KDM5C通過(guò)Hippo-YAP1通路調(diào)控人宮頸癌發(fā)生的初步機(jī)制

劉緒，張欣冉，李堂華，周威，梁荷淼，高文珍，張娟，苗林，陳曉華,*

1中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430070；2湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000；3中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢 430070；4南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510280

宮頸癌是婦科第4 大癌癥。2020 年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，宮頸癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)占女性癌癥死亡的8%[1]。超過(guò)95%的宮頸癌與人乳頭瘤病毒(HPV)持續(xù)感染有關(guān)，以HPV16、HPV18 型的致病性最強(qiáng)，其中HPV16 型感染占50%以上[2]。高危HPV的致癌機(jī)制主要是其編碼的兩個(gè)蛋白E6和E7在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用(與宿主細(xì)胞中其他癌蛋白協(xié)調(diào)作用，多途徑、多通路促進(jìn)細(xì)胞表皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，影響原癌基因和抑癌基因表達(dá))，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[3-4]。由于病毒致癌蛋白E6 是HPV16致癌的主要因子，因此HPV16 E6一直是宮頸癌發(fā)病機(jī)制研究的重點(diǎn)。Hippo-YAP1 信號(hào)通路是一條參與細(xì)胞增殖與凋亡、侵襲與遷移、組織修復(fù)再生與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要通路[5]，該通路主要由類(lèi)Ste20 激酶1/2(MST1/2)和大腫瘤抑制因子1/2(LATS1/2)、Yes 相關(guān)蛋白(YAP)和(或)其同系物TAZ蛋白構(gòu)成[6]，當(dāng)該通路被激活后，MST1/2被磷酸化并進(jìn)一步激活LATS1/2，從而磷酸化YAP1并抑制其活性。Hippo-YAP1 信號(hào)通路的失活或異常與多發(fā)腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。Hippo-YAP1 信號(hào)通路的主要效應(yīng)分子YAP1 可與HPV16 E6 相互作用，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[5]，但其具體分子機(jī)制尚不完全清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HPV16 E6蛋白與組蛋白H3 第四位賴(lài)氨酸(H3K4)位點(diǎn)的組蛋白去甲基化酶5C(KDM5C)存在蛋白相互作用。KDM5C 在HPV16感染細(xì)胞中的表達(dá)廣泛下調(diào)，HPV16 E6通過(guò)降解KDM5C 而激活原癌基因(如EGFR和c-MET等)的超級(jí)增強(qiáng)子，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[8]。本研究在此基礎(chǔ)上，從基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面深入分析KDM5C 通過(guò)Hippo-YAP1 通路調(diào)控人宮頸癌發(fā)生的分子機(jī)制，揭示KDM5C 改變YAP1基因啟動(dòng)子的組蛋白甲基化修飾水平，進(jìn)而影響宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移的過(guò)程，旨在為高危HPV 陽(yáng)性宮頸癌的診斷、預(yù)后評(píng)估及治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 胎牛血清、RPMI 1640、Opti-MEM、青(鏈)霉素溶液均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，LipopfectmineTM3000轉(zhuǎn)染試劑、三色預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司，RNA 提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega 公司，YAP1 多克隆抗體、YAP1 磷酸化(ser127) 單克隆抗體、 KDM5C 單克隆抗體、H3K4me1多克隆抗體和H3K4me3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，Protein A/G 磁珠購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；SYBR GREEN PCR Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、羊抗兔IgG 二抗、β-actin 多克隆抗體、IgG 多克隆抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司，PBS、嘌呤霉素和CCK-8 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PCR 引物和siRNA 均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞來(lái)源及細(xì)胞培養(yǎng) 宮頸癌細(xì)胞CaSki(含HPV16 E6)購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Tissue Culture Collection，ATCC)，Phage組(過(guò)表達(dá)對(duì)照組)、Phage-KDM5C 組(過(guò)表達(dá)KDM5C 組)、KOVector 組(敲除對(duì)照組)和KO-KDM5C 組(敲除KDM5C 組)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并篩選鑒定[8]。CaSki 細(xì)胞使用RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)基加入10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系在此基礎(chǔ)上添加2 μg/ml 的嘌呤霉素。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代，最后收取細(xì)胞備用。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)和差異基因表達(dá)分析收集Phage組及Phage-KDM5C組細(xì)胞各1×107個(gè)，PBS洗2 次，分別加入1 ml Trizol 裂解液室溫裂解5 min，放入1.5 ml 無(wú)RNA 酶離心管中并做好標(biāo)記，置于干冰中保存。RNA 提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、分析由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。差異表達(dá)分析使用Cuffdiff 軟件，從統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的角度上考慮，對(duì)mRNA類(lèi)型轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行差異分析，以log2Fold Change：log2(Sample 1/Sample 2)≥1.3 且P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)。差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本以火山圖表示。此外對(duì)不同實(shí)驗(yàn)條件下的差異轉(zhuǎn)錄本的定量值(FPKM)表達(dá)水平，以log10(FPKM+1)值行層次聚類(lèi)(hierarchical clustering)分析，紅色代表高表達(dá)基因，藍(lán)色代表低表達(dá)基因。

