎn)單的殺菌,于25 ℃下4 000 r/min離心15 min取上清液,即為SCP,于4 ℃貯藏備用。

1.3.2 活性炭吸附

將活性炭置于燒杯中,倒入l%(體積比)鹽酸浸泡12.0 h后,用熱去離子水清洗,然后濾干,置于120 ℃下干燥8.0 h,完成活性炭清洗活化過(guò)程[15],冷卻至室溫備用。參考ZHANG等[16]的實(shí)驗(yàn)方法,稱取0.1 g活性炭加入到10 mL SCP溶液中,40 ℃水浴振蕩30 min,結(jié)束后立即在4 000 r/min離心15 min去除活性炭,上清液于4 ℃貯藏備用。

1.3.3 β-環(huán)糊精包埋

參考ZHANG等[16]的實(shí)驗(yàn)方法。稱取0.1 g β-環(huán)糊精加入到10 mL SCP溶液中,50 ℃下水浴振蕩30 min,得到脫苦脫腥鰱魚(yú)皮膠原肽(silver carp skin collagen peptides after deodorization and debittering,d-SCP)溶液,降低至室溫后于4 ℃貯藏備用。

1.3.4 硅藻土吸附

參考ZHANG等[16]的實(shí)驗(yàn)方法。稱取0.1 g硅藻土加入到10 mL SCP溶液中,50 ℃水浴振蕩30 min后立即使用濾紙過(guò)濾,收集d-SCP濾液,于4 ℃貯藏備用。

1.3.5 大孔樹(shù)脂吸附

使用無(wú)水乙醇浸泡大孔樹(shù)脂24.0 h,抽濾除去乙醇,蒸餾水反復(fù)洗滌至沒(méi)有醇味。用1 mol/L NaOH溶液浸泡5.0 h,抽濾后用蒸餾水反復(fù)洗滌至pH 7.0,再用1 mol/L HCl溶液浸泡5.0 h,抽濾后用蒸餾水反復(fù)洗滌至pH 7.0,完成對(duì)大孔樹(shù)脂的預(yù)處理[17]。最后抽濾得到濕潤(rùn)狀態(tài)的樹(shù)脂,自封袋密封,常溫貯藏備用。參考陳增鑫等[18]的實(shí)驗(yàn)方法,稱取0.5 g預(yù)處理后的XAD-1600、AB-8、XAD-7HP三種型號(hào)的大孔樹(shù)脂,加入到10 mL SCP溶液中在30 ℃水浴振蕩1.5 h。結(jié)束后立即使用濾紙過(guò)濾,收集d-SCP濾液,于4 ℃貯藏備用。

1.3.6 大孔樹(shù)脂AB-8靜態(tài)吸附單因素試驗(yàn)

根據(jù)初篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以d-SCP溶液腥味值、苦味值及肽損失率為指標(biāo)對(duì)大孔樹(shù)脂AB-8吸附條件進(jìn)行單因素試驗(yàn),步驟同1.3.5節(jié)。固定每10 mL SCP溶液添加量0.7 g樹(shù)脂,吸附溫度30 ℃,吸附時(shí)間1.5 h,膠原肽溶液pH 6.0,通過(guò)改變單一條件考察樹(shù)脂添加量(0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 g)、吸附溫度(20、30、40、50、60 ℃)、吸附時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)、膠原肽溶液pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)對(duì)脫腥脫苦效果影響。

1.3.7 大孔樹(shù)脂AB-8靜態(tài)吸附正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)靜態(tài)吸附單因素試驗(yàn)結(jié)果,每個(gè)因素確定3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn),各因素水平見(jiàn)表1。通過(guò)感官評(píng)價(jià)腥味值、苦味值,檢測(cè)肽損失率,確定大孔樹(shù)脂脫腥脫苦的最佳工藝條件。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor and level of the orthogonal test

1.3.8 膠原肽感官評(píng)價(jià)

