雞蛋過敏原Gal d 4線性表位的預(yù)測定位及鑒定

王濤,湯鑫磊,李倩,姜松松

(揚(yáng)州大學(xué) 旅游烹飪學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州,225127)

雞蛋過敏是一種過敏性疾病,能夠引發(fā)嚴(yán)重的臨床癥狀,甚至導(dǎo)致休克、死亡,嚴(yán)重影響著人類的生活質(zhì)量和生命安全[1]。雞蛋過敏多發(fā)于在嬰幼兒時(shí)期,占嬰幼兒和兒童食物過敏的35%;同時(shí)在成人中也存在廣泛,占成年人食物過敏的12%[2-3]。在我國,雞蛋是除牛奶外,第二大導(dǎo)致嬰幼兒和兒童過敏的食物[4]。而在某些發(fā)達(dá)國家,雞蛋過敏的患病率甚至超過了牛奶[5]。雞蛋過敏原主要有6種,其中4種存在于蛋清中,包括卵類黏蛋白(ovomucoid,OVM,Gal d 1)、卵白蛋白(ovalbumin,OVA,Gal d 2)、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(ovotransferrin,OVT,Gal d 3)和溶菌酶(lysozyme,Lys,Gal d 4),另外2種存在于蛋黃中,分別為 α-卵黃蛋白(α-livetin,Gal d 5)和卵黃糖蛋白 42(yolkglycoprotein42,Gal d 6)[6]。其中,溶菌酶是存在于雞蛋蛋清中的一種過敏原蛋白,占蛋清含量的3.5%,分子質(zhì)量為14.3 kDa,它常被用于制藥產(chǎn)品、奶酪和葡萄酒行業(yè)。但多項(xiàng)研究表明,雞蛋過敏患者血液中存在溶菌酶特異性IgE抗體[7-8],這說明Gal d 4也是一類重要的蛋清過敏原。

抗原表位,即抗原決定簇,是過敏原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)。表位按照結(jié)構(gòu)特點(diǎn)通常分為線性表位和構(gòu)象表位,前者由連續(xù)的氨基酸組成,后者則是不相連的氨基酸殘基通過折疊所形成的空間結(jié)構(gòu),按照與細(xì)胞結(jié)合的類型可以分為T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位[9]。B細(xì)胞表位是可被B細(xì)胞表面受體或B細(xì)胞分泌的抗體特異性識別并相互結(jié)合的表位[10]。T細(xì)胞表位是通過主要相容組織復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)分子提呈的,CD8+T細(xì)胞表達(dá)的T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor,TCR)識別的表位由MHC-I類分子提呈,CD4+T細(xì)胞表達(dá)的TCR識別的表位由MHC-II類分子提呈[11]。T細(xì)胞表位屬于線性表位,沒有構(gòu)象結(jié)構(gòu)域。它們不能與細(xì)胞結(jié)合的IgE交聯(lián)或激活肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞,但可以引發(fā)T細(xì)胞產(chǎn)生增殖、分化,是決定過敏反應(yīng)的關(guān)鍵。因此,獲得B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位信息是充分了解食物過敏致敏機(jī)理的基礎(chǔ)。

目前,已有大量研究對雞蛋蛋清致敏原Gal d 1、Gal d 2 和 Gal d 3 的線性表位進(jìn)行了研究。但目前關(guān)于Gal d 4的線性表位尚未被表征。目前來說,線性表位的分析方法主要有傳統(tǒng)化學(xué)切割法、重疊合成肽庫法、核磁共振分析法、質(zhì)譜技術(shù)以及生物信息學(xué)預(yù)測方法[12]。重疊合成肽等方法由于其高昂的實(shí)驗(yàn)成本以及較大的盲目性使其不適合大規(guī)模應(yīng)用[13],生物信息學(xué)方法是一種新興的預(yù)測線性表位的方法[14],其原理是對已知的線性表位特點(diǎn)進(jìn)行歸納后,發(fā)現(xiàn)親水性殘基與表面可及性較高區(qū)域可能位于分子表面,因此這些區(qū)域相比較而言形成抗原表位的可能性較大,可塑性較高的區(qū)域表明這部分具有較好的柔韌性,也容易形成利于抗體能夠識別的空間結(jié)構(gòu),是表位所在區(qū)域的概率也較高[15]。生物信息學(xué)方法對食物過敏原表位的預(yù)測有利于研究潛在的抗原表位,在一定程度上可以減少分析過敏原結(jié)構(gòu)與功能所消耗的時(shí)間與費(fèi)用[16]。

