氧化白藜蘆醇的合成工藝改進及其抗氧化活性

陳瑩,周華,晏日安

(暨南大學 理工學院,廣東 廣州,510632)

氧化白藜蘆醇,又名氧化芪三酚,結構如圖1所示,其分子式為C14H12O4,分子質量244.24,熔點199～204 ℃,外觀呈淡黃色非晶型固體,可溶于甲醇、乙醇、二甲基亞砜等有機溶劑。氧化白藜蘆醇作為天然產物白藜蘆醇2′-位的羥基化衍生物,結構上含4個酚羥基,具備多種有益的生物和藥理活性(抗腫瘤、抗癌、抗氧化、抗炎和抗肥胖等作用[1-5]),此外還具有保肝、抑制酪氨酸酶和改善帕金森癥等作用[6-8]。大量研究顯示含有氧化白藜蘆醇的食品或者口服藥物安全且低毒,未來將廣泛應用于保健品、化妝品及藥品等領域當中[9]。

圖1 氧化白藜蘆醇結構Fig.1 Structure of oxyresveratrol

氧化白藜蘆醇主要存在于多種天然植物當中,如:桑樹、紫檀科、藜蘆、菠蘿蜜、買麻藤屬、片麻巖科和菝葜屬等[10-11],但含量很低,且分離純化較困難。目前,人們主要通過植物提取法、微生物轉化[12-13]和化學合成法來獲取氧化白藜蘆醇。趙建萍等[14]采用乙醇提取法提取拓木莖粗提液,并使用AB-8大孔樹脂分離純化獲得氧化白藜蘆醇,其提取及精制工藝過程過于復雜,且未報道其收率;PARK等[15]運用Pectinex?對桑椹苷A的酶解來產生氧化白藜蘆醇,其中桑椹苷也需從植物中提取,且價格與氧化白藜蘆醇的市場價相近,由此可見植物提取法和微生物轉化法并不適合于大規(guī)模的工業(yè)化生產。氧化白藜蘆醇功效強大且毒副作用小,其市場需求大但來源不足,從而導致其價格昂貴,嚴重制約了其在保健食品、功能飲料、天然藥物及化妝品等領域內的開發(fā)。因此,探索出反應條件溫和、簡潔高效、操作簡單以及綠色環(huán)保的化學全合成氧化白藜蘆醇的路線頗有意義。

化學合成氧化白藜蘆醇的關鍵點在于其反式二苯乙烯骨架的構建,根據國內外相關文獻,目前構建反式二苯乙烯骨架的方法主要有Perkin反應法、Heck反應法、Wittig反應法以及Wittig-Horner反應法,其中,Perkin反應得到的雙鍵為順式構型,需進行異構化轉化,操作復雜;Heck反應條件苛刻,鹵代物制備污染大;Wittig反應選擇性不高,收率低;Wittig-Horner反應法是Wittig反應法的改良,該反應條件溫和、后處理簡單,得到的雙鍵皆為反式構型且收率高[16-17]。2004年CHOI等[18]以3,5-二甲氧基芐基溴與三苯基膦反應制得相應的Wittig鹽,再與2,4-二甲氧基苯甲醛通過Witing反應構建雙鍵骨架,經碘異構化反應后,最終以格氏試劑甲基碘化鎂(CH3MgI)脫除甲基制得氧化白藜蘆醇,總收率較低;2010年SUN等[19]以3,5-二羥基苯乙酮經甲基化反應和Willgerodt-Kindler重排反應得到3,5-二甲氧基苯乙酸,再與2,4-二甲氧基苯甲醛發(fā)生Perkin反應構建雙鍵骨架,經脫羧和脫甲基反應后,同樣還需異構化反應才能合成氧化白藜蘆醇,總收率30%;2012年,李曉霞等[20]以3,4-二甲氧基芐醇為原料,經溴代、Arbuzov重排反應、Wittig-Horner反應構建二苯乙烯骨架,最后用無水AlCl3脫除甲基獲得白皮杉醇,產率43.7%;2013年鄭群怡等[21]從3,5-二甲氧基苯甲醇出發(fā),經HBr于甲苯中溴代,Arbuzov重排反應、Wittig-Horner反應獲得反式二苯乙烯骨架,最后使用CH3MgI脫除甲基得到氧化白藜蘆醇,脫甲基步驟較為繁瑣,且工藝過程中用到甲苯等有毒試劑,污染大;2016年李志偉等[22]由間苯二酚經碘代反應、Heck反應和脫羧反應制得中間體2,4-二羥基苯乙烯,再與3,5-二羥基碘苯在鈀催化下再次發(fā)生Heck反應制得氧化白藜蘆醇,該路線條件苛刻且成本高。

