熱打擊單核細(xì)胞來(lái)源外泌體中miR-155 對(duì)肝細(xì)胞炎癥的影響及其機(jī)制

張明，李悅，楊經(jīng)文，施學(xué)智，肖吉彪，童華生*

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院/清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科一區(qū)，廣東 清遠(yuǎn) 511500；2解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科/全軍熱區(qū)損傷與組織修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510010

隨著全球氣候變暖，重癥中暑的發(fā)病率、致殘率及病死率在全世界范圍內(nèi)居高不下[1]。中暑誘發(fā)的肝功能障礙是其最嚴(yán)重的并發(fā)癥，目前尚無(wú)有效的干預(yù)措施。目前中暑導(dǎo)致肝損傷的機(jī)制尚不明確，主流觀點(diǎn)認(rèn)為，重癥中暑的本質(zhì)是熱刺激引發(fā)的、能導(dǎo)致患者器官功能障礙的炎癥損傷性疾病[2]。

中暑炎癥反應(yīng)傳導(dǎo)至肝臟并致病的具體機(jī)制仍然是中暑相關(guān)研究的技術(shù)難題[3]。作為炎性介質(zhì)的重要來(lái)源，單核巨噬細(xì)胞可在免疫相關(guān)疾病中發(fā)揮促炎作用，它們分泌的外泌體是一種胞外囊泡，其內(nèi)含物主要包括蛋白、微RNA(microRNA，miRNA)等，能夠在細(xì)胞與組織之間傳導(dǎo)生物學(xué)信號(hào)而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可能在中暑后炎癥傳導(dǎo)過(guò)程中導(dǎo)致肝臟細(xì)胞發(fā)生損傷[5]，且外泌體內(nèi)包含的miRNA 也能夠參與肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)[6]，

提示源自單核細(xì)胞的外泌體及其內(nèi)含miRNA 可能參與了包括肝臟損傷在內(nèi)的中暑炎癥損傷過(guò)程。烏司他丁作為一種臨床常用的抑制炎癥反應(yīng)的藥物，可控制重癥中暑后的炎癥反應(yīng)，聯(lián)合其他治療方式還能降低多器官衰竭及死亡的發(fā)生率[7-8]，但其具體的作用機(jī)制仍未明確。本研究旨在探討熱打擊后單核細(xì)胞來(lái)源外泌體內(nèi)miRNA 的變化及其對(duì)肝細(xì)胞的作用，以及烏司他丁作為干預(yù)藥物對(duì)肝細(xì)胞炎癥損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料 THP-1、HepG2 細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。ExoQuick外泌體提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)SBI公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京建成工程研究所，乳酸脫氫酶(LDH)、細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK-8 試劑盒及熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)公司。RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司。細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制分子1(SCOS1)、核因子κB(NF-κB)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。miR-155 模擬物、抑制劑、siRNA、陰性對(duì)照均購(gòu)自中國(guó)吉瑪基因公司。烏司他丁購(gòu)自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司。

1.2 單核細(xì)胞熱打擊方案 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃、含5% CO2及10%去外泌體血清的培養(yǎng)基中，分為對(duì)照組、熱打擊組、烏司他丁組。熱打擊開(kāi)始后，對(duì)照組細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)于37 ℃環(huán)境，熱打擊組及烏司他丁組在43 ℃敷箱中打擊1 h，再轉(zhuǎn)移至37 ℃環(huán)境復(fù)溫9 h。烏司他丁組在熱打擊前，添加烏司他丁(5000 U/ml)至細(xì)胞上清中，余操作同熱打擊組。

1.3 外泌體刺激受體肝細(xì)胞 收集各組單核細(xì)胞上清，采用ExoQuick 外泌體提取試劑盒在同樣條件下提取外泌體，操作過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞系HepG2上清中，分別加入對(duì)照組、熱打擊組及烏司他丁組單核細(xì)胞來(lái)源的外泌體樣本10 μg，作用24 h。