因此,本研究擬通過使用生物信息學(xué)方法預(yù)測雞蛋過敏原Gal d 4的線性表位,并對其線性表位進(jìn)行空間定位,隨后對預(yù)測所得B細(xì)胞線性表位進(jìn)行鑒定,為進(jìn)一步認(rèn)識雞蛋過敏原Gal d 4的結(jié)構(gòu)與功能奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)方法分析雞蛋過敏原Gal d 4 的線性表位

在Uniprot數(shù)據(jù)庫獲取雞蛋過敏原Gal d 4的氨基酸序列。使用SignalP-5.0 services軟件對Gal d 4信號肽進(jìn)行預(yù)測。使用生物信息學(xué)軟件DNAStar Protean中的Hoop-woods的氨基酸親水性方案[17]、Emini的表面可及性算法[18]、Kparlus-Schuzl的可塑性分析[19]和Jameson-wolf的抗原指數(shù)分析方案[20],對Gal d 4的一級序列性質(zhì)進(jìn)行分析,綜合分析這些參數(shù)預(yù)測結(jié)果的重疊部分后,得出DNAStar預(yù)測所得的雞蛋過敏原Gal d 4的B細(xì)胞線性表位序列。

分別使用Immunomedicine Group中的predicted antigenic peptides(IGPAP)、Bepipred-2.0 server和ABCpred在線工具對Gal d 4的B細(xì)胞線性表位進(jìn)行預(yù)測。篩選以上3種方法預(yù)測所得的B細(xì)胞線性表位的重疊區(qū)域作為最終所得的Gal d 4的B細(xì)胞線性表位序列。

分別利用SYFPEITHI、NetMHC和NetCTL三種在線工具預(yù)測Gal d 4 的CD8+T細(xì)胞表位。表位肽段長度設(shè)置為9 AA。MHC類型選擇人白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)-I類分子HLA-A*02:01(A2)和HLA-A*03:01(A3)作為限定條件。SYFPEITHI分析結(jié)果選取得分在前2%的肽段作為可能性較大的表位肽段;NetMHC分析結(jié)果親和值<50 nm的肽段作為強(qiáng)結(jié)合肽段,50 nm<親和值<500 nm的肽段為弱結(jié)合肽段;NetCTL預(yù)測所得表位鑒定的閾值為0.75。

利用NetMHCⅡpan 4.0 Serer在線工具預(yù)測Gal d 4 的CD4+T細(xì)胞表位。表位肽段的長度設(shè)置為15 AA,選取HLA-Ⅱ類分子 (HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*0901、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB1*1302、HLA-DRB1*1501)作為預(yù)測限定條件。表位肽段與HLA-Ⅱ類分子的親和性閾值為50 nm,親和值<50 nm的肽段為強(qiáng)結(jié)合肽段,50 nm<親和值<500 nm的肽段為弱結(jié)合肽段。

1.2 生物信息學(xué)方法分析雞蛋過敏原Gal d 4二級結(jié)構(gòu)

使用DNAStar Protean載入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫中下載的FASTA格式的雞蛋過敏原Gal d 4的氨基酸序列,對其二級結(jié)構(gòu)使用Chou-Fasman以及Garnier-Robson方案進(jìn)行預(yù)測分析。

1.3 空間定位

在PDB數(shù)據(jù)庫中查找雞蛋過敏原Gal d 4的三級結(jié)構(gòu)模型,將使用生物信息學(xué)軟件預(yù)測所得的Gal d 4的B細(xì)胞線性表位序列進(jìn)行空間定位。

1.4 免疫活性鑒定

生物信息學(xué)軟件預(yù)測所得的B細(xì)胞線性表位經(jīng)Fmoc法固相合成,采用高效液相色譜分析純度。收集的6名雞蛋過敏患者的血清,采用間接競爭ELISA實(shí)驗(yàn)對合成的預(yù)測線性表位進(jìn)行IgE結(jié)合活性驗(yàn)證。根據(jù)FU等[21]的方法略有改動,使用純化的Gal d 4包被在96孔板上孵育過夜。3%牛血清白蛋白封閉2 h后,合成肽(B1～B5)與單個(gè)血清樣品在37 ℃下孵育1.5 h,一抗為收集的雞蛋過敏患者血清,山羊抗人IgE-辣根過氧化物酶為二抗,稀釋度均為1∶50。H2SO4終止反應(yīng)后,在450 nm處測定吸光度。IgE結(jié)合活性抑制率按公式(1)計(jì)算:

抑制率/%=(1-OD450/OD0)×100

(1)

式中:OD0,空白樣吸光度;OD450,450 nm處吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與圖標(biāo)繪制工具主要為DNAStar軟件、SignalP- 5.0 services(https://services.healthtech.dtu.dk/)、Predicted Antigenic Peptides(http://imed.med.ucm.es/)、Bepipred-2.0 server(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html)、ABCpred(http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/)、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)、NetMHC(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHC-4.0)、NetCTL(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetCTL-1.2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞蛋過敏原Gal d 4信號肽預(yù)測

如圖1所示,1MRSLLILVLCFLPLAALG18前18個(gè)氨基酸殘基為Gal d 4信號肽的可能性為99.72%。信號肽是引導(dǎo)新和成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈,通常疏水性較強(qiáng),不適合作為線性抗原表位。

圖1 SignalP- 5.0 services預(yù)測所得Gal d 4信號肽序列Fig.1 The Gal d 4 signal peptide sequence was predicted by signalP-5.0 Services注:圖中下劃線部分為預(yù)測所得信號肽區(qū)域。

2.2 DNAStar預(yù)測雞蛋過敏原Gal d 4的B細(xì)胞線性表位

親水性和表面可及性高的區(qū)域一般分布在蛋白質(zhì)分子的表面,易產(chǎn)生表位與抗體結(jié)合的區(qū)域,而可塑性較強(qiáng)的區(qū)域由于其易發(fā)生折疊和扭曲,因此,也容易形成利于抗體能夠識別的空間結(jié)構(gòu)[22]。如圖2所示,在氨基酸親水性方案分析中,親水性指數(shù)>0表明親水性好,雞蛋過敏原Gal d 4的親水性區(qū)域分布較為均勻,親水性較好的氨基酸肽段為AA 22～26、AA 27～37、AA 52～55、AA 60～69、AA 84～92、AA 111～122和AA 130～137;以表面可及性指數(shù)>1為篩選條件,表面可及性較好的氨基酸肽段為AA 29～41、AA 52～67、AA 84～91和AA 128～136;在可塑性方案分析中,AA 35～40、AA 52～70、AA 83～93、AA 102～107、AA 117～122和AA 131～137的氨基酸肽段具有一定的柔韌性,形成表位的可能性較大,容易與抗體進(jìn)行嵌合[23];在抗原指數(shù)分析中,以抗原指數(shù)>0為篩選條件,結(jié)果顯示抗原指數(shù)較高的氨基酸肽段為AA 19～26、AA 27～45、AA 51～72、AA 77～94、AA 102～107、AA 110～124、AA 128～137和AA 143～146,這些區(qū)域可能含有潛在的優(yōu)勢抗原表位。

圖2 DNAStar對Gal d 4的一級氨基酸序列分析Fig.2 Sequence analysis of primary amino acid of Gal d 4 by DNAStar

綜合以上參數(shù),篩選出同時(shí)滿足4個(gè)條件的氨基酸序列作為雞蛋過敏原Gal d 4的B細(xì)胞線性表位候選氨基酸序列。結(jié)果如表1所示,DNAStar預(yù)測Gal d 4 B細(xì)胞線性表位為:19KVFGRCEL26、27AAAMKRHGLDNYRG40、52FESNFNTQATNRNTDG67、83NDGRTPGSRNL93、117VSDGNGMN124和130RNRCKGTD137。

表1 DNAStar預(yù)測Gal d 4 B細(xì)胞線性表位Table 1 DNAStar prediction of B cell linear epitopes of Gal d 4

2.3 IGPAP預(yù)測雞蛋過敏原Gal d 4的B細(xì)胞線性表位

進(jìn)一步采用IGPAP預(yù)測雞蛋過敏原Gal d 4的B細(xì)胞線性表位,根據(jù)KOLASKAR等[24]的方法預(yù)測抗原表位,結(jié)果如表2所示,IGPAP預(yù)測Gal d 4的B細(xì)胞線性表位為:4LLILVLCFLPLAALGKVFGRCELAA28、43LGNWVCAA50、92NLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKI116和134KGTDVQAWIRG144。