1.2.3 Gene Ontology(簡(jiǎn)稱(chēng)GO)富集分析 篩選與KDM5C 相關(guān)的基因，研究該類(lèi)基因在GO中的分布狀況，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)闡明其在基因功能上的體現(xiàn)。GO富集分析方法參考GO seq[9]，并將GO分析結(jié)果通過(guò)富集柱狀圖展示。

1.2.4 KEGG 富集分析 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)是有關(guān)通路的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)[10]。本項(xiàng)目使用KOBAS(2.0)進(jìn)行通路富集分析[11]，將錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.05 的通路定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的通路，結(jié)果以KEGG 富集散點(diǎn)圖和KEGG富集通路圖展示。

1.2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 應(yīng)用經(jīng)典的STRING 蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/)，將表達(dá)差異變化顯著的前40位基因輸入網(wǎng)站進(jìn)行蛋白互作分析并關(guān)聯(lián)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟參照轉(zhuǎn)染試劑LipopfectmineTM3000 的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。簡(jiǎn)要步驟如下：當(dāng)鋪板細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到50%～60%時(shí)，使用Opti-MEM將siRNA/質(zhì)粒分別稀釋至說(shuō)明書(shū)推薦濃度后與轉(zhuǎn)染試劑輕柔混勻，室溫靜置15 min 后將混合物均勻添加到無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)，6～8 h 后更換為RPMI 1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后24～48 h 收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用的siRNA 序列如下：KDM5C-siRNA1，GCCAACCUUGU GCAGUGUATT；KDM5C-siRNA2，GCCAGUGUAUC AAGUGCAATT；KDM5C-siRNA3，GUGGACAACUU CAGGUUUATT。siRNA-NC 由公司在合成siRNA 時(shí)配套贈(zèng)送。將細(xì)胞分為NC-siRNA組(siRNA敲低對(duì)照組)，KDM5C-siRNA1/2/3 組(KDM5C基因特異siRNA1/2/3敲低組)。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)變化 siRNA轉(zhuǎn)染野生型CaSki細(xì)胞24 h后收取細(xì)胞用于分析轉(zhuǎn)染效果和下游調(diào)控基因，細(xì)胞RNA的提取步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；提取的總RNA 經(jīng)濃度測(cè)定后，取4 μg總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并使用SYBR 染料法試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)KDM5C基因的敲降效果，檢測(cè)YAP1 和EGFR等基因的表達(dá)變化情況。反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)實(shí)驗(yàn)以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)時(shí)熒光定量PCR(ChIP-qPCR)實(shí)驗(yàn)以對(duì)照基因組DNA(input)為參照，并使用IgG 作為陰性對(duì)照。qPCR擴(kuò)增得到循環(huán)閾值(Ct值)并采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)使用的qPCR引物見(jiàn)表1。qPCR 反應(yīng)體系包括PCR Mix 10 μl、模板cDNA 3 μl、上下游引物各0.5 μl、ddH2O 6.0 μl。qPCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 15 s、60 ℃60 s(收集熒光)，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線程序?yàn)椋?5 ℃30 s，55 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s，每0.3 ℃采集一次熒光。

