糖基化改性對明膠乳化性和抗氧化活性的影響

劉杰,鄧利玲,曾云軍,宋光明,鐘耕,5*

1(西南大學 食品科學學院,重慶400715)2(重慶醫(yī)藥高等?？茖W校,重慶401334)3(重慶市生物技術研究所有限責任公司,重慶401121)4(重慶市糧油質量監(jiān)督檢驗站,重慶400040)5(川渝共建特色食品重慶市重點實驗室,重慶 400716)

明膠是來源于動物膠原蛋白的天然高分子化合物,價格低廉,具有良好的持水性、成膜性和凝膠性等,在食品行業(yè)中應用廣泛[1]。但明膠在制備過程中由于酸、堿和高溫的作用,膠原蛋白的三螺旋結構會被不同程度破壞,導致明膠在用于包埋與遞送等體系中時穩(wěn)定性欠佳,不能完全滿足食品加工需求[2-3]。

為擴大明膠在食品行業(yè)中應用范圍,通常對明膠進行改性處理改善其功能。常見的蛋白質改性方法有物理、化學和酶法改性,化學改性有?；?、磷酸化和糖基化改性等,基于美拉德反應途徑的糖基化反應操作簡單,效果明顯,不需添加其他催化劑[4]。美拉德前期反應會使蛋白質和還原糖共價結合形成糖蛋白,此過程可由干法或濕法催化,干法反應比濕法反應溫和,反應條件更可控,蛋白質變性程度更低,可使糖基化反應緩慢進行[5]。美拉德反應前期產(chǎn)物Amadori重排產(chǎn)物(Amadori rearrangement product, ARPs)、中期降解產(chǎn)物還原酮以及末期聚合產(chǎn)物類黑精等都具有抗氧化活性[6]。已有研究報道,乳清分離蛋白[7]、大米酶解蛋白[8]和甘薯蛋白水解產(chǎn)物[9]的美拉德糖基化改性都可以提高其抗氧化性。但目前明膠糖基化改性聚焦于改善功能特性,對糖基化反應改善明膠抗氧化活性的研究少有報道。

明膠穩(wěn)定乳液在使用時傾向形成大液滴,穩(wěn)定性較差[10]。相關研究表明,多糖和蛋白質糖基化交聯(lián)可改善蛋白質在油水界面的厚度和機械強度,有利于蛋白質乳化穩(wěn)定性提高[5]。單糖糖基化反應活性較強,但易產(chǎn)生美拉德反應副產(chǎn)物,褐變明顯,不宜用于乳液中[11]。低聚甘露糖是葡甘聚糖水解之后的多羥基糖,具有多種生理活性,可作為糖基化反應良好的羰基供體[12],但目前用低聚甘露糖進行蛋白質糖基化改性未見報道。

明膠的乳化性和抗氧化性對其作為包埋壁材和遞送載體的穩(wěn)定性與保護性有重要影響[13]。本研究選取不同干熱時間,分別比較明膠與低聚甘露糖(低聚糖)和多糖(麥芽糊精)糖基化反應后結構、乳化性和抗氧化活性變化情況,以期為明膠乳化性和抗氧化性的改善提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

A型明膠(凝膠強度約220 g Bloom),河南博洋生物科技有限公司;麥芽糊精(還原糖當量15～20),濟南長風新材料有限公司;低聚甘露糖(聚合度2～10),鄭州宇控生物科技有限公司;鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒,蘭杰柯科技有限公司;ABTS、DPPH,上海源葉生物科技有限公司;寬分子質量標準蛋白Marker,北京中科瑞泰生物科技有限公司;本研究其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

759紫外可見分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司;SY-10真空冷凍干燥機,北京松源華興科技發(fā)展有限公司;XHF-DY高速分散器,寧波新芝生物科技股份有限公司;Power PacTM基礎電泳儀,美國Bio-Rad公司;5804R多功能臺式冷凍離心機,德國艾本德公司;UltraScan PRO測色儀,美國HunterLab公司;Spectrum 100傅里葉變換紅外光譜儀,美國珀金埃爾默公司;Nano ZS90納米粒度儀,英國馬爾文公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 糖基化明膠的制備