將膠原肽溶液(10%,10 mL)置于一次性樣品杯中,于25 ℃室溫下放置10 min后,由7名經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的感官評(píng)價(jià)員進(jìn)行感官評(píng)定,采用5分制,分值越高,腥味和苦味越重。同時(shí)對(duì)膠原肽溶液進(jìn)行風(fēng)味、氣味、色澤的綜合感官評(píng)價(jià),評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。感官得分為7人感官評(píng)分的平均值。

表2 感官值評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria

1.3.9 肽含量檢測(cè)

采用福林酚法[19]檢測(cè)肽含量。將膠原肽溶液或凍干粉配制成約含200 μg/mL蛋白的溶液,取1 mL加入5 mL福林酚試劑甲混勻,25 ℃放置10 min,再加0.5 mL福林酚試劑乙,立即搖勻,25 ℃保溫30 min,在750 nm下比色,以1 mL水代替樣品做空白對(duì)照。以牛血清白蛋白繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.001 9x+0.035 9,R2=0.99,x為蛋白質(zhì)量濃度(μg/mL),y為光密度值。

1.3.10 產(chǎn)品得率

準(zhǔn)確量取一定量的d-SCP溶液,于-50 ℃,20 Pa以下進(jìn)行冷凍干燥,并對(duì)干燥后的凍干粉進(jìn)行準(zhǔn)確稱重,按公式(1)計(jì)算得率:

(1)

1.3.11 氨基酸組成測(cè)定

將膠原肽粉末按照GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》進(jìn)行前處理后,采用HPLC-異硫氰酸苯酯柱前衍生法[20]檢測(cè)膠原肽氨基酸組成。

1.3.12 脂肪氧化物含量的測(cè)定

參照SIDDAIAH等[21]的方法。取0.1 g膠原肽凍干粉溶于1 mL去離子水置于具塞比色管中,加入2 mL 50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 7.0,加入質(zhì)量濃度0.1% EDTA及質(zhì)量濃度0.1%沒(méi)食子酸丙酯),再加入2 mL質(zhì)量濃度0.375%的硫代巴比妥酸(用質(zhì)量濃度15%的三氯乙酸與0.25 mol/L的鹽酸配制),沸水浴20 min冷卻后加入5 mL的三氯甲烷,4 500 r/min離心10 min,取上清液于532 nm處比色。以丙二醛乙縮醛制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.487 8x+0.007 5,R2=0.99,x為丙二醛乙縮醛質(zhì)量濃度(μg/mL),y為光密度值。

1.3.13 抗血小板聚集活性測(cè)定

大鼠血小板的制備參照MAHESWARAIAH等[22]的方法進(jìn)行制備,血小板聚集抑制率的測(cè)定參考YU等[23]的方法并稍作修改:稱取一定量的膠原肽粉末溶于蒸餾水中配成終質(zhì)量濃度(加到測(cè)試杯中的樣品濃度)為3.0 mg/mL,以ADP(0.1 mol/L)為激活劑誘導(dǎo)血小板發(fā)生活化聚集,以貧血小板血漿為空白對(duì)照,利用比濁法測(cè)定血小板在5 min時(shí)的聚集率。血小板聚集抑制率按公式(2)計(jì)算:

(2)

1.4 數(shù)據(jù)處理

全文試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel預(yù)處理后,用統(tǒng)計(jì)分析軟件:GraphPad prism 8.3.0進(jìn)行顯著性分析,SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)結(jié)果分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同吸附或包埋方法對(duì)膠原肽脫腥、脫苦的作用效果