本研究在國內外已有合成路線的基礎上,為克服這些路線所存在的原料昂貴、路線長、操作危險性大、不夠環(huán)保及收率低等缺點,對氧化白藜蘆醇的合成工藝進行改進。選擇Wittig-Horner反應法來構建反式二苯乙烯骨架,以3,5-二甲氧基芐醇、2,4-二甲氧基苯甲醛為原料,經溴代、Arbuzov重排反應、Wittig-Horner反應和脫甲基反應四步合成氧化白藜蘆醇,對工藝條件進行優(yōu)化,重點對脫甲基試劑進行了優(yōu)選。以維生素C、BHT和TBHQ為參照,通過DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力和鐵離子還原能力評價了氧化白藜蘆醇的抗氧化活性,并與同為多酚類的化合物白皮杉醇、白藜蘆醇和茶多酚作對比,期望為氧化白藜蘆醇的工業(yè)化生產及其未來在食品、化妝品、藥品等領域中的運用提供理論與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

3,5-二甲氧基芐醇、2,4-二甲氧基苯甲醛、甲醇鈉、N,N-二甲基甲酰胺、無水AlCl3、BBr3(1.0 mol/L CH2Cl2溶液),安徽澤升科技有限公司;PBr3、亞磷酸三乙酯、吡啶、HBr溶液(質量分數為40%),ABTS、DPPH,上海麥克林生化科技有限公司;吡啶鹽酸鹽、CH3MgI(3.0 mol/L乙醚溶液),上海吉至生化科技有限公司;BCl3(1.0 mol/L CH2Cl2溶液),北京百靈威科技有限公司;氘代氯仿、氘代甲醇,安諾倫(北京)生物科技有限公司;白藜蘆醇、白皮杉醇均為實驗室合成;茶多酚(≥98.0%)、2,6-二叔丁基對甲酚(2,6-butylated hydroxytoluene,BHT,>99.0%)、特丁基對苯二酚(tert-butylhydroquinone,TBHQ,98.0%)、維生素C(99.0%),北京索萊寶科技有限公司;其他所用化學試劑均為市售化學純或分析純。

1.1.2 儀器與設備

手提式紫外分析儀,華睿鼎順(北京)科貿有限公司;X-5控溫型顯微熔點測定儀,北京泰克儀器有限公司;AL204電子天平,瑞士梅特勒-托利多公司;Infinite M200Pro多功能酶標儀,瑞士Tecan公司;EQUINOX55紅外光譜儀、AVANCEⅢ型核磁共振波譜儀(600 MHz),布魯克科學儀器公司;N-1300型低溫反應儀,東京理化器械株式會社;X500R QTOF型高分辨質譜儀,上海愛博才思分析儀器貿易有限公司;MS-H-Pro磁力攪拌器,美國賽洛捷克公司;N-1300型旋轉蒸發(fā)儀,東京理化器械株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 合成路線

如圖2所示,首先由3,5-二甲氧基芐醇(化合物1)與PBr3發(fā)生溴代反應制得3,5-二甲氧基芐溴(化合物2);化合物2與P(OEt)3通過Arbuzov重排反應制得Wittig-Horner試劑3,5-二甲氧基芐基磷酸二乙酯(化合物3);化合物3和2,4-二甲氧基苯甲醛(化合物4)通過Wittig-Horner反應構建反式二苯乙烯骨架制得中間體2,3′,4,5′-四甲氧基二苯乙烯(化合物5);最后化合物5在無水AlCl3的作用下脫除甲基合成終產物氧化白藜蘆醇(化合物6)。

圖2 氧化白藜蘆醇的合成路線Fig.2 Synthesis route of oxyresveratrol

1.2.2 合成方法

1.2.2.1 3,5-二甲氧基芐溴(化合物2)[23]

取8.00 g(0.048 mol)3,5-二甲氧基芐醇、56 mL無水CH2Cl2于250 mL圓底燒瓶中,N2保護,攪拌溶解。在0 ℃條件下,緩慢滴加含2.60 mL PBr3的CH2Cl2溶液(9.60 mL)于反應瓶中,滴加完畢于0 ℃反應1 h,轉至室溫繼續(xù)反應3～4 h,薄層層析色譜(thin layer chromatography,TLC)監(jiān)測。反應結束后,