采用干法制備糖基化明膠[2],準確稱取一定量明膠,室溫去離子水溶脹2 h,40 ℃水浴攪拌溶解1 h,使終質量濃度為0.1 g/mL,并將麥芽糊精和低聚甘露糖分別用去離子水配制為0.1 g/mL的溶液,按照V(明膠)∶V(糖)=2∶1的比例混合2種溶液。用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl調節(jié)混合溶液pH至7,40 ℃攪拌1 h,冷凍干燥。將凍干粉分別置于底部裝有飽和KCl溶液的干燥器中,65 ℃(相對濕度為79%)分別干熱反應24 h和48 h,冷凍干燥得糖基化明膠。原始明膠進行同樣干熱處理作為對照。將原始明膠記為G,麥芽糊精記為MD,麥芽糊精和明膠糖基化產(chǎn)物記為MD-G,低聚甘露糖記為OM,低聚甘露糖和明膠糖基化產(chǎn)物記為OM-G。

1.3.2 接枝度測定

接枝度采用OPA法測定,參考文獻[14]的方法制備OPA試劑。測定時,取3 mL OPA試劑與0.2 mL 1 mg/mL樣品溶液混合,室溫反應5 min,340 nm處測定吸光值,去離子水作為空白對照。用相同方法,以賴氨酸作標準曲線,根據(jù)曲線方程計算樣品中游離氨基含量。接枝度計算如公式(1)所示:

(1)

式中:w0,原始明膠的游離氨基含量;ws,糖基化明膠的游離氨基含量。

1.3.3 色差測定

分光測色儀用標準黑色背景板校準,均一樣品粉末裝入透明塑料自封袋,平鋪整齊,在塑封袋上取三點測定樣品L*、a*、b*值。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)測定

對糖基化明膠進行FT-IR測定,掃描區(qū)間為4 000～600 cm-1,分辨率為4 cm-1,掃描32次,對譜圖1 600～1 700 cm-1范圍去卷積并二階導擬合(R2>0.999),計算二級結構相對含量。

圖1 原始明膠和糖基化明膠的接枝度Fig.1 The grafting degree of the gelatin and the glycated gelatin注:組間不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

1.3.5 分子質量分布測定

參考劉廷薇等[15]的方法并略做修改。配制質量分數(shù)為5%和6%的濃縮膠和分離膠。5 mg/mL樣品溶液和4倍上樣緩沖液渦旋混勻,煮沸6 min,冷卻后上樣15 μL,并上樣5 μL標準蛋白。設置電泳儀初始電壓為80 V,待條帶進入分離膠,調節(jié)電源至120 V。條帶到達分離膠底部時,停止電泳,取出凝膠用去離子水沖洗,并用考馬斯亮藍R-250染色液染色3 h,脫色至背景透明,觀察分子質量分布。

1.3.6 乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)測定

通過比濁法測定乳化特性[16],配制pH為7的10 mg/mL的樣品溶液,以10 000 r/min的轉速將30 mL樣品溶液與10 mL大豆油均質2 min。取0 min和10 min時的管底乳液50 μL分別加入至5 mL 質量分數(shù)為0.1%的SDS溶液中,混勻后在500 nm下測定稀釋溶液的濁度。乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)通過下列公式(2)和公式(3)計算:

(2)

(3)

式中:A0,0 min時稀釋乳液的吸光值;A10,10 min時稀釋乳液的吸光值;μ,稀釋因子;ρ,樣品質量濃度,g/mL;θ,大豆油體積比例0.25。

1.3.7 乳液平均粒徑測定

配制10 mg/mL的樣品溶液,與其3倍體積的大豆油混合,10 000 r/min均質1 min,靜置4 h,稀釋至 0.1 mg/L,隨后使用納米粒度儀進行粒徑測定[16]。

1.3.8 Fe3+還原能力測定

參考WANG等[7]的方法并做適當修改,取質量濃度為1 mg/mL的樣品溶液1 mL,加入到不同具塞試管,并加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.6)和2.5 mL質量分數(shù)為1%鐵氰化鉀溶液,混合均勻。50 ℃水浴振蕩20 min,加入2.5 mL質量分數(shù)為10%三氯乙酸,3 500 r/min離心10 min。取2.5 mL上清液加入2.5 mL去離子水和0.5 mL質量分數(shù)為0.1% FeCl3溶液,混合均勻,靜置10 min,700 nm處測定吸光值,以維生素C(Vc)作標準曲線,還原能力用Vc當量表示。