表1 RT-qPCR和ChIP-qPCR采用的引物序列Tab.1 The specific primers designed for RT-qPCR and ChIP-qPCR

1.2.8 Western blotting 檢測(cè)KDM5C 調(diào)控蛋白的表達(dá)水平 按照1.2.6的方法分別對(duì)野生型CaSki細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染phage 和phage-KDM5C 質(zhì)粒，同時(shí)對(duì)野生型CaSki 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NC-siRNA、KDM5C-siRNA1/2/3 48 h，然后使用0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，采用RIPA 裂解細(xì)胞并通過(guò)BCA 法測(cè)定蛋白濃度，選取40 μg 總蛋白樣品沸水變性10 min。配制10% SDSPAGE 凝膠，電泳完成后將凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，并用一抗封閉液室溫封閉2 h，根據(jù)目標(biāo)條帶位置將PVDF膜裁剪后加入目標(biāo)抗體(稀釋比例均為1∶2000)，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠IgG(稀釋比例為1∶4000)，室溫孵育2 h，TBST 洗滌后加入ECL 化學(xué)發(fā)光劑，在暗室中用X線膠片曝光，常規(guī)顯影、定影，掃描照片。

1.2.9 ChIP-Seq 和ChIP 分析KDM5C 調(diào)控的基因中組蛋白甲基化的差異 ChIP實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[12]，采用H3K4me1和H3K4me3多克隆抗體按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，使用IgG 做為抗體陰性對(duì)照，ChIP 免疫共沉淀的DNA 分別用于ChIP-Seq 和ChIP-qPCR 實(shí)驗(yàn)，其中ChIP-Seq測(cè)序和分析由諾禾致源公司完成，ChIPqPCR步驟參考1.2.7進(jìn)行。

1.2.10 細(xì)胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用CCK-8 法。96 孔板中分別接種Phage 組、Phage-KDM5C 組、KO-Vector 組及KO-KDM5C 組細(xì)胞，待生長(zhǎng)密度達(dá)50%以上后使用CCK-8 試劑盒分別在0、12、24、36、48、72 h 于450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(OD)值，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)胞遷移分析采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。6孔板中分別接種Phage、Phage-KDM5C、KO-Vector及KO-KDM5C組細(xì)胞，待生長(zhǎng)密度達(dá)90%以上后使用200 μl 吸頭進(jìn)行細(xì)胞劃痕，PBS 清洗后，各組細(xì)胞加入無(wú)血清培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0、12、24、36 h在相差顯微鏡下拍照，觀察KDM5C蛋白表達(dá)差異對(duì)細(xì)胞遷移的影響，使用ImageJ 軟件測(cè)量劃痕間距值。劃痕間距相對(duì)比值(%)=(不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)劃痕間距值/0 h原始劃痕間距值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.11 蛋白的腫瘤表達(dá)差異分析和預(yù)后分析 使用GEPIA 網(wǎng)站 (http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)進(jìn)行蛋白的腫瘤表達(dá)差異分析和預(yù)后分析，腫瘤類(lèi)別選擇宮頸癌(cervical and endocervical cancers，CESC)，腫瘤和對(duì)應(yīng)正常組織數(shù)據(jù)來(lái)源于癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 7.0 軟件制圖。數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，以±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RNA-Seq 數(shù)據(jù)產(chǎn)出情況匯總和mRNA 差異表達(dá)分析 RNA-Seq 數(shù)據(jù)的整體產(chǎn)出情況表明，無(wú)論是KDM5C 蛋白過(guò)表達(dá)組(phage-KDM5C)還是對(duì)照組(phage)樣本過(guò)濾后的讀取值(reads)占比均＞96%，錯(cuò)誤率非常低(0.01%)，所有樣品Q(chēng)20值均＞97.5%，Q30值均接近94%，送測(cè)樣品測(cè)序生成的數(shù)據(jù)整體質(zhì)量較好，符合轉(zhuǎn)錄組分析的相關(guān)要求，后續(xù)的生物信息分析均基于過(guò)濾后讀數(shù)(Clean reads)的數(shù)據(jù)。通過(guò)分析得到過(guò)表達(dá)KDM5C 蛋白后差異顯著的mRNA。差異表達(dá)的mRNA火山圖如圖1A所示，與對(duì)照載體比較，過(guò)表達(dá)KDM5C導(dǎo)致691個(gè)mRNA 的表達(dá)明顯改變，其中356 個(gè)mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)，335 個(gè)mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)；差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本聚類(lèi)分析如圖1B 所示；與Hippo-YAP1 通路相關(guān)的差異表達(dá)mRNA如表2所示。