將反應液緩慢倒入冰水中,分液,水層用CH2Cl2洗滌,合并有機相,有機相用飽和NaCl溶液洗滌至中性,無水Na2SO4干燥,過濾,旋轉蒸發(fā)除去CH2Cl2,得到淡黃色固體粗品,用甲醇重結晶得到白色晶體(2,10.79 g,0.047 mol),收率97.3%。熔點71～73.5 ℃(文獻值[23]72.9～73.8 ℃)。

1.2.2.2 3, 5-二甲氧基芐基磷酸二乙酯(化合物3)[24]

取5.00 g(0.022 mol) 3,5-二甲氧基芐溴、13 mL亞磷酸三乙酯于50 mL圓底燒瓶中,充分攪拌,先升溫至100 ℃反應約1 h,待溴乙烷等低沸點副產物蒸出后,裝上回流冷凝管,再升溫至130 ℃繼續(xù)回流反應4 h,TLC監(jiān)測反應。待反應結束后,停止反應,使反應液冷卻至室溫,于120 ℃條件下進行減壓蒸餾,除去未反應的亞磷酸三乙酯,得到淡黃色油狀液體(3,5-二甲氧基芐基磷酸二乙酯粗品),無需進一步柱層析純化,直接投入下一步反應。1H NMR (600 MHz,氘代氯仿) δ 6.46(t,J=2.4 Hz,2H,2×Ar—H),6.35(q,J=2.3 Hz,1H,Ar—H),4.08-3.97(m,4H,2×O—CH2),3.77(s,6H,2×O—CH3),3.11(s,1H,Ar—CH2),3.07(s,1H,Ar—CH2),1.26(t,J=7.1 Hz,6H,2×O—CH3)。MS(ESI),m/z:C13H21O5P [M+H]+,理論值289.119 9,實測值289.120 4。

1.2.2.3 2,3′,4,5′-四甲氧基二苯乙烯(化合物5)[25]

1.2.2.4 氧化白藜蘆醇(化合物6)[20]

1.2.3 抗氧化活性的測定

參照文獻[26]的方法進行測定,略作修改。分別稱取0.192 g ABTS、0.033 1 g K2S2O8于燒杯中,并用超純水定容至50 mL,將ABTS溶液(7 mmol/L)與K2S2O8溶液(2.45 mmol/L)以體積比1∶1混合均勻,于室溫避光條件下靜置過夜,將生成的ABTS陽離子自由基溶液用無水乙醇稀釋至734 nm處吸光值為0.70±0.02。反應體系中,取以上方法配好的ABTS陽離子自由基溶液200 μL于96孔板中,并添加不同濃度的樣品溶液2 μL,充分搖勻,室溫靜置10 min,反應液用酶標儀在734 nm處測定吸光值,ABTS陽離子自由基清除能力按公式(1)計算。

(1)

式中,Ao,無水乙醇與ABTS陽離子自由基溶液在734 nm處的吸光值;Ai,測定液與無水乙醇在734 nm處的吸光值;Aj,測定液與ABTS陽離子自由基溶液在734 nm處的吸光值。

參照文獻[26-27]的方法對樣品清除DPPH自由基能力和鐵離子還原能力進行測定。DPPH自由基清除能力按公式(1)計算。ABTS陽離子自由基清除能力與DPPH自由基清除能力以基于線性回歸方程計算得到的添加2 μL樣品溶液中的半抑制濃度(half inhibitory concerntration,IC50)值表示,鐵離子還原能力測定中以維生素C作為標準物并繪制標準曲線,所得線性回歸方程為y=0.184 1x-0.328 1,R2=0.999 7. 其中x代表維生素C質量濃度(μg/mL),y代表吸光度。鐵離子還原能力以與樣品吸光值相同時的維生素C當量來表示。

1.2.4 數據處理

采用Chemdraw 18.1繪制化合物結構式、分析化合物結構以及化學反應;采用MestReNova 14.0解析化合物的核磁譜圖、確證化合物結構。采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件分析差異顯著性,P<0.05,差異顯著;P<0.01,差異極顯著。采用Origin 2019軟件繪制圖表,所有實驗均重復3次,結果表示為平均值±標準偏差。

2 結果與分析

2.1 溴代反應

鹵原子置換羥基是用來制備鹵化物常用的方法之一,其中芐醇的溴代較氯代容易。溴代試劑的種類有很多,本文選用了40%的HBr溶液、HBr氣體以及PBr3作為溴代試劑,綜合操控性、產率以及成本來考慮,采用PBr3作為溴代試劑操作簡單、產率高、且價格便宜易得,更適用于工業(yè)化生產,具體對比結果如表1所示。選取以無水CH2Cl2為溶劑,反應溫度為室溫,反應時間3 h,芐溴收率可高達97%。