活性炭和硅藻土[24]作為食品工業(yè)中常用的吸附劑,其較大的比表面積及多孔結(jié)構(gòu)不僅對(duì)腥味物質(zhì)和苦味肽有吸附消除作用,也具有一定的脫色效果[25];β-環(huán)糊精因具有內(nèi)部疏水外部親水的環(huán)狀結(jié)構(gòu),能夠包埋疏水氨基酸[26],從而降低膠原肽的苦味,也有研究發(fā)現(xiàn)其在脫腥方面也有一定的作用[10]。大孔樹(shù)脂在功能成分分離純化方面有廣泛應(yīng)用,近年來(lái),在不良風(fēng)味脫除方面的應(yīng)用也逐漸興起[12-14],不僅可以通過(guò)其發(fā)達(dá)孔穴結(jié)構(gòu)大量吸附腥味物質(zhì),還可以對(duì)苦味氨基酸產(chǎn)生特異性吸附。因此,本文參照文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法處理樣品,比較4種方式對(duì)SCP的脫腥、脫苦的作用效果以及d-SCP得率、肽含量和抗血小板活性的影響,從而確定適合于SCP脫腥的方式,結(jié)果如圖1所示。在幾種脫腥方式中,對(duì)SCP腥味脫除較好的為大孔樹(shù)脂AB-8,其次為β-環(huán)糊精、活性炭和大孔樹(shù)脂XAD-1600,對(duì)SCP苦味脫除較好的有大孔樹(shù)脂AB-8、β-環(huán)糊精和大孔樹(shù)脂XAD-1600(圖1-a);3種大孔樹(shù)脂吸附后d-SCP凍干粉得率均低于活性炭、β-環(huán)糊精和硅藻土,但從d-SCP的肽含量和抗血小板活性來(lái)看,大孔樹(shù)脂AB-8吸附得到的d-SCP肽含量?jī)H次于β-環(huán)糊精和活性炭,抗血小板活性和β-環(huán)糊精包埋產(chǎn)物的活性無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖1-b),經(jīng)大孔樹(shù)脂AB-8吸附脫腥得到的d-SCP仍保持了較高的肽含量和血小板聚集抑制活性,說(shuō)明大孔樹(shù)脂AB-8雖然吸附能力較強(qiáng),但由于其吸附具有選擇性,并未對(duì)SCP中發(fā)揮抗血小板活性的肽產(chǎn)生大量吸附。常鈺菲等[12]在對(duì)鱈魚(yú)蛋白酶解液進(jìn)行脫腥處理時(shí),也發(fā)現(xiàn)AB-8型大孔樹(shù)脂可吸附較多的腥味物質(zhì)但又不至于損失大量多肽,整體脫腥效果較好。因此,選擇大孔樹(shù)脂AB-8進(jìn)行下一步吸附條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

a-腥味值/苦味值;b-產(chǎn)物得率、肽含量、血小板聚集抑制率

2.2 大孔樹(shù)脂AB-8靜態(tài)吸附單因素試驗(yàn)

2.2.1 大孔樹(shù)脂添加量對(duì)大孔樹(shù)脂脫腥脫苦效果的影響

檢測(cè)大孔樹(shù)脂AB-8添加量為0.3～1.1 g時(shí)d-SCP溶液腥味值、苦味值及肽損失,以探究大孔樹(shù)脂添加量對(duì)脫苦脫腥效果的影響,結(jié)果如圖2所示。隨著大孔樹(shù)脂添加量的升高,d-SCP腥味值逐漸下降,在0.7 g時(shí)下降速度最快,0.9 g后未見(jiàn)顯著變化(P>0.05),說(shuō)明大孔樹(shù)脂對(duì)SCP中的腥味物質(zhì)吸附逐漸達(dá)到飽和。同時(shí)發(fā)現(xiàn)苦味值也呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì),但0.7 g后下降不明顯(圖2-a)。肽損失率逐漸升高,升高速率也呈現(xiàn)先快速后平緩的趨勢(shì)(圖2-b),肽含量作為預(yù)估活性的指標(biāo),盡可能避免較高的損失。因此,本實(shí)驗(yàn)選取0.5、0.7及0.9 g,作為后續(xù)正交試驗(yàn)中大孔樹(shù)脂添加量的3個(gè)水平。

