氨基酸轉(zhuǎn)氨/脫羧雙功能酶克隆表達(dá)、功能鑒定及其機(jī)理研究

丁小潔,劉嘉荔,楊靜文,胡雪芹,張洪斌

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥,230009)

手性化合物特別是非天然氨基酸及其衍生物是現(xiàn)代藥物、化學(xué)品和農(nóng)藥等的重要中間產(chǎn)物[1],現(xiàn)階段手性化合物通?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)法、生物催化法合成[2-3]。但近些年來(lái)隨著藥物分子結(jié)構(gòu)的日益復(fù)雜,化學(xué)法合成手性藥物越來(lái)越復(fù)雜[4],生物催化法具有高效一步合成多個(gè)手性位點(diǎn)、綠色安全的特點(diǎn)而被廣泛關(guān)注[5]。轉(zhuǎn)氨酶(transaminase, TA)由于其已經(jīng)成功高效合成手性胺,且其有著嚴(yán)格的立體選擇性、高效一步合成、環(huán)境友好、不需要輔因子再生等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛關(guān)注[6]。轉(zhuǎn)氨酶是磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate, PLP)作為輔酶,通過(guò)將氨基轉(zhuǎn)移至特定的受體來(lái)獲得高對(duì)映體產(chǎn)物的一類(lèi)酶[7],轉(zhuǎn)氨酶現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種手性化合物的生產(chǎn)[8]。L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶作為最先研究的一類(lèi)轉(zhuǎn)氨酶,其可以在氨基酸和酮酸之間發(fā)生轉(zhuǎn)氨反應(yīng),從而生成酮酸對(duì)應(yīng)的手性氨基酸[9-10],且其催化反應(yīng)徹底、催化產(chǎn)物手性單一有著很高的實(shí)用價(jià)值[6]。

在自然界中,氨基酸轉(zhuǎn)氨酶和脫羧酶都屬于PLP依賴(lài)性的酶,研究證明天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和脫羧酶都屬于同一種折疊方式,且都只在PLP輔因子與活性位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合時(shí)才具有活性[6],PLP和酶形成的復(fù)合物在酶催化反應(yīng)過(guò)程中都起著至關(guān)重要的作用[11]。對(duì)于L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)來(lái)說(shuō),是典型的乒乓機(jī)制動(dòng)力學(xué)機(jī)制,即酶和底物無(wú)需形成三元絡(luò)合物,而是氨基供體通過(guò)將氨基轉(zhuǎn)移至PLP和酶復(fù)合物上生成酮酸副產(chǎn)物,離開(kāi)催化中心;剩下的磷酸吡哆胺(pyridoxamine phosphate,PMP)以及被修飾的酶緊接著和氨基受體結(jié)合,接受氨基供體留下的氨基生成轉(zhuǎn)氨產(chǎn)物,同時(shí)PMP以及被修飾的酶回到原始形態(tài),繼續(xù)下一輪的催化反應(yīng)[6]。同時(shí)脫羧酶也是一種PLP依賴(lài)性酶,不同的是脫羧酶將脫羧底物中的靠近官能團(tuán)的羧基非氧化型脫羧,形成中間體的同時(shí)釋放CO2,接著發(fā)生質(zhì)子化等反應(yīng),脫羧產(chǎn)物釋放的同時(shí),內(nèi)部的PLP和酶的復(fù)合物重新被建立[12]。該酶催化的2種反應(yīng)有著諸多相似的地方,例如PLP在催化過(guò)程中的重要作用,推測(cè)該酶兩種催化活性共用一個(gè)結(jié)合PLP的活性中心,具體的底物結(jié)合中心有所不同,導(dǎo)致其具有不同的催化活性[13]。

雙功能酶是指酶蛋白一條肽鏈上同時(shí)具有兩種不同的催化活性,來(lái)催化2種不同反應(yīng)[14]的一類(lèi)酶。雙功能酶不同于由多個(gè)不同的單功能酶組成的酶系,由于其不同結(jié)構(gòu)間的靈活轉(zhuǎn)化機(jī)制使之有著比傳統(tǒng)的多酶反應(yīng)體系有著更高的反應(yīng)速率。L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶作為一種雙功能酶不僅具有氨基酸和酮酸之間的轉(zhuǎn)氨能力[15],同時(shí)也具有對(duì)二羧酸底物的非氧化脫羧能力,是一種研究較少的雙功能酶,對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)研究顯得格外重要[16]。

