油菜蜂花粉發(fā)酵工藝及生物活性研究

段倩倩,程妮,2*,趙丞,曹煒,2

1(西北大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 西安,710069)2(陜西省蜂產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心,陜西 西安,710065)

蜂花粉是蜜蜂將采集來的花粉摻入唾液和花蜜粘成的一種不規(guī)則顆粒物,其富含多糖、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、酚類化合物等物質(zhì),被稱為人類營養(yǎng)的膳食補充劑[1],是一種極具開發(fā)價值的食物資源。這些營養(yǎng)物質(zhì)和功能性成分介導(dǎo)多種生物效應(yīng),如抗氧化、抗癌和免疫調(diào)節(jié)等[2]。然而,蜂花粉由于特殊的腥味和花粉過敏的癥狀,大大降低了蜂花粉的可接受程度,且蜂花粉堅韌的細(xì)胞壁也限制了其內(nèi)容物的釋放,因此,可以有效改善其感官特性、提高其生物有效性和生物活性,對蜂花粉資源開發(fā)具有重要意義。

目前,蜂花粉在食品中的應(yīng)用主要是直接食用、壓成片劑或作為輔料添加到其他產(chǎn)品中,對于蜂花粉發(fā)酵,改善產(chǎn)品感官特性等也有報道,但是,發(fā)酵的微生物、花粉的植物來源以及發(fā)酵條件不同,對發(fā)酵結(jié)果也會有影響。此外,目前尚未有研究關(guān)注油菜蜂花粉發(fā)酵前后的抗氧化、抑菌和體外抗炎活性。因此,本文選用植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌2種益生菌來發(fā)酵油菜蜂花粉,采用單因素試驗和正交設(shè)計對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化,旨在改善蜂花粉口感、提高蜂花粉營養(yǎng)成分和生物學(xué)活性,為油菜蜂花粉進一步深加工提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌凍干性菌粉,山東中科嘉億生物工程有限公司提供;油菜蜂花粉,蜂農(nóng)處,且經(jīng)孢粉學(xué)鑒定確定其植物源;MRS肉湯、MRS固體培養(yǎng)基,北京奧博星生物技術(shù)有限公司;瓊脂培養(yǎng)基,自制;透明質(zhì)酸酶、透明質(zhì)酸鈉、牛血清白蛋白,上海源葉生物科技有限公司;葡萄糖、蘆丁、沒食子酸等標(biāo)準(zhǔn)品,上海阿拉丁生化科技有限公司;DNS試劑,廣檢(廣州)檢測科技有限公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純或生物制劑。

SHA-B恒溫?fù)u床,常州國華電器有限公司;CXG-1微生物培養(yǎng)箱,上海青浦滬西儀器廠;UV1800分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;FD-1C-50凍干機,北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;超凈工作臺,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;PHS-3C pH計,上海佑科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化和培養(yǎng)

植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌凍干型菌粉在室溫下解凍,按照1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中,于37 ℃活化12 h,將菌種分別接種到MRS液體培養(yǎng)基中,混合均勻并培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2 油菜蜂花粉處理

采用75%(體積分?jǐn)?shù))的食用酒精噴灑油菜蜂花粉,邊噴邊翻動,花粉密封2～3 h。取出后,其表面覆蓋8層滅菌紗布,置于40 ℃烘箱中,使乙醇完全揮發(fā),備用。

1.2.3 單因素發(fā)酵試驗

乳酸菌接種量分別為3%、5%、7%、10%和15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù));添加水量分別為20%、25%、30%、35%、40%、45%、45%和50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù));發(fā)酵時間為0、24、48、72、96和120 h;發(fā)酵溫度為33、35、37、39和42 ℃;植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌菌液比例分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶5、2∶1、3∶1和5∶1(體積比,下同),將對數(shù)生長期的菌株接入蜂花粉中,測定發(fā)酵后乳酸菌活菌數(shù)和pH,同時進行感官評價。

1.2.4 乳酸菌發(fā)酵油菜蜂花粉工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選擇確定乳酸菌接種量(%)、添加水量(%)、發(fā)酵溫度(℃)、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌菌液比例設(shè)計L9(34)正交設(shè)計,以乳酸菌活菌數(shù)和感官評分為指標(biāo)對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。因素水平如表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交設(shè)計水平表Table 1 Orthogonal test level of fermentation process optimization