表2 IGPAP預(yù)測Gal d 4 B細(xì)胞線性表位Table 2 IGPAP prediction of B cell linear epitopes of Gal d 4

2.4 Bepipred預(yù)測雞蛋過敏原Gal d 4的B細(xì)胞線性表位

同時(shí),采用Bepipred-2.0 server在線工具使用隱馬爾可夫模型和親水性參數(shù)評分預(yù)測Gal d 4 B細(xì)胞線性表位序列[25]。結(jié)果如表3所示,Bepipred-2.0 server預(yù)測Gal d 4 B細(xì)胞線性表位為:19KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGN45、57NTQATNRNTDGST-DYGIL74、76INSRWWCNDGRTPGSRNLCNI96和115KIVSDGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRG144。

表3 Bepipred預(yù)測Gal d 4 B細(xì)胞線性表位Table 3 Bepipred prediction of B cell linear epitopes of Gal d 4

2.5 ABCpred預(yù)測雞蛋過敏原Gal d 4 B細(xì)胞線性表位

最后,將雞蛋過敏原Gal d 4氨基酸序列提交到ABCpred網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器后,利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測出Gal d 4的B細(xì)胞線性表位序列[26]。結(jié)果如表4所示,ABCpred預(yù)測Gal d 4 B細(xì)胞線性表位為:19KVFGRCELAAAMKR32、44GNWVCAAKFESNFNTQA60、65TDGSTDYGILQ75、78SRWWCND84、87TPGSRNLCNIP97和132RCKGTDVQAWI142。

表4 ABCpred預(yù)測Gal d 4 B細(xì)胞線性表位Table 4 ABCpred prediction of B cell linear epitopes of Gal d 4

2.6 雞蛋過敏原Gal d 4 B細(xì)胞線性表位的綜合分析

綜合DNAStar、IGPAP、Bepipred-2.0 server以及ABCpred預(yù)測所得的Gal d 4 B細(xì)胞線性表位序列結(jié)果,如圖3所示,4種軟件預(yù)測重疊氨基酸序列為:19KVFGRCELAA28、92NL93和134KGTD137。3種軟件預(yù)測重疊氨基酸序列為:29AMKR32、44GN45、57NTQA60、65TDG67、83ND84、87TPGSR91、94CNI96、132RC133、138VQAWI142。因此,綜合以上結(jié)果,將3種及以上軟件預(yù)測重疊氨基酸數(shù)≥3的序列作為雞蛋過敏原Gal d 4的B細(xì)胞線性表位,這些氨基酸序列是B細(xì)胞表位的可能性較大,可作為研究重點(diǎn)。如表5所示,綜合分析所得Gal d 4的B細(xì)胞線性表位為:19KVFGRCELAAAM-KR32、57NTQA60、65TDG67、87TP-GSRNLCNI96和132RCKGTDVQAWI142。

表5 不同軟件預(yù)測Gal d 4 B細(xì)胞線性表位的氨基酸序列Table 5 Amino acid sequences of B cells linear epitopes of Gal d 4 predicted by different software

圖3 不同軟件預(yù)測Gal d 4的B細(xì)胞線性表位的綜合分析Fig.3 Comprehensive analysis of B cells linear epitopes of Gal d 4 predicted by different software注:圓角矩形方框內(nèi)為4種軟件預(yù)測重疊氨基酸序列;直角矩形方框內(nèi)為3種軟件預(yù)測重疊氨基酸序列。

2.7 雞蛋過敏原Gal d 4的CD8+ T細(xì)胞表位預(yù)測

SYFPEITHI、NetMHC和NetCTL三種在線工具可切斷肽鏈羧基的蛋白酶體并分析對肽段進(jìn)行加工和轉(zhuǎn)運(yùn)的速率,從而計(jì)算得分。預(yù)測所得Gal d 4 的CD8+T細(xì)胞表位結(jié)果如表6所示,與HLA-I類分子結(jié)合較好的表位肽段有42SLGNWVCAA50、100ALLSSDITA108。

表6 預(yù)測所得Gal d 4 的CD8+ T細(xì)胞表位Table 6 Comprehensive analysis of CD8+ T cell epitopes of Gal d 4