本研究將L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因克隆表達(dá),并培養(yǎng)純化出該酶,通過(guò)對(duì)該酶催化反應(yīng)進(jìn)行功能鑒定,結(jié)果表明該酶是一種具有催化氨基酸轉(zhuǎn)氨和二羧酸底物的非氧化脫羧兩種催化能力的雙功能酶,對(duì)酶催化機(jī)理進(jìn)行了探討,并對(duì)該酶催化的2種反應(yīng)進(jìn)行研究,探究其具體反應(yīng)方向,旨在為后續(xù)的研究和開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

菌株細(xì)胞:克隆感受態(tài)菌株E.coliDH5α以及表達(dá)宿主菌株E.coliBL21(DE3),南京擎科生物有限公司;野生大腸桿菌菌株(菌株編號(hào)Bio-67405)以及表達(dá)載體pET-28a空載菌株均由本課題組保藏。

試劑及耗材:全基因組質(zhì)粒提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR試劑盒、無(wú)縫克隆試劑盒,北京全式金生物有限公司;內(nèi)切酶BamH I、XhoI、DNA Marker、DNA Ladder、蛋白Marker、蛋白Ladder,南京擎科生物有限公司;谷氨酸、苯甲酰甲酸、酮戊二酸、PLP,阿拉丁試劑。H2SO4、高氯酸、各類(lèi)無(wú)機(jī)鹽,國(guó)藥集團(tuán)。如果沒(méi)有特殊說(shuō)明,以上試劑均為化學(xué)純。

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10。

儀器:ETC821型PCR儀,東勝興業(yè)科學(xué)儀器;Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng),上海天能科技;1350L高壓蒸汽滅菌鍋,上海博訊醫(yī)療公司;D-37520高速冷凍離心機(jī),美國(guó)Beckman公司;SCIENT2-IID細(xì)胞超聲破碎儀,寧波新芝生物技術(shù)有限公司;Model 201型Lab Alliance高效液相色譜系統(tǒng),美國(guó)科學(xué)儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)NCBI中大腸桿菌來(lái)源的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因序列(CP026935.2),結(jié)合pET-28a的基因序列設(shè)計(jì)出帶有BamH I、XhoI 兩個(gè)酶切位點(diǎn)的如表1所示的2組引物。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

以大腸桿菌的基因組質(zhì)粒為模板,AspAT-F/AspAT-R為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因片段。同樣以pET-28a空載質(zhì)粒為模板,Vector-R/Vector-F為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到和已獲得的基因片段有同源臂的pET-28a線性載體質(zhì)粒。將純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物使用無(wú)縫克隆試劑盒進(jìn)行連接。

熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α克隆感受態(tài)細(xì)胞中,涂至含卡那霉素(50 mg/L)的固體LB平板上,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)并挑取單菌落。對(duì)單菌落進(jìn)行酶切及測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒正確構(gòu)建。驗(yàn)證成功的菌株質(zhì)粒將轉(zhuǎn)至BL21(DE3)表達(dá)感受態(tài)中,構(gòu)建pET-28a(+)/L-AspAT菌株。

1.2.2 重組L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建成功的產(chǎn)L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶菌株在LB培養(yǎng)基37 ℃,220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。按照接種量2%(體積分?jǐn)?shù))將過(guò)夜菌液轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中37 ℃,220 r/min培養(yǎng)6～8 h至其OD600為1.8～2.0時(shí),添加異丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)至終濃度為0.25 mmol/L,25 ℃,220 r/min培養(yǎng)6 h。