1.3.9 DPPH自由基清除能力測定

參考KCHAOU等[17]的方法并適當修改,取0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液2 mL與1 mg/mL樣品溶液等體積混合、搖勻。黑暗條件室溫反應30 min,517 nm處測定吸光度,以去離子水為空白對照。DPPH自由基清除能力按公式(4)計算:

(4)

式中:A2,樣品溶液與DPPH溶液等體積混合吸光值;A1,樣品溶液與乙醇溶液等體積混合吸光值;A0,去離子水與DPPH溶液等體積混合吸光值。

1.3.10 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參考TAN等[18]的方法并適當修改。ABTS工作液配制:分別將ABTS溶液(7 mmol/L)和過硫酸鉀溶液(2.45 mmol/L)等體積混合,室溫放置12 h,用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋混合液,使其734 nm處吸光度為0.70±0.02。測定時,取1 mg/mL樣品溶液0.2 mL加入3 mL ABTS工作液,混合均勻,避光放置5 min,在波長734 nm處測定吸光度,以抗氧化劑Trolox作標曲,清除能力用Trolox當量表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 25.0、Excel 2019和peakfit 4.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,所有實驗平行3次,數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示,結果用Origin 9.5軟件作圖表示。

2 結果與分析

2.1 接枝度分析

OPA法可測定試樣游離氨基含量,賴氨酸中游離氨基是主要的糖基化位點,游離氨基含量變化可反映明膠糖基化程度[14]。如圖1所示,原始明膠的接枝度在干熱過程中保持在較低水平且無顯著變化(P>0.05),干熱時間越長,糖基化明膠接枝度越高。MD-G和OM-G干熱24 h時的接枝度分別為14.87%和22.09%,而到干熱48 h時則為26.59%和37.40%,相同干熱時間下,OM-G的接枝度顯著高于MD-G(P<0.05)。這是因為多糖和蛋白的糖基化反應受空間位阻影響較大,并且在糖與蛋白質比例相同的情況下,分子質量更小的糖具有更多反應位點[11],因此多糖的糖基化速度也比低聚糖更慢,SPOTTI等[19]的研究也發(fā)現(xiàn)葡聚糖的分子質量越小,和乳清蛋白的糖基化反應程度越高?？偟膩碚f,低聚甘露糖的糖基化反應活性比麥芽糊精更強,并且干熱48 h后的MD-G和OM-G糖基化程度都維持在較低水平(接枝度<40%)。

2.2 色差分析

褐變是美拉德反應的重要標志,美拉德反應末期產(chǎn)生的類黑精等產(chǎn)物會導致食品褐變,褐變可以反映出糖基化程度[6]。如表1和圖2所示,原始明膠在干熱過程中也會產(chǎn)生顏色變化,但變化程度弱于糖基化明膠。

表1 原始明膠和糖基化明膠的色度Table 1 Color of the gelatin and the glycated gelatin

圖2 明膠和糖基化明膠的外觀Fig.2 Appearance of gelatin and glycated gelatin

隨干熱時間延長,2種糖基化明膠的L*值顯著減小,a*值和b*值顯著增加(P<0.05),說明顏色逐漸變暗,黃色和紅色逐漸加深。OM-G顏色變化比MD-G更加明顯,可能因OM-G的接枝度隨干熱時間上升更快,其糖基化速度更快所導致。色差變化的趨勢同已報道的糖基化產(chǎn)物研究結果一致,即干熱反應時間越長,糖基化程度越高,美拉德反應末期產(chǎn)物積累量越高,導致的褐變也越嚴重[20]。