2.8 雞蛋過敏原Gal d 4的CD4+ T細(xì)胞表位預(yù)測

利用NetMHCⅡpan 4.0 Serer 在線工具預(yù)測Gal d 4 的CD4+T細(xì)胞表位結(jié)果如表7所示。每個(gè)HLA-Ⅱ類分子結(jié)合的肽段數(shù)量都有所不同,其中,HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401和HLA-DRB1*1501分別含有4、5、4個(gè)強(qiáng)結(jié)合肽段,大部分HLA-Ⅱ類分子都含有數(shù)目不同的弱結(jié)合肽段。

表7 預(yù)測所得Gal d 4 的CD4+ T細(xì)胞表位Table 7 Comprehensive analysis of CD4+ T cell epitopes of Gal d 4

2.9 雞蛋過敏原Gal d 4的T細(xì)胞表位綜合分析

雞蛋過敏原Gal d 4的T細(xì)胞表位綜合分析如表8所示。根據(jù)CD4+T抗原表位覆蓋CD8+T細(xì)胞抗原表位的原則,得到2條優(yōu)勢表位,即42SLGNWVCAA50和100ALLSSDITA108。

表8 預(yù)測所得Gal d 4 的T細(xì)胞表位綜合分析Table 8 Comprehensive analysis of T cell epitopes of Gal d 4

2.10 雞蛋過敏原Gal d 4的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖4為使用DNAStar軟件中的Chou-Fasman和Garnier-Robson方案對Gal d 4二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測的結(jié)果[27]。分析可知,2種方案預(yù)測該蛋白二級結(jié)構(gòu)的類型中α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占據(jù)了主要優(yōu)勢,β-折疊次之?？傮w來看,Gal d 4二級結(jié)構(gòu)中有序的螺旋、轉(zhuǎn)角和折疊占據(jù)了主要優(yōu)勢,無規(guī)則卷曲的比例較小,反映了該蛋白具有較為致密的結(jié)構(gòu)。

圖4 Gal d 4的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of secondary structure of Gal d 4

2.11 雞蛋過敏原Gal d 4線性表位的空間定位

通過在PDB數(shù)據(jù)庫下載雞蛋過敏原Gal d 4三維空間結(jié)構(gòu),利用PyMOL軟件對表5和表8中預(yù)測所得的線性表位在雞蛋過敏原Gal d 4的空間結(jié)構(gòu)中進(jìn)行定位,結(jié)果如圖5所示。如圖5-A1所示,圖中彩色區(qū)域是預(yù)測所得B細(xì)胞線性表位在Gal d 4分子飄帶模型的空間結(jié)構(gòu)中的定位,5個(gè)模擬表位均已在圖中用數(shù)字標(biāo)注。其中,19KVFGRCELAAAMKR32位于α-螺旋與無規(guī)則卷曲的連接處;57NTQA60位于β-折疊與無規(guī)則卷曲的連接處;65TDG67位于β-折疊與β-轉(zhuǎn)角的連接處;87TPGSRNLCNI96和132RCKGTDVQAWI142位于無規(guī)則卷曲區(qū)域。α-螺旋與β-折疊的結(jié)構(gòu)特征能夠較好的保持穩(wěn)定,β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)則卷曲具有較好的可塑性以及表面可及性,有利于抗原表位的形成,這表明5個(gè)模擬表位成為B細(xì)胞線性表位的潛力較大。圖5-A2～圖5-A3分別為Gal d 4表面分子模型正視圖與翻轉(zhuǎn)180°后的背視圖。如圖所示,2個(gè)視圖中的5個(gè)B細(xì)胞模擬表位基本完全暴露在外,具有較好的表面可及性以及較大的接觸面積,利于在溶液的環(huán)境中與抗體互相作用。值得注意的是,在圖5-A2和圖5-A3中,19KVFGRCELAAAMKR32、57NTQA60和132RCKGTDVQAWI142、65TDG67和87TPGSRNLCNI96在氨基酸序列上不連續(xù),卻在空間結(jié)構(gòu)上鄰近,使其具有成為構(gòu)象表位的潛力。

A-預(yù)測所得Gal d 4 B細(xì)胞線性表位;B-預(yù)測所得Gal d 4 T細(xì)胞表位;A1-預(yù)測所得B細(xì)胞線性表位在Gal d 4 分子飄帶模型中的定位;A2～A3預(yù)測所得B細(xì)胞線性表位在Gal d 4表面分子模型暴露情況;B1-預(yù)測所得T細(xì)胞表位在Gal d 4分子飄帶模型中的定位;B2～B3預(yù)測所得T細(xì)胞表位在Gal d 4表面分子模型暴露情況