4 ℃低溫離心收集菌體沉淀,并重溶于Tris-HCl(0.1 mol/L pH 8)的緩沖液中,冰浴超聲破碎,離心收集上清液,即為粗酶液。

1.2.3 重組L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的純化

使用親和層析(Proteinlso Ni-NTA Resin)對(duì)L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶蛋白進(jìn)行純化。粗酶液經(jīng)0.22 μm的微孔濾頭過(guò)濾,上樣于NI-NTA重力預(yù)裝柱上。首先使用10倍柱體積的平衡緩沖液(300 mmol/L NaCl,50 mmol/L NaH2PO4,10 mmol/L咪唑,10 mmol/L Tris調(diào)pH 8.0)進(jìn)行平衡,再分別依次使用含40～300 mmol/L咪唑的洗脫液進(jìn)行洗脫,最后使用10 kDa的超濾管進(jìn)行濃縮脫鹽。SDS-PAGE蛋白電泳進(jìn)行分析純化結(jié)果,使用Bradford法,牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定蛋白濃度,純化后的蛋白進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 重組L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶酶活力測(cè)定

轉(zhuǎn)氨酶活力測(cè)定:谷氨酸40 mmol/L,苯甲酰甲酸20 mmol/L,PLP 5 mmol/L溶解于5 mL的pH 8的Tris-HCl緩沖液中,加入蛋白質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的純酶液500 μL,35 ℃反應(yīng)1 h,煮沸停止反應(yīng),檢測(cè)反應(yīng)液中苯甲酰甲酸的減少量。

一個(gè)酶活力單位(U)定義為:每小時(shí)催化消耗1 μmol苯甲酰甲酸所需的酶量。

脫羧酶活力測(cè)定:20 mmol/L酮戊二酸溶解于5 mL的pH 8的Tris-HCl緩沖液中,加入蛋白質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的純酶液500 μL,35 ℃反應(yīng)1 h,煮沸停止反應(yīng),檢測(cè)反應(yīng)液中酮戊二酸的減少量。

一個(gè)酶活力單位(U)定義為:每小時(shí)催化消耗1 μmol酮戊二酸所需的酶量。

苯甲酰甲酸、苯甘氨酸、酮戊二酸均使用高效液相色譜檢測(cè),苯甲酰甲酸、酮戊二酸高效液相色譜檢測(cè)條件為:色譜柱為Bio-RAD生產(chǎn)的Organic Acid Analysis Column(300 mm×7.8 mm),流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4水溶液,在214 nm下檢測(cè),流速為0.6 mL/min,上樣量20 μL,柱溫25 ℃。苯甘氨酸液相檢測(cè)條件:色譜柱為Daicel corporation生產(chǎn)的Crownpak CR-I(+)(150 mm×3.9 mm),流動(dòng)相為V(高氯酸水溶液)∶V(乙腈)=80∶20,200 nm下檢測(cè),流速0.35 mL/min,上樣量2 μL,柱溫25 ℃。

質(zhì)譜檢測(cè)條件:美國(guó)Waters公司,ACQUITY UPLC LCT Premier XE儀器。

1.2.5 重組L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶兩種反應(yīng)的表征

轉(zhuǎn)氨反應(yīng):分別取谷氨酸、苯甲酰甲酸,PLP溶解于pH 8的Tris-HCl緩沖液中,使其終濃度為40、20和5 mmol/L,加入酶液,35 ℃反應(yīng),滅活利用高效液相色譜檢測(cè),觀察反應(yīng)前后反應(yīng)液中苯甲酰甲酸以及產(chǎn)物苯甘氨酸濃度的變化。

脫羧反應(yīng):取酮戊二酸溶解于 pH 8的Tris-HCl緩沖液中使其終濃度為20 mmol/L,加入酶液,35 ℃反應(yīng),煮沸停止反應(yīng),高效液相色譜檢測(cè),觀察反應(yīng)前后反應(yīng)液中酮戊二酸濃度的變化以及反應(yīng)后反應(yīng)液的質(zhì)譜檢測(cè)。

1.2.6 反應(yīng)過(guò)程中轉(zhuǎn)氨和脫羧反應(yīng)關(guān)系

分別取谷氨酸、苯甲酰甲酸、PLP濃度溶解于 pH 8的Tris-HCl緩沖液中,使其終濃度為20 mmol/L、20 mmol/L、5 mmol/L,加入酶液,每隔1 h取樣,煮沸檢測(cè)反應(yīng)液中的苯甲酰甲酸、酮戊二酸、苯甘氨酸、1,4-丁二酸濃度變化,并計(jì)算酮戊二酸以及苯甲酰甲酸轉(zhuǎn)化率。