圖1 差異mRNA表達(dá)組學(xué)分析Fig.1 Transcriptomics analysis of differential mRNA expression

表2 Hippo-YAP1通路差異表達(dá)mRNA示例Tab.2 Examples of differentially expressed mRNAs in Hippo-YAP1 pathway

2.2 基因GO富集分析 GO富集分析結(jié)果顯示，在生物學(xué)過(guò)程中，KDM5C蛋白的功能主要與各種生物體發(fā)育(如組織、系統(tǒng)、皮膚等)相關(guān)。在生物過(guò)程中，KDM5C 蛋白與單器官進(jìn)程(single-organism process)相關(guān)性最高；在細(xì)胞組分層面，胞內(nèi)(cytoplasm)、細(xì)胞器(organelle)和胞質(zhì)部分(intracellular)的mRNA對(duì)KDM5C蛋白表達(dá)差異影響最為明顯；在分子功能層面，KDM5C 功能與結(jié)合(binding)和蛋白結(jié)合(protein binding)密切相關(guān)(圖2)。

圖2 差異mRNA GO富集分析Fig.2 Differential mRNA GO enrichment analysis

2.3 KEGG 富集分析 KEGG 富集分析顯示，KDM5C 蛋白功能與細(xì)胞黏附(cell adhesion)、甾類(lèi)激素生物合成(steroid hormone biosynthesis)、沙門(mén)菌感染(salmonella infection)、凋亡(apoptosis)、FoxO 信號(hào)通路(FoxO signaling pathway)和Hippo-YAP1信號(hào)通路(Hippo-YAP1 signaling pathway)等相關(guān)(圖3A)。Hippo-YAP1 信號(hào)通路及其相關(guān)蛋白的表達(dá)差異見(jiàn)圖3B。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 應(yīng)用STRING 蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫(kù)各輸入20 個(gè)表達(dá)明顯上調(diào)或下調(diào)的mRNA，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果如圖4 所示。盡管現(xiàn)有數(shù)據(jù)并未直接表明KDM5C 蛋白與YAP1 蛋白存在互作關(guān)系，但YAP1、EGFR 蛋白均可與NF2 因子結(jié)合，進(jìn)而間接與KDM5C蛋白相互作用。

2.5 KDM5C蛋白對(duì)YAP1基因和蛋白表達(dá)的影響KDM5C蛋白過(guò)表達(dá)細(xì)胞系的RNA-Seq轉(zhuǎn)錄分布差異顯示，高表達(dá)的KDM5C 蛋白可在轉(zhuǎn)錄水平降低YAP1基因的表達(dá)(圖5A)。RT-qPCR 和Western blotting 結(jié)果顯示，降低KDM5C 蛋白的表達(dá)可明顯增強(qiáng)YAP1基因和蛋白的表達(dá)(P＜0.05)(圖5B、C)，該趨勢(shì)與已經(jīng)被證實(shí)的EGFR基因一致[8]，后者同樣可被si-KDM5C誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)。此外，KDM5C基因敲低后也會(huì)導(dǎo)致YAP1蛋白的磷酸化增強(qiáng)(圖5C)。

圖5 KDM5C在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對(duì)YAP1表達(dá)的影響Fig.5 KDM5C affects YAP1 expression at transcription and translation levels