表1 不同溴代試劑的比較Table 1 Comparison of different brominated reagents

2.2 Arbuzov 重排反應

表2 反應溫度對產率的影響Table 2 Effect of reaction temperature on yield

反應溫度選擇在130 ℃,反應4 h時,TLC檢測原料反應較為完全,收率最高,整個過程反應溫和、操作簡單。此外,應注意反應剛開始時如果溫度過高,

反應體系會產生溴乙烷等副產物,在副產物作用下,亞磷酸三乙酯會發(fā)生異構化轉變,影響產率,因此我們一開始控溫在100 ℃左右,使溴乙烷以及其他低沸點副產物先行蒸出,以利于原料的充分反應。反應結束后,只需減壓蒸餾除去未反應的亞磷酸三乙酯及其他低沸點雜質,無需進一步柱層析純化,便可直接投入下一步反應當中,簡化了后處理,利于工業(yè)化的操作。

2.3 Wittig-Horner反應

Wittig-Horner反應條件溫和,不需無水無氧條件,操作簡單,立體選擇性高,反應所產生的次膦酸或膦酸陰離子都溶于水,易于分離提純。在進行Wittig-Horner反應時,3,5-二甲氧基芐基磷酸二乙酯與2,4-二甲氧基苯甲醛兩者使其中之一微微過量,便可使反應順利。以N,N-二甲基甲酰胺為溶劑,選擇廉價易得的甲醇鈉來代替以往所用昂貴的氫化鈉作為反應所需的堿,實驗過程中發(fā)現(xiàn)甲醇鈉的用量對產物的產率及純度影響較大,因此考察了甲醇鈉用量對產率的影響,結果如表3所示。當甲醇鈉與反應物物質的量比例為3∶1時,室溫反應過夜(約12 h),通過重結晶純化后得到的2,3′,4,5′-四甲氧基二苯乙烯的產率可達87%以上。

表3 甲醇鈉用量對產率的影響Table 3 Effect of sodium methoxide dosage on yield

2.4 脫甲基反應

甲基醚性質穩(wěn)定,不容易裂解脫除,這一步反應制約著氧化白藜蘆醇總產率的提高,因此選擇合適的脫甲基試劑是提高總產率的關鍵。本文嘗試了使用吡啶鹽酸鹽、格氏試劑CH3MgI、路易斯酸(BBr3、BCl3、AlCl3)、48% HBr和對甲苯磺酸來脫甲基,各試劑的脫甲基效果如表4所示。

表4 脫甲基試劑對產率的影響Table 4 Effect of demethylation reagents on yield

通過對比實驗結果,吡啶鹽酸鹽以及CH3MgI價格昂貴、脫甲基所需條件苛刻、操作困難;BBr3是最常用的脫甲基試劑,雖然收率可觀,但試劑不易保存且成本偏高,需低溫反應、操作危險性大,不利于工業(yè)化生產;BCl3和對甲苯磺酸脫除甲基的收率極低,48% HBr脫甲基產率不高。我們最終選取了價格便宜的AlCl3來脫甲基,并且以無水吡啶作為反應溶劑時脫除甲基效率較好。本文進一步對AlCl3的用量和反應溫度進行優(yōu)化,優(yōu)化結果如表5、表6所示。

表5 AlCl3用量對產率的影響Table 5 Effect of AlCl3 dosage on yield

表6 溫度對產率的影響Table 6 Effect of temperature on yield

無水AlCl3與2,3′,4,5′-四甲氧基二苯乙烯的物質的量比和反應溫度對收率影響較大,當AlCl3用量過少,溫度較低時,脫甲基不完全;溫度過高,AlCl3用量過多時,副產物增多,產物易發(fā)生異構化,增加了純化的難度。由表5和表6可知,通過優(yōu)化反應條件,當n(AlCl3)∶n(2,3′,4,5′-四甲氧基二苯乙烯)=8∶1,溫度為160 ℃時,反應時間為4 h時,脫甲基較為完全,收率為76.2%。