1.2.7L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的分子對(duì)接

L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的蛋白結(jié)構(gòu)來(lái)自PDB(編號(hào)1AHG),對(duì)接所用酮戊二酸(SID:404770395)與L-苯甘氨酸(SID:198962634)的分子結(jié)構(gòu)均來(lái)自NCBI,分子對(duì)接由Discovery Studio Client完成,所有繪圖分析由PyMOL完成。

1.2.8 重組L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1.2.8.1 溫度、pH對(duì)重組酶酶活力的影響

最適溫度:在pH為8.0的Tris-HCl緩沖液中,分別在25、30、35、37、40 ℃下,測(cè)定L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的轉(zhuǎn)氨和脫羧酶活力,以最高酶活力為100%,計(jì)算相對(duì)酶活力。

最適pH:在pH 7、8、9、10的Tris-HCl緩沖液以及pH 5、6、7、8、9下的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中,分別測(cè)定L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的轉(zhuǎn)氨和脫羧酶活力,以最高酶活力為100%,計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.2.8.2 金屬離子對(duì)重組L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性影響

分別在反應(yīng)液中加入終濃度為5 mmol/L MnCl2、MgCl2、NiCl2、Al2SO4、KCl、FeCl3、ZnCl2、NaCl、BaCl2、CaCl2、CuSO4、EDTA,觀察金屬離子對(duì)酶活力的影響,以不加離子的反應(yīng)液的酶活力定義為100%,計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.2.8.3 重組L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的酶動(dòng)力參數(shù):苯甲酰甲酸20 mmol/L,PLP 5 mmol/L。谷氨酸分別以10～160 mmol/L溶解于5 mL的pH 8的Tris-HCl緩沖液中,加入500 μL的0.1 mg/mL的純酶液。35 ℃純酶催化反應(yīng)10 min,高效液相色譜檢測(cè)不同反應(yīng)組中苯甲酰甲酸的減少量從而計(jì)算酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

脫羧反應(yīng)的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù):PLP 5 mmol/L以及酮戊二酸分別以10～160 mmol/L溶解于5 mL的pH 8的Tris-HCl緩沖液中,加入500 μL的0.1 mg/mL的純酶液。35 ℃,純酶催化反應(yīng)10 min,高效液相色譜檢測(cè)不同反應(yīng)液中酮戊二酸的減少量從而計(jì)算酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 重組酶蛋白表達(dá)及其純化結(jié)果

通過(guò)前期的基因克隆,對(duì)其質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證、菌落PCR鑒定、測(cè)序等操作,認(rèn)為pET-28a/L-AspAT重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、產(chǎn)酶,并對(duì)粗酶液進(jìn)行蛋白純化操作。SDS-PAGE結(jié)果圖如增強(qiáng)出版附件圖1所示,L-AspAT的預(yù)測(cè)蛋白大小為43.5 kDa,對(duì)比Marker可知,蛋白表達(dá)正確,且純化效果較好,收集洗脫液,進(jìn)行超濾脫鹽濃縮,得到的純化酶做接下來(lái)的酶催化反應(yīng)。

2.2 重組酶催化功能鑒定

對(duì)L-AspAT催化的轉(zhuǎn)氨脫羧反應(yīng)進(jìn)行功能鑒定,并分析底物的減少以及不同反應(yīng)的產(chǎn)物生成情況。圖1-a為苯甲酰甲酸標(biāo)品的HPLC圖,其特征峰出峰時(shí)間為9.1 min,圖1-b為D型、L型苯甘氨酸標(biāo)品的HPLC圖,3.5 min為D-苯甘氨酸的特征峰,13.1 min為L(zhǎng)-苯甘氨酸特征峰。圖1-c和圖1-d為轉(zhuǎn)氨反應(yīng)前后反應(yīng)液的HPLC對(duì)比圖,從圖中可以看到,反應(yīng)前后苯甲酰甲酸的峰面積減少,反應(yīng)生成L-苯甘氨酸,同時(shí)在3.5 min并沒(méi)有D-苯甘氨酸的特征峰的產(chǎn)生,計(jì)算其ee值>98%,說(shuō)明該酶催化轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的產(chǎn)物手性單一。