1.2.5 驗證實驗

用正交試驗設(shè)計確定的最佳條件進行蜂花粉發(fā)酵,測定所得結(jié)果,比較其與實驗組的差異。

1.2.6 顯著性和相關(guān)性分析

采用SPSS 26.0軟件對代表性指標(biāo)進行正交優(yōu)化分析,得出蜂花粉的最優(yōu)發(fā)酵方案。對所測活性指標(biāo)進行顯著性差異分析(P<0.05),運用Origin 2022軟件作圖。

1.3 測定方法

1.3.1 乳酸菌活菌計數(shù)

乳酸菌活菌計數(shù)依據(jù)GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》進行測定。

1.3.2 發(fā)酵蜂花粉pH的測定

準(zhǔn)確稱取5 g蜂花粉樣品,加入15 mL蒸餾水,振搖混勻后使用pH計測定pH值。

1.3.3 感官評價

感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 發(fā)酵油菜蜂花粉感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of fermented rape bee pollen

1.3.4 還原糖含量的測定

參考曾志恒等[10]的方法,采用DNS法測定還原糖含量,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)方程為:y=0.574 8x-0.006 6(R2=0.996 4)。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量的測定

發(fā)酵前后蜂花粉經(jīng)浸泡和抽提回流后脫脂,烘干后以1∶10(g∶mL)加入緩沖溶液(0.02 mol/L PBS溶液[NaCl],pH 7.4),4 ℃攪拌提取24 h,于4 ℃,12 000 r/min,離心15 min,得到蛋白質(zhì)提取液。采用考馬斯亮藍法測定花粉中粗蛋白的含量[11]。牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線對應(yīng)方程為:y=0.316 3x-0.001 8(R2=0.997 5)。

1.3.6 抗氧化活性的測定

蜂花粉乙醇提取液的制備:各稱取發(fā)酵前后的蜂花粉樣品10 g與75%乙醇按料液比1∶10混合后超聲提取45 min后,熱回流提取2 h,抽濾,濾液濃縮后用75%乙醇定容至100 mL。

總酚、總黃酮含量測定參考SEIFZADEH等[12]的方法,總酚以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)方程為:y=12.034x+0.047 3(R2=0.993 3)。總黃酮以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)方程為:y=1.129 1x+0.002 2(R2=0.992 9)。

總抗氧化能力的測定參考何亮亮等[13]的方法,以FeSO4繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(0～0.4 mmol/L),蜂花粉總抗氧化能力以FeSO4當(dāng)量表示,FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)方程為:y=1.667 2x+0.001 7(R2=0.991 9)。

Fe2+螯合率測定參考何亮亮等[13]的方法,4 mL樣品稀釋液加入50 μL FeSO4(2 mmol/L)和Ferrozine(5 mmol/L)混勻后于37 ℃水浴反應(yīng)30 min,于562 nm處測定吸光度,以蒸餾水為空白,Fe2+螯合率的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:B0,4 mL 75%乙醇溶液代替樣品吸光度值;B1,樣品溶液吸光度值。

DPPH自由基清除能力參考HARA等[14]的方法測定。分別吸取0.2 mL發(fā)酵前后蜂花粉乙醇提取稀釋液,加入0.04 mg/mL的DPPH乙醇溶液5 mL,混勻后在室溫避光反應(yīng)30 min,于517 nm處測定吸光度值。DPPH自由基清除率的計算如公式(2)所示:

(2)

式中:A0,0.2 mL 95%乙醇溶液代替樣品吸光度值;A1,樣品溶液吸光度值。

1.3.7 抗炎活性的測定

參考HAN等[15]的方法,通過測量發(fā)酵前后蜂花粉對透明質(zhì)酸酶催化反應(yīng)的抑制作用間接評估其抗炎活性。A、B管中加入0.5 mL樣品溶液,C、D管加入0.5 mL蒸餾水,A、C管加入0.5 mL透明質(zhì)酸酶溶液(500 U/mL),B、D管加入0.5 mL醋酸緩沖液(pH 5.6,0.1 mol/L),37 ℃保溫20 min,各管加入100 μL 2.5 mol/L的CaCl2溶液,37 ℃保溫20 min,A、C管加入0.5 mg/mL透明質(zhì)酸鈉鹽0.5 mL,B、D管加入0.5 mL醋酸緩沖液,37 ℃靜置反應(yīng)40 min,各加入0.5 mL蒸餾水、0.1 mL 5 mol/L NaOH溶液、0.5 mL乙酰丙酮溶液,沸水浴15 min、冰浴10 min、室溫10 min后加入1 mL P-DAB顯色劑,加無水乙醇定容至8 mL,混勻室溫放置30 min后于530 nm處測定吸光度值,以去離子水作空白,透明質(zhì)酸酶抑制率根據(jù)公式計算于530 nm處測定吸光度值,透明質(zhì)酸酶抑制率的計算如公式(3)所示:

(3)

式中:A、B、C、D分別為對應(yīng)管在530 nm處的吸光度值。

1.3.8 蛋白質(zhì)變性抑制實驗

參考文獻[16]的方法,稍作改動。2.8 mL、2%牛血清白蛋白(溶于pH 5.5、0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液中),于37 ℃保溫20 min,加入一定量待測定樣品,定容至5 mL,于70 ℃水浴20 min后迅速冷卻至室溫,于660 nm處測定樣品吸光度,記為As。用蒸餾水代替待測樣品作為對照組測定吸光度記為Ac。蛋白質(zhì)變性抑制率的計算如公式(4)所示:

(4)

1.3.9 抑菌活性的測定

采用牛津杯法測定發(fā)酵前后蜂花粉抑菌活性。將100 μL OD值為0.3～0.36菌懸液用移液槍注入到已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基上,無菌條件下用玻璃棒涂布均勻,將5只無菌的牛津杯均勻放入培養(yǎng)皿中。吸取200 μL蜂花粉醇提液加入牛津杯中,3只平行,其余2只牛津杯中分別加入體積分?jǐn)?shù)80%甲醇和無菌的9 g/L NaCl溶液。上述過程嚴(yán)格按照無菌操作進行,培養(yǎng)皿置培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h。觀察各皿抑菌效果,量取抑菌圈直徑,結(jié)果取平均值[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

添加水量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、乳酸菌接種量、菌液比例對發(fā)酵蜂花粉的影響如圖1所示,乳酸菌利用蜂花粉中營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖,其生長代謝情況直接影響了發(fā)酵蜂花粉的感官、理化特性和有益菌數(shù)。

a-添加水量;b-發(fā)酵時間;c-發(fā)酵溫度;d-發(fā)酵菌接種量;e-植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌菌液比例

2.1.1 添加水量的確定

水分是發(fā)酵中影響微生物代謝活動的一項重要因素。由圖1-a可以看出,當(dāng)加水量為40%～45%時,蜂花粉感官評分較高,pH適宜,且加水量為40%時,發(fā)酵蜂花粉活菌數(shù)最高。但加水量>40%后,由于蜂花粉營養(yǎng)成分被稀釋,發(fā)酵蜂花粉感官特性變差,活菌數(shù)量也逐漸減少,故確定蜂花粉的最佳添加水量為40%。

2.1.2 發(fā)酵時間的確定

圖1-b顯示,發(fā)酵蜂花粉的pH隨著發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先降低后穩(wěn)定的趨勢,到72 h后趨于穩(wěn)定,活菌數(shù)和感官評分隨著發(fā)酵時間先升高,發(fā)酵時間超過72 h后,活菌數(shù)和感官評分卻明顯降低。這主要是因為發(fā)酵時間短,活菌數(shù)含量低、酸度低,使發(fā)酵的特殊風(fēng)味還未形成;發(fā)酵時間過長時,產(chǎn)酸多、酸味重,且可供發(fā)酵的營養(yǎng)物質(zhì)有限,活菌數(shù)和感官評分也會明顯下降[18]。

2.1.3 發(fā)酵溫度的確定

由圖1-c可以看出,當(dāng)發(fā)酵溫度為35～39 ℃時,發(fā)酵蜂花粉感官評分沒有顯著差異,均保持較高水平,發(fā)酵溫度為37 ℃時,活菌數(shù)最高,為8.52 lg CFU/g。發(fā)酵溫度較低時,蜂花粉發(fā)酵不充分,苦味明顯;發(fā)酵溫度過高時,不利于乳酸菌生長,蜂花粉色澤由金黃色變?yōu)楹稚?且會產(chǎn)生刺激性氣味,嚴(yán)重影響發(fā)酵蜂花粉感官品質(zhì),因此,蜂花粉發(fā)酵溫度選擇37 ℃為宜。

2.1.4 乳酸菌接種量的確定

乳酸菌的接種量對發(fā)酵蜂花粉的發(fā)酵程度、口感和風(fēng)味會產(chǎn)生一定的影響,由圖1-d可知,當(dāng)乳酸菌接種量為10%時,油菜蜂花粉活菌數(shù)較多,感官評分較高,pH適宜,此時發(fā)酵蜂花粉酸甜適中。接種量太低會使蜂花粉發(fā)酵緩慢,乳酸菌不能充分利用其營養(yǎng)成分,產(chǎn)酸低,口感差,且易造成雜菌污染;乳酸菌濃度高,會使蜂花粉偏酸,且接種量太高會增加經(jīng)濟成本,因此,菌接種量應(yīng)該選擇10%。