1.4 RT-qPCR法檢測(cè)外泌體及肝細(xì)胞內(nèi)相關(guān)miRNA及mRNA 的表達(dá) 采用RT-qPCR 試劑盒提取THP-1及HepG2細(xì)胞總RNA，采用外泌體RNA提取試劑盒提取各組外泌體的全部RNA，使用加尾法反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成miRNA 反轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，引物序列見(jiàn)表1，以U6及GAPDH基因作為內(nèi)參照，計(jì)算外泌體及肝細(xì)胞內(nèi)相關(guān)miRNA 及mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 基因引物序列Tab.1 The primer sequences in the study

1.5 肝細(xì)胞上清ALT、LDH水平及肝細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用比色法檢測(cè)肝細(xì)胞上清ALT、LDH 水平；采用CCK-8法檢測(cè)肝細(xì)胞存活率。

1.6 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-155 靶基因 使用TargetScan、PicTar 及miRWalk 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索miR-155 的潛在靶基因并取交集。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-155 靶基因 采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)構(gòu)建插入野生型SOCS1 3'-UTR 序列的pGL3 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染pGL3-luc-SOCS1 質(zhì)粒到293T 細(xì)胞并接種于96 孔板。24 h 后，按照試劑盒操作流程，加入miR-155模擬物及其陰性對(duì)照各5 pmol，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.8 Western blotting檢測(cè)SCOS1、NF-κB及β-actin蛋白表達(dá) 收集經(jīng)外泌體刺激的各組肝細(xì)胞并提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，常規(guī)行SDS-PAGE凝膠電泳及PVDF 膜轉(zhuǎn)印，檢測(cè)SCOS1、p-NF-κB及β-actin蛋白表達(dá)水平。

1.9 肝細(xì)胞炎性因子TNF-α 及IL-6 mRNA 表達(dá)檢測(cè)設(shè)立對(duì)照組、miRNA-155 抑制劑組、siSCOS1 組以及miRNA-155 抑制劑+siSCOS1 組，采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑，按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法分別將miRNA-155抑制劑、siSCOS1以及miRNA-155抑制劑+siSCOS1轉(zhuǎn)染入HepG2 肝細(xì)胞；將miR-155 模擬物和miRNA對(duì)照轉(zhuǎn)染到43 ℃熱打擊1 h 的HepG2 肝細(xì)胞。采用RT-qPCR檢測(cè)TNF-α及IL-6 mRNA表達(dá)，方法同1.4。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料先經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)是否符合正態(tài)分布，正態(tài)分布的變量以x±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，組間進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni 方法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 熱打擊單核細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)肝細(xì)胞的影響與對(duì)照組相比，熱打擊組肝細(xì)胞上清中ALT、LDH水平升高(P＜0.01)，肝細(xì)胞存活率降低(P＜0.05)，肝細(xì)胞內(nèi)TNF-α及IL-6mRNA 水平升高(P＜0.01)；而與熱打擊組比較，烏司他丁組ALT、LDH 水平降低(P＜0.01)，肝細(xì)胞存活率升高(P＜0.05)，TNF-α及IL-6mRNA水平降低(P＜0.01，圖1)。

圖1 熱打擊單核細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)肝細(xì)胞的影響Fig.1 The effect of the exosomes derived from monocytes on liver cells

2.2 熱打擊單核細(xì)胞來(lái)源外泌體miR-155含量變化與對(duì)照組相比，熱打擊組單核細(xì)胞及其來(lái)源外泌體中miR-155 水平均明顯增高(P＜0.01)；烏司他丁組單核細(xì)胞及其來(lái)源外泌體中miR-155水平與熱打擊組比較則明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖2)。

圖2 單核細(xì)胞及其來(lái)源外泌體內(nèi)miR-155水平Fig.2 The expression of miR-155 in the monocytes and the exosome derived from monocytes

2.3 miR-155的潛在作用靶點(diǎn)分析及驗(yàn)證 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)，SOCS1是miR-155的潛在靶點(diǎn)(圖3A)。雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，采用miR-155模擬物干預(yù)后，熒光素酶活性明顯下降(P＜0.01，圖3B)。Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，熱打擊組肝細(xì)胞內(nèi)SOCS1 蛋白表達(dá)水平下降，p-NF-κB 蛋白表達(dá)水平增高(P＜0.05)，而烏司他丁組SOCS1 蛋白表達(dá)水平高于熱打擊組，p-NF-κB蛋白表達(dá)量低于熱打擊組(P＜0.05，圖3C)。