2.6 KDM5C 蛋白對(duì)YAP1基因轉(zhuǎn)錄的影響 ChIPseq 分析顯示，過(guò)表達(dá)KDM5C 蛋白可明顯降低H3K4me3在YAP1基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)間的富集水平，而H3K4me1 則相反(圖6A)；ChIP-qPCR 也進(jìn)一步證實(shí)了KDM5C 蛋白過(guò)表達(dá)可使H3K4me1 對(duì)YAP1和EGFR基因啟動(dòng)子的富集增強(qiáng)，而H3K4me3 對(duì)YAP1和EGFR基因啟動(dòng)子的富集作用則減弱(圖6B、C，P＜0.05)。

圖6 KDM5C對(duì)YAP1基因啟動(dòng)子區(qū)間組蛋白甲基化修飾的影響Fig.6 KDM5C affects histone methylation modification in YAP1 gene promoter region

2.7 KDM5C蛋白對(duì)CaSki細(xì)胞遷移和增殖的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KO-KDM5C 組細(xì)胞的遷移速度明顯高于KO-Vector 組和phage-KDM5C 組(圖7A、B)。CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果顯示，從36 h 開(kāi)始，KO-KDM5C 組細(xì)胞的增殖活性明顯高于phage-KDM5C組和KO-Vector組(P＜0.05，圖7C)。

圖7 KDM5C蛋白對(duì)CaSki細(xì)胞遷移和增殖的影響Fig.7 Effect of KDM5C protein to migration and proliferation of CaSki cells

2.8KDM5C、YAP1基因在腫瘤組織中的差異表達(dá)分析 對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析顯示，宮頸癌組織中YAP1基因的表達(dá)水平明顯低于正常組織(P＜0.05)，但KDM5C基因的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖8A)。生存分析顯示，KDM5C基因在前150個(gè)月對(duì)宮頸癌患者生存期的影響不明顯，而在YAP1高表達(dá)時(shí)宮頸癌患者前100 個(gè)月的生存率有所降低(圖8B)。

圖8 KDM5C和YAP1基因在宮頸癌中表達(dá)和生存分析Fig.8 Expression and survival analysis of KDM5C and YAP1 genes in CESC

3 討 論

宮頸癌是常見(jiàn)的婦科腫瘤，HPV16/18型高危病毒持續(xù)感染是其最主要的致病因素，此外，部分肺癌、口腔癌和腸癌等組織中也檢測(cè)到HPV的致病因子存在，全世界約有4.8%的癌癥與HPV相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高危型人乳頭瘤病毒HPV16 E6通過(guò)降解KDM5C 激活原癌基因的超級(jí)增強(qiáng)子表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展；同時(shí)還利用CaSki細(xì)胞的ChIP-Seq 和增強(qiáng)子RNA(eRNA) 分析描述了KDM5C 對(duì)超級(jí)增強(qiáng)子上H3K4me3/H3K4me1 的動(dòng)態(tài)調(diào)控及HPV16 E6 與KDM5C 的相互作用[8]。本研究在此基礎(chǔ)上，選擇HPV16感染的宮頸癌細(xì)胞系CaSki進(jìn)行KDM5C蛋白表達(dá)差異的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，以深入挖掘KDM5C蛋白在宮頸癌致瘤中的作用機(jī)制。