a-腥味值和苦味值;b-肽損失率

2.2.2 吸附溫度對(duì)大孔樹(shù)脂脫腥脫苦效果的影響

檢測(cè)大孔樹(shù)脂AB-8吸附溫度為20～60 ℃時(shí)d-SCP腥味值、苦味值及肽損失,以探究大孔樹(shù)脂吸附溫度對(duì)脫苦脫腥效果的影響。由圖3結(jié)果可以看出,隨著溫度的升高,d-SCP腥味值先降低后升高,在30 ℃達(dá)到最低值,可能存在的原因是在30 ℃左右有利于大孔樹(shù)脂AB-8對(duì)膠原肽中腥味物質(zhì)的吸附,但溫度過(guò)高時(shí)d-SCP產(chǎn)生了輕微劣變,從而導(dǎo)致風(fēng)味變差?？辔吨迪炔蛔兒笊?在20～40 ℃保持較低的水平(圖3-a)。肽損失率先上升后降低,這可能是由于低溫不利于大孔樹(shù)脂的吸附,而大孔樹(shù)脂的吸附過(guò)程是放熱過(guò)程,所以溫度過(guò)高也會(huì)導(dǎo)致吸附量的下降(圖3-b),但在該溫度范圍內(nèi)肽損失率基本在10%以內(nèi),未出現(xiàn)大量損失。因此,本實(shí)驗(yàn)選取30、40、50 ℃,作為后續(xù)正交試驗(yàn)中大孔樹(shù)脂吸附溫度的3個(gè)水平。

a-腥味值和苦味值;b-肽損失率

2.2.3 吸附時(shí)間對(duì)大孔樹(shù)脂脫腥脫苦效果的影響

檢測(cè)大孔樹(shù)脂AB-8吸附時(shí)間為0.5～2.5 h時(shí)d-SCP腥味值、苦味值及肽損失,以探究大孔樹(shù)脂吸附時(shí)間對(duì)脫苦脫腥效果的影響。由圖4可知,隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng),腥味值和苦味值均先下降后趨于平緩,在1.5 h后未見(jiàn)顯著變化(P>0.05),說(shuō)明大孔樹(shù)脂AB-8在0.5～1.5 h內(nèi)對(duì)腥味物質(zhì)和苦味物質(zhì)大量吸附,在1.5 h基本達(dá)到飽和(圖4-a)。肽的損失率隨時(shí)間延長(zhǎng)先快后慢,在2.0 h后基本不變,對(duì)肽的吸附也達(dá)到飽和(圖4-b)。同時(shí)考慮到時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)造成肽溶液中微生物的繁殖和時(shí)間成本的增加,因此,本實(shí)驗(yàn)選取1.0、1.5、2.0 h,作為后續(xù)正交試驗(yàn)中吸附時(shí)間的3個(gè)水平。

a-腥味值和苦味值;b-肽損失率

2.2.4 膠原肽溶液pH對(duì)大孔樹(shù)脂脫腥脫苦效果的影響

膠原肽溶液中pH的改變會(huì)使其中腥苦味物質(zhì)和肽的極性發(fā)生變化,從而影響吸附效果[27]。探究溶液pH對(duì)大孔樹(shù)脂AB-8脫腥脫苦效果的影響,檢測(cè)d-SCP在pH 4.0～8.0時(shí)脫腥脫苦效果及肽損失。由圖5-a可以看出,隨著pH的升高,腥味值急劇下降后緩慢升高,在pH 6.0時(shí)達(dá)到最低值,說(shuō)明中性或偏堿性環(huán)境有利于大孔樹(shù)脂AB-8對(duì)腥味物質(zhì)的吸附,這與常鈺菲等[12]的研究結(jié)果一致。苦味值隨pH升高而升高,說(shuō)明酸性條件有利于大孔樹(shù)脂AB-8對(duì)苦味氨基酸的吸附,同時(shí)發(fā)現(xiàn)酸的存在也能夠?qū)酀队幸欢ǖ难谏w作用,2種作用可共同導(dǎo)致苦味值的降低。肽的損失率隨著pH的升高呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì),在中性附近損失率較低,過(guò)酸的吸附環(huán)境會(huì)造成肽的大量損失(圖5-b)。綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)選取pH分別為5.0、6.0及7.0,作為后續(xù)正交試驗(yàn)中吸附pH的3個(gè)水平。