圖3 miR-155通過(guò)靶向SOCS1調(diào)控肝臟炎癥反應(yīng)Fig.3 miR-155 regulates the inflammatory damage of liver cells in a SOCS1-dependent manner

RT-PCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，miRNA-155抑制劑組肝細(xì)胞內(nèi)TNF-α與IL-6mRNA 表達(dá)水平下降，siSOCS1組上升，miRNA-155抑制劑+siSCOS1組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3D)。

2.4 熱打擊單核細(xì)胞通過(guò)外泌體傳遞miR-155 對(duì)肝細(xì)胞的影響 轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑的單核細(xì)胞在熱打擊后釋放的外泌體，能使其孵育的肝細(xì)胞TNF-α和IL-6mRNA 表達(dá)下降(P＜0.05)；孵育來(lái)自熱打擊組單核細(xì)胞外泌體的肝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑能使其TNF-α和IL-6mRNA 表達(dá)下降(P＜0.05)。相反地，轉(zhuǎn)染miR-155模擬物到經(jīng)熱刺激的肝細(xì)胞后，肝細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-6mRNA表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖4)。

圖4 熱打擊單核細(xì)胞通過(guò)內(nèi)含miR-155影響肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)Fig.4 The monocytes stimulated by heat stress affect hepatocyte inflammation by exosome containing miR-155

3 討 論

單核細(xì)胞具有啟動(dòng)并級(jí)聯(lián)放大炎癥反應(yīng)的作用，是機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分。然而，在病理狀態(tài)下，單核細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)也參與了介導(dǎo)組織臟器的損害[9-10]。在中暑這種同樣屬于炎癥反應(yīng)損傷靶器官的疾病中，目前也有單核細(xì)胞被激活的證據(jù)[11]。另外，作為一種胞外囊泡，外泌體攜帶的內(nèi)含物介導(dǎo)了細(xì)胞間的信號(hào)傳遞，影響了免疫細(xì)胞和臟器實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間的功能互作[4]。本研究團(tuán)隊(duì)曾發(fā)現(xiàn)，外泌體內(nèi)含物改變促進(jìn)了中暑疾病炎癥反應(yīng)的進(jìn)程[12]。值得注意的是，單核細(xì)胞活化后釋放外泌體調(diào)控下級(jí)炎癥反應(yīng)的現(xiàn)象也很普遍，并被認(rèn)為是疾病潛在治療靶點(diǎn)之一[13]。但是在中暑研究領(lǐng)域，單核細(xì)胞外泌體的功能仍未被重視。為了觀察單核細(xì)胞外泌體在熱打擊過(guò)程中的作用，本研究首先觀察了這些外泌體對(duì)實(shí)質(zhì)細(xì)胞——肝細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)熱打擊后單核細(xì)胞存在炎癥相關(guān)基因表達(dá)的變化，并伴隨著其來(lái)源外泌體內(nèi)含調(diào)控基因的變化，進(jìn)而影響了孵育的肝細(xì)胞，使其在存活率、炎癥損傷方面發(fā)生改變。提示受到熱刺激的單核細(xì)胞可能通過(guò)外泌體激活附近實(shí)質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