圖5-B為預(yù)測所得T細(xì)胞表位在Gal d 4空間結(jié)構(gòu)的定位。42SLGNWVCAA50和100ALLSSDITA108均位于α-螺旋與無規(guī)則卷曲的連接處,能較好的與MHC分子結(jié)合形成抗原肽從而被T細(xì)胞識別誘發(fā)免疫反應(yīng)。

2.12 雞蛋過敏原Gal d 4的B細(xì)胞線性表位的空間定位

預(yù)測所得的B細(xì)胞線性表位IgE結(jié)合活性驗(yàn)證結(jié)果如圖6所示。

圖6 Gal d 4的B細(xì)胞線性表位鑒定Fig.6 Identifcation of linear epitopes of B cells of Gal d 4注:Lys為雞蛋溶菌酶純品,不同字母標(biāo)記表示為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異性。

B1對雞蛋過敏病人血清與致敏蛋白的特異性結(jié)合具有顯著的抑制作用,這表明其免疫活性較強(qiáng),具有一定的致敏性。B2～B5肽段則未顯示出明顯的抑制作用,表明其致敏潛力較小。因此,我們推斷B1:19KVFGRCELAAAMKR32為Gal d 4 的B 細(xì)胞線性表位。

3 結(jié)論與討論

本研究通過生物信息學(xué)方法對雞蛋過敏原Gal d 4的線性表位進(jìn)行預(yù)測分析,最終篩選出5個(gè)B細(xì)胞線性表位,分別為:19KVFGRCELAA AMKR32、57NTQA60、65TDG67、87TPGSRNLCNI96和132RCKGTDVQAWI142;2個(gè)T細(xì)胞抗原表位,分別為:42SLGNWVCAA50和100ALLSSDITA108。B細(xì)胞線性表位大部分位于親水性、表面可及性以及可塑性較強(qiáng)的區(qū)域。蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸被包被于蛋白內(nèi)部,親水性氨基酸一般位于蛋白表面,因而,親水性較強(qiáng)的區(qū)域易于抗體結(jié)合產(chǎn)生相互作用;表面可及性主要指溶劑分子接觸抗原氨基酸的可能性,間接反映了與抗體的結(jié)合能力;可塑性強(qiáng)的區(qū)域的氨基酸易發(fā)生折疊和扭曲,有利于抗原與抗體的嵌合[28]。LI等[29]預(yù)測所得水牛乳β-乳球蛋白表位也位于親水性、表面可及性以及可塑性較強(qiáng)的區(qū)域。結(jié)合雞蛋過敏原Gal d 4的二級結(jié)構(gòu)以及三維空間結(jié)構(gòu)可知,Gal d 4的空間結(jié)構(gòu)是由3個(gè)α-螺旋、1個(gè)β-折疊以及部分β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成的。由二硫鍵形成α-螺旋在維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面起到非常重要的作用[30];無規(guī)則卷曲多暴露在蛋白分子表面,有利于其與抗體嵌合;同時(shí)α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角具有較高的氫鍵能,可以保持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),并與抗體產(chǎn)生強(qiáng)烈的相互作用[31],這些使Gal d 4蛋白形成致密的球狀分子,為其致敏性提供了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在本研究中預(yù)測所得的5個(gè)B細(xì)胞線性表位位于無規(guī)則卷曲與α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角的連接處或無規(guī)則卷曲處,馬秀麗等[32]通過生物信息學(xué)方法預(yù)測的芝麻過敏原蛋白Ses i 3的B細(xì)胞線性表位大多分布在β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域。而李雪嬌等[33]通過生物信息學(xué)方法預(yù)測小麥過敏原B細(xì)胞線性表位則位于無規(guī)卷曲處和α-螺旋與無規(guī)卷曲的連接處,這與本研究預(yù)測結(jié)果相似。將5個(gè)B細(xì)胞線性表位定位在分子表面發(fā)現(xiàn),5個(gè)表位大部分暴露在分子表面,具有較好的表面可及性以及較大的接觸面積,利于在溶液的環(huán)境中與抗體互相作用。值得注意的是,在本研究中發(fā)現(xiàn),非連續(xù)的B細(xì)胞模擬線性表位片段19KVFGRCELAAAMKR32、57NTQA60和132RCKGTDVQAWI142、65TDG67和87TPGSRNLCNI96在空間結(jié)構(gòu)上鄰近,這使其具有了形成構(gòu)象表位的潛力。這表明,連續(xù)的氨基酸序列在成為線性表位的同時(shí),具有一定的潛力與空間上鄰近的其他具有較大可能成為抗原表位的氨基酸序列形成構(gòu)象表位。GUO等[34]在對核桃過敏原Jug r 1的研究中也證實(shí)了表位既可以是氨基酸的線性序列(線性表位),又可以是三維結(jié)構(gòu)的基序(構(gòu)象表位),這與本研究結(jié)果一致。