2.3 FT-IR分析

a-原始明膠與麥芽糊精-明膠對比;b-原始明膠與低聚甘露糖-明膠對比

原始明膠和糖基化明膠的二級結構含量如圖4所示,原始明膠和糖基化明膠的β-折疊在干熱糖基化過程中有輕微提升,干熱0 h的MD-G和OM-G的無規(guī)則卷曲結構占比相比于原始明膠更低,β-折疊結構更高,說明糖和明膠混合后的交聯(lián)作用影響了明膠二級結構[22]。MD-G和OM-G的二級結構含量在糖基化過程中變化相似,糖基化程度越深,α-螺旋越少,干熱48 h后,MD-G的α-螺旋占比由15.65%減少至6.36%,OM-G則由16.57%減少至5.70%,而β-轉角結構明顯增加,無規(guī)則卷曲和β-折疊也略有增加。周偉等[24]的研究表明,魚鱗明膠的酶法糖基化導致了α -螺旋消失,轉化為β-折疊和β-轉角和無規(guī)則卷曲。卜單等[25]的研究也發(fā)現(xiàn)不同還原單糖和乳白蛋白的糖基化都會使α-螺旋減少,轉化為更為穩(wěn)定的β-折疊。從蛋白二級結構含量變化也可以看出,明膠和糖混合后的交聯(lián)作用就影響了明膠的二級結構,并且糖基化也會改變交聯(lián)體系中蛋白的二級結構。

圖4 原始明膠和糖基化明膠二級結構占比Fig.4 Percentage of secondary structure of gelatin and glycated gelatin

2.4 SDS-PAGE分析

由圖5可觀察到,原始明膠2條α亞基分布于100～150 kDa,γ和β亞基分子質量大于200 kDa,但圖中不并不清晰,可能由于明膠在生產(chǎn)過程中膠原蛋白的三螺旋結構被破壞較多,導致γ和β亞基保留較少,這可提升明膠分子溶解性,并且使明膠中游離氨基暴露,減少糖基化反應時氨基同羰基結合的空間位阻[3, 5]。從1～3泳道可觀察到原始明膠的α1和α2亞基帶無明顯變化,說明干熱處理沒有影響原始明膠分子質量分布。糖基化反應會在蛋白質側鏈上共價結合上糖鏈形成糖蛋白,因此會導致蛋白分子質量升高[26],從泳道4～6和7～9可以明顯觀察到,干熱時間越長,MD-G和OM-G的α1和α2亞基分子質量越高,說明高分子質量蛋白接枝物的產(chǎn)生。研究表明,魚明膠和葡萄糖美拉德反應會導致明膠部分亞基分解[17],MD-G和OM-G的α1和α2亞基條帶干熱處理后變得模糊,并且干熱時間越長越模糊,可能由于干熱糖基化導致的明膠部分亞基分解導致,在謝思怡等[27]的研究中也觀察到糖基化處理后豬肉肌原纖維蛋白電泳圖變得不清晰,并且分子質量隨糖基化時間延長而上升的現(xiàn)象。

M-標準蛋白;1～3-干熱0、24、48 h的原始明膠;4～6-干熱0、24、48 h的MD-G;7～9-干熱0、24、48 h的OM-G

2.5 乳化性分析

2.5.1 乳化活性和乳化穩(wěn)定性分析

如圖6所示,原始明膠的乳化活性在干熱過程中輕微下降,乳化穩(wěn)定性無顯著變化(P>0.05)。糖基化改性后,MD-G和OM-G的乳化活性輕微提升,但變化也不明顯。MD-G的乳化穩(wěn)定性隨干熱時間延增加,在干熱48 h達到最高。已有研究表明,糖基化改性可以改變蛋白的三級結構,使其具有更高的表面疏水性,在油水界面的結合吸附能力增強[10]。但過長時間的干熱反應卻不利于糖基化明膠的乳化性能提升,OM-G的乳化穩(wěn)定性隨干熱時間先升高后降低,在干熱24 h達到最高,為78.75%,在干熱48 h卻降低至60.55%。值得注意的是,過長時間的糖基化處理會使蛋白質熱變性縮合,導致其溶解度降低,進而影響乳化性能[13],因此可能導致干熱24～48 h過程中,MD-G的乳化穩(wěn)定性提升不高,并且OM-G的乳化穩(wěn)定性出現(xiàn)降低現(xiàn)象?？偟膩碚f,糖基化改性主要提升了明膠的乳化穩(wěn)定性,相比于原始明膠,干熱48 h的MD-G的乳化穩(wěn)定性提升了32.67%(P<0.05),干熱24 h的OM-G提升了37.56%(P<0.05),OM-G在更短的干熱時間內即可獲更佳的提升效果。

圖6 原始明膠和糖基化明膠乳化活性(a)和乳化穩(wěn)定性(b)Fig.6 Emulsifying activity(a) and emulsifying stability(b) of gelatin and glycated gelatin