2.5 抗氧化活性

2.5.1 清除ABTS陽離子自由基的能力

由圖3可知,氧化白藜蘆醇清除ABTS陽離子自由基的IC50值為(0.17±0.01) mg/mL,其清除ABTS陽離子自由基能力僅次于白皮杉醇,大于白藜蘆醇以及茶多酚。通過方差分析得到白藜蘆醇與茶多酚在統(tǒng)計學上沒有顯著性差異(P>0.05),氧化白藜蘆醇與白藜蘆醇之間存在顯著性差異(P<0.05),與其余各樣品之間存在極顯著性差異(P<0.01),各樣品清除ABTS陽離子自由基能力大小依次為:白皮杉醇>氧化白藜蘆醇>白藜蘆醇≈茶多酚>維生素C>TBHQ>BHT。

圖3 各樣品ABTS陽離子自由基清除能力Fig.3 ABTS cation radical scavenging ability of each sample注:P<0.05時,不同字母表示差異性顯著;誤差線代表標準偏差,n=3(下同)。

2.5.2 清除DPPH自由基的能力

由圖4可知,氧化白藜蘆醇清除DPPH自由基的IC50值為(16.80±0.65) μg/mL,通過方差分析得到氧化白藜蘆醇和白皮杉醇在統(tǒng)計學上沒有顯著性差異(P>0.05),與其余各樣品之間存在極顯著性差異(P<0.01)。各樣品清除DPPH自由基能力的大小依次為:茶多酚≈維生素C≈TBHQ>氧化白藜蘆醇≈白皮杉醇>BHT>白藜蘆醇。DPPH是一種以氮為中心的很穩(wěn)定的自由基,易與含多羥基的化合物結合,達到清除自由基的作用。茶多酚結構末端連接多個羥基,因此清除DPPH自由基能力最強,白皮杉醇和氧化白藜蘆醇結構上均帶有4個酚羥基,比白藜蘆醇多一個酚羥基,因此白皮杉醇和氧化白藜蘆醇的DPPH自由基清除能力大于白藜蘆醇。

圖4 各樣品DPPH自由基清除能力Fig.4 DPPH free radical scavenging ability of each sample

2.5.3 鐵離子還原能力

由圖5可知,氧化白藜蘆醇和各樣品的鐵離子還原能力隨濃度的增大而增大。由表7可知,在質量濃度為8 μg/mL時,各樣品的鐵離子還原能力大小依次為:白皮杉醇>茶多酚>TBHQ>氧化白藜蘆醇>BHT>白藜蘆醇。由方差分析得知,當樣品質量濃度為2 μg/mL時,氧化白藜蘆醇與TBHQ在統(tǒng)計學上無顯著性差異(P>0.05);當樣品質量濃度為4 μg/mL時,氧化白藜蘆醇與TBHQ存在顯著性差異(P<0.05),與其余樣品之間存在極顯著性差異(P<0.01);當樣品質量濃度為6、8、10 μg/mL時,氧化白藜蘆醇與其他樣品之間皆存在極顯著性差異(P<0.01)。

表7 各濃度樣品所對應的鐵離子還原能力Table 7 Ferric reducing antioxidant power of samples with different concentrations

圖5 各樣品鐵離子還原能力Fig.5 Ferric reducing antioxidant power of each sample

3 結論

以3,5-二甲氧基芐醇、2,4-二甲氧基苯甲醛為原料,通過Wittig-Horner反應法四步合成氧化白藜蘆醇,改進了合成工藝并優(yōu)化了反應條件,合成總產率為64.6%。重點對2,3′,4′,5-四甲氧基二苯乙烯的脫甲基試劑進行了篩選,最終,對比一系列脫甲基試劑后,選取廉價易得的無水AlCl3作為脫甲基試劑,并確定最佳反應條件為:在無水吡啶中,n(AlCl3)∶n(2,3′,4,5′-四甲氧基二苯乙烯)=8∶1,反應溫度160 ℃,反應時間4 h。

與現(xiàn)有的合成工藝相比,本文選擇以Wittig-Horner反應為特征的路線合成氧化白藜蘆醇,避免了使用Perkin反應需進行的異構化轉化、Heck反應所需的苛刻條件以及Wittig反應導致的副產物不易分離等問題,反應中所使用的原料價格便宜且來源廣泛,其中使用AlCl3脫甲基大大降低了生產成本,反應路線簡短,操作方便,反應條件溫和,總產率較高,具有潛在的工業(yè)利用價值。氧化白藜蘆醇的抗氧化活性測定結果表明其具備很強的抗氧化性,其ABTS陽離子自由基清除能力遠大于維生素C、BHT、TBHQ,DPPH自由基清除能力以及鐵離子還原能力均強于白藜蘆醇和BHT,未來可作為優(yōu)良的天然抗氧化劑應用于食品添加劑、化妝品等鄰域當中。