由圖2可知,圖2-a為酮戊二酸的標(biāo)品,酮戊二酸在8.5 min左右有特征峰,結(jié)合脫羧反應(yīng)前后的反應(yīng)液的HPLC對(duì)比圖中(圖2-b及圖2-c)。當(dāng)L-AspAT單獨(dú)催化酮戊二酸反應(yīng)時(shí),酮戊二酸有消耗的現(xiàn)象,通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)體系中生成的CO2以及特異性的還原端反應(yīng)。脫羧反應(yīng)后反應(yīng)液的質(zhì)譜圖見(jiàn)增強(qiáng)出版附件圖2,在質(zhì)譜圖中可以看到117.01和101.02的特征峰,分別對(duì)應(yīng)著1,4-丁二酸和4-氧代丁酸。結(jié)合液相和質(zhì)譜圖得到酮戊二酸在酶的催化作用下,發(fā)生了非氧化脫羧。生成了4-氧代丁酸,4-氧代丁酸不穩(wěn)定進(jìn)而生成1,4-丁二酸,由于CO2在反應(yīng)體系中不能積累的緣故,脫羧反應(yīng)一般進(jìn)行的比較徹底。

a-酮戊二酸標(biāo)品;b-脫羧反應(yīng)前;c-脫羧反應(yīng)后

通過(guò)對(duì)該酶催化反應(yīng)進(jìn)行功能鑒定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該酶是一種具有催化氨基酸轉(zhuǎn)氨和二羧酸底物的非氧化脫羧2種催化能力的雙功能酶。

2.3 反應(yīng)過(guò)程底物產(chǎn)物隨時(shí)間變化

檢測(cè)反應(yīng)液中不同成分在不同時(shí)間的濃度以及轉(zhuǎn)化率,結(jié)果如圖3所示。從圖3-a可以看出在反應(yīng)前期即反應(yīng)0～5 h,苯甲酰甲酸和酮戊二酸的轉(zhuǎn)化率基本持平,即反應(yīng)前期以轉(zhuǎn)氨反應(yīng)為主,酮戊二酸在反應(yīng)液中并沒(méi)有積累較多,其濃度不高,體系中基本上不進(jìn)行脫羧反應(yīng),反應(yīng)體系中酮戊二酸的濃度增高。

a-L-AspAT催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率;b-L-AspAT催化反應(yīng)成分濃度

隨著反應(yīng)進(jìn)行,在反應(yīng)進(jìn)程中期時(shí)(即反應(yīng)5～11 h時(shí)),酮戊二酸的增加量和苯甲酰甲酸的減少量開(kāi)始不對(duì)等。推測(cè)隨著酮戊二酸濃度進(jìn)一步增高,脫羧反應(yīng)開(kāi)始進(jìn)行,但此時(shí)轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生成酮戊二酸的速率大于脫羧反應(yīng)消耗酮戊二酸的速率,所以反應(yīng)體系中酮戊二酸的濃度進(jìn)一步增加,同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)氨反應(yīng)速率相對(duì)于反應(yīng)初期來(lái)說(shuō)有所增加。

在反應(yīng)后期,酮戊二酸的量基本達(dá)到最高值后,脫羧反應(yīng)速率進(jìn)一步增加,轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生成的酮戊二酸開(kāi)始小于脫羧反應(yīng)消耗的量,反應(yīng)體系中酮戊二酸的濃度減少。隨著脫羧反應(yīng)速率增高,反應(yīng)體系中的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)速率進(jìn)一步增加。