2.3 大孔樹(shù)脂AB-8靜態(tài)吸附正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以腥味值、苦味值和肽損失率為指標(biāo),按照表1進(jìn)行正交試驗(yàn)。表3為正交試驗(yàn)結(jié)果,表4為正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果?？梢钥闯?在A(樹(shù)脂添加量)、B(吸附溫度)、C(吸附時(shí)間)、D(溶液pH)4個(gè)因素中,以腥味值為指標(biāo),顯著影響因素為A和C,影響程度大小為A>C>D>B,得到的最優(yōu)組合為A3B1C3D3,在該條件下d-SCP理論腥味值最低。但若以苦味值為指標(biāo),顯著影響因素為A和B,得到的最優(yōu)組合為A3B1C3D1;以肽損失率為指標(biāo),顯著影響因素為A、B、C和D,得到的最優(yōu)組合為A1B1C1D2。對(duì)于不同的評(píng)價(jià)指標(biāo),不同因素的影響程度是不一樣的,對(duì)應(yīng)的優(yōu)化方案也各不相同,因此,采用綜合平衡法[10]根據(jù)各項(xiàng)指標(biāo)重要性及各項(xiàng)指標(biāo)中因素主次、水平優(yōu)劣等進(jìn)行綜合平衡。由于A為影響腥味值和苦味值的最主要因素,C為影響腥味值的主要因素,D為影響肽損失率的最主要因素,綜合平衡后大孔樹(shù)脂添加量的最佳水平為A3,吸附溫度的最佳水平是B1,吸附時(shí)間的最佳水平是C3,吸附pH的最佳水平為D2,因此A3B1C3D2為最優(yōu)組合,即正交試驗(yàn)表中的方案7,在該吸附條件下得到的d-SCP腥味值1.00,苦味值1.43,肽損失率7.72%。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of orthogonal test

表4 正交試驗(yàn)方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal test

2.4 大孔樹(shù)脂吸附前后膠原肽感官特征變化

對(duì)SCP和d-SCP溶液進(jìn)行感官評(píng)價(jià),從魚(yú)腥味、發(fā)酵味、苦味、鮮味和色澤外觀上對(duì)大孔樹(shù)脂AB-8的脫腥脫苦效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),結(jié)果如圖6所示。經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂AB-8脫腥脫苦后的d-SCP溶液基本無(wú)魚(yú)腥味,苦味也降低至感官可以接受的水平(P<0.05),外觀上由原來(lái)的黃色變?yōu)槌吻逋该鞯奈ⅫS色,接近于無(wú)色,同時(shí)發(fā)現(xiàn)SCP溶液帶有發(fā)酵味,經(jīng)脫腥脫苦后,發(fā)酵味幾乎無(wú)法被感知出,吸附后的d-SCP溶液也呈現(xiàn)出了一定的鮮味,整體風(fēng)味得到顯著改善。

2.5 大孔樹(shù)脂吸附前后膠原肽氨基酸組成變化

在1.3.1節(jié)中酶解條件下制備SCP溶液,在正交優(yōu)化得到的最優(yōu)吸附條件下進(jìn)行脫腥脫苦處理得到d-SCP,經(jīng)冷凍干燥后計(jì)算得率為70.0%(以干基計(jì))。