KDM5C 蛋白也被稱(chēng)為JARID1C 或SMCX，其基因位于人X 染色體上，編碼一個(gè)含1560 個(gè)氨基酸殘基的蛋白，其中Jmj N域是該蛋白行使去甲基化功能最重要的結(jié)構(gòu)域。KDM5C 可特異性清除組蛋白第4位賴(lài)氨酸殘基(H3K4)的第2位和第3位甲基[13-14]，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起核心作用。KDM5C在人類(lèi)的大腦和骨骼肌組織中呈高表達(dá)，可參與細(xì)胞的多種生命活動(dòng)，包括細(xì)胞的增殖、分化、遷移、侵襲和凋亡，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤(如腎癌、肝癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15-18]，其參與宮頸癌進(jìn)程的分子機(jī)制正在深入研究中。本研究通過(guò)構(gòu)建CaSki過(guò)表達(dá)KDM5C基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序分析。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序中，受KDM5C蛋白表達(dá)調(diào)控的基因總數(shù)為737個(gè)，其中mRNA 691 個(gè)，其他類(lèi)型RNA 46 個(gè)，這些差異表達(dá)基因在染色體上基本呈均勻分布，未表現(xiàn)出明顯的染色體分布差異。對(duì)691 個(gè)差異表達(dá)的mRNA 進(jìn)行GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，KDM5C 蛋白功能主要集中在生物體的組織、系統(tǒng)、皮膚和器官等發(fā)育上，與各種蛋白結(jié)合及結(jié)合調(diào)控相關(guān)。進(jìn)一步行KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，KDM5C 主要參與了包括細(xì)胞黏附、阿米巴感染、凋亡、FoxO信號(hào)通路和Hippo-YAP1信號(hào)通路等相關(guān)過(guò)程的調(diào)控，其中與黏著斑的相關(guān)性最強(qiáng)，而與腫瘤相關(guān)的調(diào)控主要集中在FoxO和Hippo-YAP1信號(hào)通路上。FoxO轉(zhuǎn)錄因子屬于叉頭蛋白家族，F(xiàn)oxO蛋白作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器發(fā)揮作用，并激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，參與多種生物過(guò)程，包括細(xì)胞代謝、器官發(fā)育、應(yīng)激反應(yīng)和凋亡等[19]。Hippo-YAP1 信號(hào)通路激活導(dǎo)致MST1/2磷酸化并激活LATS1/2，后者迅速磷酸化YAP1 蛋白第127 位的絲氨酸殘基，進(jìn)而使其定位于細(xì)胞質(zhì)并發(fā)揮生物學(xué)功能[20]；而非磷酸化的YAP1則轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，并與其他蛋白共同發(fā)揮轉(zhuǎn)錄共激活作用[21]，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[22-23]。因此，YAP1通常也被視為原癌基因[24]。鑒于Hippo-YAP1 信號(hào)通路在腫瘤中的重要作用，本研究主要關(guān)注KDM5C 通過(guò)Hippo-YAP1 信號(hào)通路調(diào)控人宮頸癌發(fā)生的作用及其機(jī)制。

蛋白互作分析是研究蛋白功能的重要手段，STRING 網(wǎng)站顯示與KDM5C 互作的蛋白并不多見(jiàn)，現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)并不能直接證實(shí)KDM5C 與YAP1 直接相關(guān)，其原因可能與目前關(guān)于KDM5C蛋白的研究偏少有關(guān)，但本研究蛋白互作分析顯示，KDM5C與YAP1 可同時(shí)結(jié)合神經(jīng)纖維瘤病蛋白 2(neurofibromatosis type 2，NF2)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，受KDM5C 蛋白調(diào)控的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)同樣可結(jié)合NF2蛋白，后者作為腫瘤抑制因子，其本身也屬于Hippo-YAP1 通路的一員[25]，同樣可參與黏著斑的調(diào)節(jié)過(guò)程[26]。最新研究發(fā)現(xiàn)，Hippo-YAP1通路的蛋白受黏著斑分子的調(diào)控，YAP1蛋白也控制著整合素和黏著斑對(duì)接蛋白編碼基因的活性，因此，調(diào)節(jié)YAP1基因的轉(zhuǎn)錄活性可改變細(xì)胞力學(xué)、作用力發(fā)展和黏附強(qiáng)度，并決定細(xì)胞的形狀、遷移和分化[27]。以上結(jié)果進(jìn)一步提示KDM5C 與YAP1 蛋白及Hippo-YAP1 通路相關(guān)。此外，本研究KDM5C 蛋白過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表明，YAP1基因外顯子區(qū)間的表達(dá)相較于對(duì)照組明顯下調(diào)。為了進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論，本研究額外設(shè)計(jì)了3 條針對(duì)KDM5C基因的特異siRNA 來(lái)降低其表達(dá)水平，RTqPCR和Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，降低KDM5C基因的表達(dá)可上調(diào)YAP1基因和蛋白的表達(dá)。YAP1蛋白在體內(nèi)通常有磷酸化和非磷酸化兩種形式，敲低KDM5C基因可同時(shí)上調(diào)磷酸化和非磷酸化YAP1蛋白的表達(dá)。但本研究發(fā)現(xiàn)，外源性過(guò)表達(dá)的KDM5C 蛋白并不能降低YAP1 蛋白的磷酸化水平，具體原因可能與細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染導(dǎo)致的細(xì)胞刺激相關(guān)，有待于進(jìn)一步研究來(lái)闡明。