進(jìn)一步檢測(cè)催化體系中不同物質(zhì)的濃度隨時(shí)間變化如圖3-b所示,可以看到,隨著時(shí)間的增加苯甲酰甲酸的量是持續(xù)下降的,同時(shí)作為轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的產(chǎn)物L(fēng)-苯甘氨酸和酮戊二酸在反應(yīng)前期均有一定程度的濃度上升,但隨著脫羧反應(yīng)的進(jìn)行,酮戊二酸的濃度開(kāi)始下降,同時(shí)由于L-苯甘氨酸不進(jìn)行脫羧反應(yīng)其濃度一直隨著反應(yīng)的進(jìn)行而上升。在脫羧反應(yīng)開(kāi)始的同時(shí),開(kāi)始檢測(cè)到1,4-丁二酸的生成,使整個(gè)催化反應(yīng)快速且使轉(zhuǎn)氨反應(yīng)催化完全,目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-苯甘氨酸的產(chǎn)量達(dá)到預(yù)期。

酮戊二酸作為轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的產(chǎn)物,被非氧化脫羧反應(yīng)消耗后,能進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的進(jìn)行,轉(zhuǎn)氨反應(yīng)速率的增加導(dǎo)致酮戊二酸生成更加迅速。反應(yīng)中后期轉(zhuǎn)氨和脫羧反應(yīng)的相互促進(jìn)作用,不僅解除了轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的產(chǎn)物抑制作用,使其生成更多的所需非天然氨基酸L-苯甘氨酸,而且使轉(zhuǎn)氨和脫羧反應(yīng)速率大大增加。

2.4 雙功能酶的反應(yīng)機(jī)制探討

結(jié)合實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化原理以及LI等[17]關(guān)于PLP依賴(lài)型酶的綜述報(bào)道中對(duì)轉(zhuǎn)氨和脫羧的闡述,認(rèn)為在底物為L(zhǎng)-谷氨酸和苯甲酰甲酸的反應(yīng)體系中,發(fā)生了圖4所示的反應(yīng),首先在反應(yīng)前期,發(fā)生的轉(zhuǎn)氨反應(yīng),生成了轉(zhuǎn)氨反應(yīng)產(chǎn)物L(fēng)-苯甘氨酸和酮戊二酸,隨著產(chǎn)物酮戊二酸的積累,體系中開(kāi)始發(fā)生脫羧反應(yīng),生成4-氧代丁酸進(jìn)而生成1,4-丁二酸,同時(shí)產(chǎn)生副產(chǎn)物CO2。L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化的脫羧反應(yīng)在一定程度上消耗了轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的產(chǎn)物,降低了轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的產(chǎn)物抑制程度,促進(jìn)轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的進(jìn)行,這有可能是雙功能酶在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了基因融合從而導(dǎo)致該酶有利于反應(yīng)進(jìn)行的生物學(xué)特性。

利用DS對(duì)L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和小分子進(jìn)行剛性對(duì)接,對(duì)接結(jié)果如圖5所示?？梢悦黠@地看到對(duì)于L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶來(lái)說(shuō),轉(zhuǎn)氨和脫羧不同反應(yīng)底物結(jié)合位點(diǎn)是不同的,2個(gè)反應(yīng)有不同的催化中心。在整個(gè)反應(yīng)體系中,轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生成的酮戊二酸可能經(jīng)過(guò)蛋白內(nèi)部通道到達(dá)脫羧反應(yīng)的催化中心,使該反應(yīng)能夠更好更徹底的進(jìn)行。

圖5 分子對(duì)接結(jié)果圖Fig.5 Molecular docking result diagram

對(duì)蛋白和小分子相互作用進(jìn)行進(jìn)一步的模擬分析,如增強(qiáng)出版附件圖3所示,苯甲酰甲酸分別和L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的128位脯氨酸,133位組氨酸,146位谷氨酸形成了氫鍵。同樣的是,如增強(qiáng)出版附件圖4所示,酮戊二酸分別和L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶蛋白的37位色氨酸,33位亮氨酸,30位天冬酰胺分別形成了氫鍵?？梢缘玫奖郊柞＜姿岷屯於嵩诿副砻娴牟煌恢眠M(jìn)行結(jié)合,不同的催化中心催化2種反應(yīng),2種反應(yīng)獨(dú)立又相互促進(jìn),符合雙功能酶的催化現(xiàn)象。