2.1.5 菌液比例的確定

由圖1-e可知,不同的菌液比例(植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌)對蜂花粉的感官評分、活菌數(shù)和pH具有顯著影響。當(dāng)植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌為1∶1、2∶1時,活菌數(shù)和感官評分達到較高值,分別為8.52、8.50 lg CFU/g和10.63、10.70分。實驗結(jié)果表明,當(dāng)植物乳桿菌接種過量或者鼠李糖乳桿菌接種量較多,都會影響蜂花粉的發(fā)酵,當(dāng)菌液比例為2∶1時,能達到較好的發(fā)酵結(jié)果。

2.2 正交試驗設(shè)計結(jié)果

正交試驗設(shè)計結(jié)果見表3。

表3 正交試驗設(shè)計結(jié)果Table 3 Orthogonal design results

由表3可知,通過正交設(shè)計優(yōu)化乳酸菌發(fā)酵工藝參數(shù),由極差分析可以看出,對發(fā)酵蜂花粉活菌數(shù)的影響由大到小的順序為添加水量>發(fā)酵溫度>菌液比例(植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌)>乳酸菌接種量,發(fā)酵最優(yōu)水平為A3B2C2D2。對感官評分的影響由大到小的順序為菌液比例(植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌)>添加水量>發(fā)酵溫度>乳酸菌接種量,發(fā)酵最優(yōu)水平為A2B1C2D3。由于4個因素對于發(fā)酵蜂花粉影響程度不一致,導(dǎo)致其最優(yōu)方案也不同。因素A對于乳酸菌活菌數(shù)而言,取A3(50%)較好,但是取A3時,因為加水量較多,感官評分較低,因此從感官角度應(yīng)該選擇A2。因素B是2個指標(biāo)中較重要的因素,從活菌數(shù)來說取B2(37 ℃)最好,但取B2時感官分?jǐn)?shù)低,由于因素B2對乳酸菌活菌數(shù)的影響大于對感官的影響,因此選擇B2。因素C對于2個指標(biāo)都是取C2(10%)好;因素D從感官角度出發(fā),應(yīng)取D3(植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌=3∶1),但對活菌數(shù)而言取D2好,由于因素D3對感官評分的影響大于對活菌數(shù)的影響,因此選擇D3。綜合來說,油菜蜂花粉發(fā)酵工藝的最佳組合為A2B2C2D3,即添加水量40%,發(fā)酵溫度37 ℃,乳酸菌接種量10%,植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌菌液比例為3∶1。

2.3 驗證實驗

添加水量40%,發(fā)酵溫度37 ℃,乳酸菌接種量10%,植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌=3∶1時,油菜蜂花粉發(fā)酵72 h后,發(fā)酵蜂花粉的乳酸菌活菌數(shù)為8.37 lg CFU/g,感官評分為11.79,優(yōu)于其他實驗組。

2.4 發(fā)酵對油菜蜂花粉營養(yǎng)成分和生物活性成分的影響

根據(jù)最優(yōu)發(fā)酵條件完成油菜蜂花粉的發(fā)酵,其營養(yǎng)和生物活性成分的變化見表4,發(fā)酵后蜂花粉的水溶性蛋白含量降低,為2.24 g/100 g,可能是發(fā)酵過程中乳酸菌將蜂花粉中大分子的蛋白質(zhì)降解為小分子的多肽和氨基酸。

2.5 發(fā)酵對油菜蜂花粉抗氧化活性的影響

由表5可知,發(fā)酵后油菜蜂花粉抗氧化活性顯著增強(P<0.05),發(fā)酵后總抗氧化能力為0.29 mmol FeSO4/g,是發(fā)酵前的1.26倍。發(fā)酵后油菜蜂花粉對DPPH自由基清除率、Fe2+螯合率分別為68.79%、76.56%,較發(fā)酵前分別提高了10.49%、23.19%。孫旭等[7]研究發(fā)現(xiàn),茶花粉經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后對自由基的清除能力提高了28.73%;類似的研究如MENG等[23]使用植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵枇杷汁后發(fā)現(xiàn)其抗氧化活性也顯著增加?？傮w來看,抗氧化活性的變化與多酚類物質(zhì)的變化趨勢相一致,當(dāng)發(fā)酵的菌種合適時,這些物質(zhì)不但不會影響微生物,反而會被微生物代謝成生物活性更高且利于人體吸收的小分子物質(zhì)。此外,某些乳酸菌會產(chǎn)生胞外酶,使酚類物質(zhì)之間實現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化,從而改變其抗氧化活性[24]。