T細(xì)胞表位是能被MHC分子遞呈和T細(xì)胞識別的抗原表位多肽,在細(xì)胞免疫中起著重要作用。目前T細(xì)胞表位生物信息學(xué)技術(shù)比較成熟,尤其是與MHC-I類分子結(jié)合的CD8+T細(xì)胞表位,預(yù)測的精確率已達(dá)80%以上,雖然與MHC-II類分子結(jié)合的CD4+T細(xì)胞表位預(yù)測稍遜于前者,但隨著生物信息學(xué)的發(fā)展也日趨成熟[35]。PASCAL等[36]使用NetMHCⅡpan-2.0算法預(yù)測Ara h 2肽段與HLA-II類分子結(jié)合力強(qiáng)的區(qū)域,最終鑒定了Ara h 2中的4個(gè)T細(xì)胞抗原表位。本研究預(yù)測所得T細(xì)胞表位經(jīng)空間定位后發(fā)現(xiàn),42SLGNWVCAA50大部分被包藏于蛋白分子內(nèi)部,可能于消化后暴露增強(qiáng)其致敏性。

但從理論和實(shí)際效果看,針對線性表位相關(guān)預(yù)測方法雖然取得了一定的進(jìn)展,但同時(shí)也存在著一定的缺陷,缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估和比較[37]。也有研究表明,僅僅依靠氨基酸序列展現(xiàn)的性質(zhì)所預(yù)測得到的模擬表位的方法并不牢靠,需要與非表位特性的特征結(jié)合起來以提高預(yù)測模擬表位的準(zhǔn)確性[38]。對絕大多數(shù)食物過敏而言,過敏原初次接觸機(jī)體,通過一系列反應(yīng),刺激B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體,過敏原再次接觸,其B細(xì)胞表位與IgE抗體結(jié)合,誘發(fā)過敏反應(yīng),因此B細(xì)胞的線性表位十分重要。本研究通過固相肽合成方法[39]結(jié)合間接競爭ELISA對預(yù)測所得模擬表位進(jìn)行鑒定,以此提高表征B細(xì)胞線性表位的精確性。結(jié)果表明,只有B1肽段具有較好的IgE結(jié)合活性,說明其成為B細(xì)胞線性表位的潛力巨大。剩余4個(gè)預(yù)測所得模擬表位展現(xiàn)較弱的抑制作用,可能是因?yàn)槠浒被嵝蛄兄邪穗u蛋溶菌酶的部分B細(xì)胞線性表位但并不完全,也有可能是因?yàn)殡u蛋過敏患者的差異性,導(dǎo)致其特異性結(jié)合效果并不理想。

綜上,本研究首次對雞蛋過敏原Gal d 4的B細(xì)胞線性表位和T細(xì)胞表位同時(shí)進(jìn)行表征,獲得了5個(gè)模擬B細(xì)胞線性表位:19KVFGRCELAAAMKR32、57NTQA60、65TDG67、87TPGSRNLCNI96和132RCKGTD-VQAWI142以及2個(gè)模擬T細(xì)胞抗原表位:42SLGNWVCAA50和100ALLSSDITA108,對其在Gal d 4的三維結(jié)構(gòu)模型上進(jìn)行空間定位,最后通過固相肽合成結(jié)合間接競爭ELISA對預(yù)測所得模擬表位進(jìn)行鑒定,得到一個(gè)優(yōu)勢B細(xì)胞線性表位:19KVFGRCELAAAMKR32。這為進(jìn)一步明確溶菌酶Gal d 4的表位提供了依據(jù),同時(shí)也為雞蛋過敏原的識別與檢測提供了參考。