2.5 重組酶酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1 溫度、pH對(duì)酶活力的影響

不同溫度下測(cè)量L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的催化轉(zhuǎn)氨脫羧活性,結(jié)果如圖6所示,轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的最適溫度為35 ℃,同時(shí)脫羧反應(yīng)的最適溫度為37 ℃,2種反應(yīng)的最適溫度有所不同,但相差不多。對(duì)比不同來(lái)源的L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的最適溫度基本和該酶相似,但來(lái)源于嗜熱菌ThermusthermophilusHB8的酶最適溫度為75 ℃,其較強(qiáng)的溫度耐受性可能和其來(lái)源有關(guān)[10]。

圖6 溫度對(duì)酶活力的影響Fig.6 Effects of temperature on the enzyme activity

在不同pH下測(cè)量L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的催化轉(zhuǎn)氨脫羧活性,結(jié)果如圖7所示,在不同的緩沖體系中,當(dāng)反應(yīng)體系中pH為8時(shí),轉(zhuǎn)氨和脫羧2種反應(yīng)的相對(duì)酶活力都為最高,可以得到該酶2種酶活力的最適pH相同都為8。偏酸和偏堿情況下酶活力都有所損失,偏酸情況下?lián)p失的更加明顯。對(duì)比不同來(lái)源的L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的最適pH基本相似都為8左右[10],這可能和轉(zhuǎn)氨反應(yīng)所需的堿性環(huán)境有關(guān)。

圖7 pH對(duì)酶活力的影響Fig.7 Effects of pH on the enzyme activity

2.5.2 金屬離子對(duì)酶活力的影響

由圖8可知,不同離子對(duì)轉(zhuǎn)氨和脫羧反應(yīng)的影響不同,對(duì)于轉(zhuǎn)氨反應(yīng)來(lái)說(shuō),EDTA、Mg2+、Cu2+能顯著增加轉(zhuǎn)氨酶活力,而Na+、Ba2+存在的情況下,轉(zhuǎn)氨酶活力損失較為嚴(yán)重,其他離子存在的情況下,對(duì)轉(zhuǎn)氨酶活力沒(méi)有顯著影響。對(duì)于脫羧反應(yīng)來(lái)說(shuō),EDTA、Ni+能顯著增加脫羧酶活力,而Al3+、K+、Ba2+、Cu2+存在的情況下,脫羧酶活力損失較為嚴(yán)重,其他離子存在的情況下,對(duì)脫羧酶活力沒(méi)有顯著影響。

圖8 金屬離子對(duì)酶活力的影響Fig.8 Effect of metal ion on the enzyme activity

同時(shí)Mg2+、Cu2+對(duì)轉(zhuǎn)氨反應(yīng)酶活力有促進(jìn)作用,同時(shí)對(duì)脫羧反應(yīng)酶活力沒(méi)有影響甚至降低了脫羧反應(yīng)的酶活力。Ni+對(duì)脫羧反應(yīng)酶活力有著促進(jìn)作用,同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)氨反應(yīng)酶活力沒(méi)有太大影響,可能是和2種活力催化活性中心不同,導(dǎo)致不同的離子對(duì)脫羧和轉(zhuǎn)氨反應(yīng)酶活力的影響不同。

2.5.3 酶動(dòng)力參數(shù)

對(duì)L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化的2種反應(yīng),分別測(cè)酶動(dòng)力學(xué)參數(shù),結(jié)果如表2所示,其中轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的Km值為138 mmol/L,kcat/Km值為0.015 s-1·(mmol/L)-1。脫羧反應(yīng)的Km值為12.09 mmol/L,kcat/Km值為0.006 s-1·(mmol/L)-1,可以看出對(duì)于L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶來(lái)說(shuō),是以轉(zhuǎn)氨反應(yīng)作為其主反應(yīng),脫羧反應(yīng)為其副反應(yīng)而進(jìn)行的,對(duì)于該酶來(lái)說(shuō),轉(zhuǎn)氨反應(yīng)速率是要大于脫羧反應(yīng)的,轉(zhuǎn)氨反應(yīng)相對(duì)而言是有較高的催化效率。