2.5.2 乳液粒徑分析

研究表明,乳化劑穩(wěn)定乳液能力和乳液粒徑呈負相關[28],如圖7所示,經(jīng)干熱后的原始明膠穩(wěn)定的乳液粒徑有輕微上升,從乳化活性和乳化穩(wěn)定性測定結果中也顯示干熱處理會導致原始明膠的乳化性能降低。干熱0 h的MD-G乳液粒徑分布較為不均,但其平均粒徑(289.3 nm)仍小于原始明膠乳液的平均粒徑(309.5 nm)。MD-G干熱時間越長,其穩(wěn)定的乳液平均粒徑更小(干熱24 h時為177.4 nm,干熱48 h時為145.0 nm),這可能因糖基化會增加體系黏度,進而導致乳液液滴界面厚度增加,防止了乳液液滴聚集[27]。低聚甘露糖本身具有較高的黏度,可能導致了干熱0 h的OM-G乳液粒徑分布較為均一,干熱24 h的OM-G乳液具有最小的平均粒徑(116.8 nm),粒徑分布為91～164 nm。但是干熱48 h的OM-G粒徑分布變寬,并且平均粒徑也比干熱24 h時更大(平均粒徑為170.7 nm),這同乳化性測定結果一致。

2.6 抗氧化活性分析

如表2所示,原始明膠在干熱過程中抗氧化活性有輕微提升但不明顯。MD-G和OM-G經(jīng)糖基化后Fe3+還原能力、ABTS陽離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力顯著提升(P<0.05)。MD-G的干熱時間越長,其抗氧化活性指標越高,說明糖基化程度越深,具有抗氧化活性的美拉德反應產(chǎn)物生成越多,但MD-G在干熱24～48 h抗氧化活性提升不如干熱0～24 h,推測為美拉德末期反應生成了大分子聚合物類黑精,受空間位阻影響,導致抗氧化活性提升減緩[6]。美拉德反應前期產(chǎn)物ARPs和中期產(chǎn)物還原酮等提供了良好的供氫能力和自由基清除活性,但前中期產(chǎn)物在糖基化過程中生成的同時也在分解[29],因OM-G糖基化速度較快,可能導致了OM-G的Fe3+還原能力和ABTS陽離子自由基清除能力在干熱48 h時低于干熱24 h。XIAO等[8]研究發(fā)現(xiàn),酶解大米蛋白-葡萄糖在糖基化過程中抗氧化活性也出現(xiàn)了上升后降低的現(xiàn)象。糖基化明膠總體的DPPH自由基清除率不高,都未超過50%,這可能是由于DPPH自由基為疏水性自由基,美拉德反應末期產(chǎn)物類黑精難溶于水,相比于水溶性自由基ABTS,更易與DPPH自由基結合反應[30],由接枝度和褐變測定結果可知,MD-G和OM-G干熱48 h后,美拉德末期反應程度較低,可能導致DPPH自由基清除率較低。

表2 原始明膠和糖基化明膠的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activity of gelatin and glycated gelatin

干熱24 h,OM-G的3種抗氧化指標提升得比MD-G更多,這可能由OM-G糖基化反應比MD-G快所導致,但在干熱48 h,OM-G的Fe3+還原能力和ABTS自由基清除能力出現(xiàn)下降趨勢,說明過長的干熱時間不利于糖基化明膠的抗氧化活性提升?？偟膩碚f,糖基化改性可顯著提高明膠抗氧化活性,干熱48 h的MD-G具有最佳的Fe3+還原能力和ABTS陽離子自由基清除能力,干熱48 h的OM-G具有最佳的DPPH自由基清除能力。

3 結論

糖基化會使明膠亞基分子質量上升和部分分解,并且也會導致明膠二級結構發(fā)生改變,且明膠同低聚糖(低聚甘露糖)的糖基化速度比多糖(麥芽糊精)快,但褐變也更明顯。糖基化改性主要影響了明膠的乳化穩(wěn)定性,對乳化活性影響較小,OM-G在較短干熱時間(24 h)即獲得了較好的乳化性能改善效果。糖基化也顯著提升了明膠的抗氧化活性,干熱時間越長,MD-G抗氧化活性越強,但過長干熱時間對OM-G抗氧化活性提升卻有不利影響。因此明膠同麥芽糊精和低聚甘露糖的干熱糖基化改性是提升明膠乳化穩(wěn)定性和抗氧化性的有效途徑,可為擴大明膠應用范圍提供指導。