表5 發(fā)酵對油菜蜂花粉抗氧化活性的影響Table 5 Effect of fermentation on antioxidant activity of rape bee pollen

2.6 發(fā)酵前后抗炎活性變化

透明質(zhì)酸酶可降解細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的透明質(zhì)酸,并且具有較低的降解其他直鏈糖胺聚糖的能力[25],與炎癥、過敏具有很強的相關(guān)性[16]。因此,透明質(zhì)酸酶活性抑制試驗是評價體外抗炎活性的一項指標(biāo)。油菜蜂花粉發(fā)酵前后抗炎活性結(jié)果如圖2所示。發(fā)酵后的蜂花粉對透明質(zhì)酸酶活性抑制率為46.08%,較發(fā)酵前的13.73%提高了3.36倍。有研究證實多酚類、黃酮類可以有效抑制透明質(zhì)酸酶活性,而且乳酸菌還具有生物轉(zhuǎn)化作用,可能是通過代謝增加了某種具有生物活性物質(zhì)的含量,從而增強了其抗炎活性[26]。炎癥被認(rèn)為是一種主要的生理防御機制,有助于身體保護自身免受不同的刺激[27]。組織蛋白的變性是炎癥和關(guān)節(jié)炎疾病的原因之一,因此抑制蛋白質(zhì)變性被認(rèn)為是衡量體外抗關(guān)節(jié)炎活性的重要指標(biāo)[28]。比較發(fā)酵前后的樣品抑制蛋白變性結(jié)果發(fā)現(xiàn),發(fā)酵可以有效提高蜂花粉的抗炎活性。發(fā)酵后的蜂花粉抑制蛋白質(zhì)變性較發(fā)酵前提高了24.65%,導(dǎo)致這一結(jié)果可能的原因是乳酸菌發(fā)酵積累的代謝產(chǎn)物具有一定的抗炎作用,或者蜂花粉經(jīng)發(fā)酵后,生物活性物質(zhì)釋放,進一步促進了其抗炎作用。

圖2 透明質(zhì)酸酶活性和牛血清白蛋白變性抑制實驗結(jié)果Fig.2 Experimental results of hyaluronidase activity and denaturation inhibition of bovine serum albumin

2.7 發(fā)酵對油菜蜂花粉抑菌活性的影響

發(fā)酵前后蜂花粉對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌3種食源性微生物的抑制活性試驗結(jié)果見表6。

表6 發(fā)酵對3種食源性微生物抑菌活性的影響Table 6 Effect of fermentation on bacteriostatic activity of three food borne microorganisms

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明,油菜蜂花粉發(fā)酵的最佳條件為添加水量40%,發(fā)酵溫度37 ℃,乳酸菌接種量10%,植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌=3∶1。在最優(yōu)條件下,發(fā)酵72 h后的蜂花粉色澤呈金黃色,酸甜適宜,具有輕微香氣,活菌數(shù)為8.37 lg CFU/g,感官評分為11.79。而且發(fā)酵油菜蜂花粉總酚、總黃酮的含量提高了16.09%、51.02%;還原糖含量和蛋白質(zhì)含量顯著降低,分別為43.75、2.24 g/100 g。油菜蜂花粉經(jīng)發(fā)酵后,總抗氧化能力為0.29 mmol FeSO4/g,是發(fā)酵前的1.26倍;DPPH自由基清除率、Fe2+螯合率較發(fā)酵前分別提高了10.49%、23.19%。對透明質(zhì)酸酶活性抑制率從發(fā)酵前的13.73%提高至46.08%,抑制蛋白質(zhì)變性的能力提高了24.65%。且發(fā)酵后的油菜蜂花粉對食源性微生物抑菌活性顯著增強。綜上所述,乳酸菌發(fā)酵不僅能改善油菜蜂花粉的感官品質(zhì),也可增加其內(nèi)容物的溶出,且抗氧化、體外抗炎和抑菌活性有所增強。因此,發(fā)酵可作為增強油菜蜂花粉功能和開發(fā)油菜蜂花粉健康品的重要加工方法之一,為蜂花粉的深加工提供進一步理論指導(dǎo)。