表2 轉(zhuǎn)氨脫羧反應(yīng)的酶動(dòng)力參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of transammonia and decarboxylation reaction

3 結(jié)論

本文以大腸桿菌來(lái)源的L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因序列作為研究對(duì)象,成功克隆表達(dá)出了高產(chǎn)L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的菌株,并通過(guò)親和層析得到純化酶。通過(guò)對(duì)該酶催化反應(yīng)進(jìn)行功能鑒定,驗(yàn)證該酶是一種具有催化氨基酸轉(zhuǎn)氨和二羧酸底物的非氧化脫羧2種催化能力的雙功能酶。對(duì)該酶催化的2種反應(yīng)進(jìn)行了機(jī)理研究,進(jìn)一步研究了L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)和脫羧反應(yīng)分別的酶學(xué)性質(zhì)得到了2種反應(yīng)的最適溫度、最適pH和不同的離子對(duì)2種反應(yīng)的影響,2種反應(yīng)相類(lèi)似的最適條件使該酶能夠更好地發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng),對(duì)該酶催化的主反應(yīng)(轉(zhuǎn)氨反應(yīng))有著很好的促進(jìn)作用。對(duì)反應(yīng)過(guò)程中底物產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率進(jìn)行檢測(cè)研究,并對(duì)該酶催化的2種不同的反應(yīng)底物和酶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接操作,發(fā)現(xiàn)該酶有2個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域來(lái)催化不同的反應(yīng),并得到了2種酶催化反應(yīng)之間的關(guān)系,進(jìn)一步驗(yàn)證了該雙功能酶具體的催化進(jìn)程,為后續(xù)研究提供了理論基礎(chǔ)。

L-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶有著轉(zhuǎn)氨能力,同時(shí)也有著對(duì)二羧酸底物的非氧化脫羧作用。通過(guò)對(duì)反應(yīng)進(jìn)行研究認(rèn)為轉(zhuǎn)氨反應(yīng)是該酶催化的主要反應(yīng)。同時(shí)對(duì)于雙功能酶來(lái)說(shuō),轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的產(chǎn)物酮戊二酸是脫羧反應(yīng)的底物,酮戊二酸可能不需要通過(guò)溶液進(jìn)入脫羧反應(yīng)的催化中心,而是通過(guò)酶蛋白內(nèi)部之間進(jìn)入催化中心。從而該雙功能酶比多個(gè)單功能酶組成的酶系更加快速有效,同時(shí)轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的速率也影響著脫羧反應(yīng)[10]的進(jìn)行,脫羧反應(yīng)的進(jìn)行也使轉(zhuǎn)氨反應(yīng)解除產(chǎn)物抑制,打破反應(yīng)平衡更加有利于整體反應(yīng)的進(jìn)行。對(duì)轉(zhuǎn)氨酶和脫羧酶的反應(yīng)機(jī)理相關(guān)的驗(yàn)證討論,認(rèn)為該酶催化的2種反應(yīng)都為PLP依賴(lài)型的酶,同時(shí)脫羧反應(yīng)有利于轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的正向進(jìn)行,可能在生物進(jìn)化的過(guò)程中發(fā)生了2種酶的融合導(dǎo)致了該酶具有的雙功酶催化特性[18-19],利用Discovery Studio Client,結(jié)合生物信息學(xué)工具發(fā)現(xiàn)對(duì)于L-AspAT來(lái)說(shuō),其結(jié)合轉(zhuǎn)氨和脫羧反應(yīng)底物的催化中心位于酶的不同位置,該雙功能酶催化2種反應(yīng)時(shí)相互獨(dú)立,但同時(shí)其獨(dú)特的PLP依賴(lài)型的結(jié)構(gòu)也促使在反應(yīng)液中同時(shí)有2種反應(yīng)時(shí),兩者相互促進(jìn),互相影響。

后續(xù)可以利用分子生物學(xué)以及生物信息學(xué)作為工具,對(duì)基因序列以及結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,深入探討具體的協(xié)同機(jī)制,以及轉(zhuǎn)氨反應(yīng)和脫羧反應(yīng)催化中心的關(guān)系以及二羧酸底物可能的底物通道,更加深入了解該酶。