對(duì)SCP和d-SCP粉末進(jìn)行總氨基酸分析,結(jié)果如表5所示。

表5 SCP和d-SCP氨基酸組成Table 5 SCP and d-SCP amino acid composition

SCP和d-SCP中氨基酸總量分別為91.52%和89.66%,未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)。從各種氨基酸種類的變化情況來(lái)看,SCP和d-SCP中對(duì)肽鮮味起重要作用的Asp和Glu[7]總量分別為9.03%和10.77%,增加了19.27%,從而使吸附處理后的d-SCP鮮味提升。Thr、Ser、Gly和Ala為甜味氨基酸,4種氨基酸總量未出現(xiàn)顯著變化。Val、Ile、Leu、Phe、His、Arg、Met均屬于苦味氨基酸,帶有明顯苦味[17],吸附前后總量分別為21.10%和18.42%,降低了12.70%,分析原因可能是由于以上幾種氨基酸大部分為疏水性氨基酸,大孔樹(shù)脂AB-8為聚苯乙烯型弱極性吸附樹(shù)脂,其吸附機(jī)理為疏水性吸附,因此,苦味氨基酸得到一定吸附,從而使d-SCP相較于SCP苦味得到良好改善,這與蔣雄武等[28]的研究結(jié)果一致。另外,組成抗血小板肽的主要氨基酸Gly和Pro[29]吸附前后總量分別為40.55%和40.88%,未出現(xiàn)顯著下降(P>0.05)。

2.6 大孔樹(shù)脂吸附前后膠原肽中脂肪氧化物含量的變化

魚(yú)類脂肪氧化產(chǎn)生的醛酮類物質(zhì)是膠原肽溶液腥味的重要來(lái)源,SIDDAIAH等[21]發(fā)現(xiàn),脂肪氧化產(chǎn)物指標(biāo)TBARS與魚(yú)類風(fēng)味感官評(píng)分呈正相關(guān),因此通過(guò)測(cè)定硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)值來(lái)驗(yàn)證大孔樹(shù)脂AB-8靜態(tài)吸附對(duì)SCP中腥味物質(zhì)的影響,結(jié)果見(jiàn)表6。SCP和d-SCP凍干粉中脂肪氧化產(chǎn)物含分別為3.71 μg/g和2.34 μg/g,降低了36.93%,說(shuō)明大孔樹(shù)脂AB-8的靜態(tài)吸附能夠?qū)CP中的腥味物質(zhì)有較好的脫除,這和感官評(píng)價(jià)的結(jié)果是一致的。

表6 SCP和d-SCP脂肪氧化物含量、肽含量及抗血小板活性變化Table 6 Changes in TBARS, peptide content, and antiplatelet activity of SCP and d-SCP

2.7 大孔樹(shù)脂吸附前后膠原肽中肽含量和抗血小板活性的變化

經(jīng)檢測(cè),SCP和d-SCP凍干粉中肽含量分別為85.48%和88.10%,結(jié)合2.5節(jié)中實(shí)驗(yàn)結(jié)果,吸附后的d-SCP氨基酸總量略微下降,而肽含量提高了3.07%,說(shuō)明大孔樹(shù)脂AB-8在SCP溶液中對(duì)游離氨基酸的吸附能力大于對(duì)肽的吸收,大孔樹(shù)脂AB-8在脫苦脫腥的同時(shí),也對(duì)其中的肽起到了一定的純化效果。SCP和d-SCP的血小板聚集抑制IC50值分別為1.969和2.069 mg/mL,活性下降5.08%,吸附后的d-SCP仍具有較高的抗血小板活性,說(shuō)明采用大孔樹(shù)脂AB-8對(duì)SCP脫腥脫苦是可行的。

3 結(jié)論

本研究比較了活性炭、β-環(huán)糊精、硅藻土、大孔樹(shù)脂XAD-1600、AB-8和XAD-7HP等6種方式處理對(duì)SCP脫腥脫苦的作用效果,篩選出大孔樹(shù)脂AB-8,經(jīng)過(guò)單因素和正交優(yōu)化,確定最佳脫腥條件為每10 mL SCP溶液添加0.9 g樹(shù)脂,在pH 6.0和溫度30 ℃條件下水浴振蕩吸附2.0 h。經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附處理后的d-SCP基本無(wú)腥味,苦味降低至感官可以接受的水平,鮮味得到提升;肽含量為88.10%,較吸附前提高了3.07%,血小板聚集抑制IC50值為2.069 mg/mL,較吸附前下降5.08%。大孔樹(shù)脂AB-8處理后SCP肽損失率和抗血小板活性損失率較低,風(fēng)味得到顯著改善,為鰱魚(yú)皮膠原活性肽的品質(zhì)提升提供了技術(shù)解決方案。