組蛋白的表觀遺傳學(xué)修飾是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的重要方式，過(guò)表達(dá)KDM5C 蛋白可通過(guò)降低H3K4me3水平而抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄。本研究采用的染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序結(jié)果表明，KDM5C 蛋白可影響H3K4me1 和H3K4me3 在YAP1基因啟動(dòng)子的結(jié)合水平，進(jìn)一步采用的染色質(zhì)免疫共沉淀qPCR也證實(shí)了該結(jié)論，提示KDM5C 蛋白對(duì)YAP1的作用主要是通過(guò)動(dòng)態(tài)調(diào)控該基因啟動(dòng)子的組蛋白甲基化水平，進(jìn)而影響YAP1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。因此，KDM5C 蛋白表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致YAP1 蛋白入核，入核的YAP1 蛋白可調(diào)控一系列腫瘤相關(guān)因子表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。HPV16 感染后，宮頸細(xì)胞的KDM5C 蛋白表達(dá)下調(diào)[8]，進(jìn)而促進(jìn)YAP1、EGFR和c-MET等原癌基因的表達(dá)上調(diào)，最終導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。以上結(jié)論在癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)中也得到了證實(shí)。然而，盡管KDM5C基因表達(dá)水平在宮頸癌組織中有下降趨勢(shì)，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與宮頸癌中包括了HPV 感染和非感染類(lèi)型，而KDM5C蛋白在HPV16感染陽(yáng)性的宮頸癌中表達(dá)下調(diào)更為明顯有關(guān)[8]。宮頸癌組織中YAP1基因的表達(dá)水平較正常宮頸組織明顯降低，提示YAP1基因的調(diào)控機(jī)制不僅僅是通過(guò)KDM5C蛋白影響其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)這一種途徑。盡管如此，KDM5C 和YAP1 蛋白對(duì)宮頸癌患者生存期的影響并不是十分明顯，提示了腫瘤發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜性。

綜上所述，本研究基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和染色質(zhì)免疫共沉淀等分析方法證實(shí)，KDM5C蛋白可通過(guò)動(dòng)態(tài)改變YAP1基因啟動(dòng)子的組蛋白甲基化修飾，在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平影響YAP1 的表達(dá)；YAP1 蛋白的表達(dá)變化導(dǎo)致Hippo-YAP1 信號(hào)通路改變，進(jìn)而影響宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究不僅為高危HPV陽(yáng)性宮頸癌的診斷、預(yù)后評(píng)估和治療提供了新的線索，而且為研究基因環(huán)境互作如何影響宿主細(xì)胞功能而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生提供了新思路。但本研究也存在不足之處：對(duì)YAP1蛋白的研究?jī)H基于細(xì)胞層面，缺乏在宮頸癌實(shí)體瘤和動(dòng)物模型中的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；過(guò)表達(dá)KDM5C蛋白并不能降低YAP1蛋白的磷酸化水平，具體原因尚待深入分析；盡管YAP1 是Hippo-YAP1 信號(hào)通路的核心蛋白，但該通路其他輔助蛋白尚待進(jìn)一步研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，KDM5C 與黏著斑的相關(guān)性最高，在介導(dǎo)細(xì)胞的黏著連接中具有重要的調(diào)節(jié)作用，后期將深入開(kāi)展其機(jī)制研究。