為了初步了解單核細(xì)胞外泌體改變肝細(xì)胞的原因，本研究首先嘗試觀察了外泌體miRNA 的表達(dá)變化。miRNA 是一類非編碼單鏈小RNA，主要通過(guò)抑制靶基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，包括單核細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞能通過(guò)介導(dǎo)miRNA 表達(dá)，參與至少60種疾病的致病過(guò)程，同時(shí)，外泌體能夠攜帶、傳遞miRNA 到達(dá)靶細(xì)胞，具有穩(wěn)定、高效等特點(diǎn)[14]。miR-155是一種被廣泛研究的miRNA，可通過(guò)NF-κB 通路快速形成正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，活化炎癥通路[15]。有研究表明，免疫細(xì)胞來(lái)源的miR-155會(huì)在炎癥激活后，隨著釋放的微囊泡擴(kuò)散，進(jìn)而調(diào)控靶細(xì)胞微環(huán)境及炎癥狀態(tài)[16]。相似的，本研究也發(fā)現(xiàn)，熱刺激后的單核細(xì)胞miR-155明顯上調(diào)，并通過(guò)外囊泡傳遞增加靶細(xì)胞內(nèi)miR-155水平，伴隨了下游肝細(xì)胞炎癥損傷。使用miR-155抑制劑等藥物能緩解這一過(guò)程，與前人的研究結(jié)論類似。當(dāng)然，外泌體內(nèi)含物的改變是復(fù)雜多變的，本研究和很多類似研究都不能完全排除外泌體內(nèi)其他miRNA 或成分對(duì)靶細(xì)胞的影響，這也是本研究的不足。

SOCS1 是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(SOCS)蛋白家族成員，其典型特征是可變長(zhǎng)度的N 端區(qū)域，一個(gè)中心SH2 結(jié)構(gòu)域及一個(gè)C 端保守的SOCS 框[17]。大量研究證實(shí)，SOCS1 是細(xì)胞內(nèi)抑制炎癥發(fā)展的關(guān)鍵成分之一，除了直接與Jak 的結(jié)合、抑制JAK/STAT 通路以外，還能結(jié)合下游NF-κB 的p65 亞基、抑制TLR 信號(hào)通路，發(fā)揮炎癥抑制作用[18-19]。不僅如此，早有學(xué)者通過(guò)生物信息學(xué)方法分析、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí)了SOCS1 與miR-155 的靶向關(guān)系：miR-155作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)靶基因SOCS1 mRNA降解，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[20]?；谶@些研究成果，本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、雙熒光素酶、Western blotting 等，再次驗(yàn)證了miR-155 和SOCS1 的靶向關(guān)系，即驗(yàn)證了miR-155 與SOCS1 基因的結(jié)合位點(diǎn)，以及隨著肝細(xì)胞內(nèi)miR-155的變化，SOCS1呈下調(diào)趨勢(shì)等。另外，SOCS1 通路下游的NF-κB 是很多炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著SOCS1 的下調(diào)，NF-κB 表達(dá)明顯增加，這可能是炎癥基因活化的機(jī)制。由此綜合分析，熱打擊的單核細(xì)胞可能通過(guò)外泌體傳遞miR-155，介導(dǎo)靶細(xì)胞SOCS1轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)而發(fā)揮促炎作用。

烏司他丁作為一種尿胰蛋白酶抑制劑，是臨床上可獲得的非特異性的抗炎藥物，能改善包括膿毒癥在內(nèi)的炎癥性疾病患者的預(yù)后，且仍有進(jìn)一步拓寬臨床適應(yīng)證的價(jià)值和趨勢(shì)[21-22]?，F(xiàn)今，炎癥調(diào)控治療在類似膿毒癥的中暑疾病里，也受到持續(xù)關(guān)注[7-8]。鑒于在活體內(nèi)使用特異性抗炎藥物的方案仍處于理論研究階段，非特異性的抗炎藥物烏司他丁在中暑治療中的臨床價(jià)值亟待更深入的探索。為了初步在體外證實(shí)烏司他丁干預(yù)免疫細(xì)胞對(duì)炎癥反應(yīng)的潛在影響，本研究使用烏司他丁作為干預(yù)單核細(xì)胞的治療藥物，結(jié)果顯示，烏司他丁能緩解單核細(xì)胞表達(dá)和釋放炎癥性miR-155。這種外泌體在作用于實(shí)質(zhì)細(xì)胞后，無(wú)論是在炎性因子的表達(dá)，還是炎癥通路的蛋白方面，都表現(xiàn)出炎癥緩解的表型。當(dāng)然，本研究未對(duì)烏司他丁調(diào)控miRNA 的具體機(jī)制進(jìn)行分析，借鑒前人的研究結(jié)論推測(cè)，這種效果可能是通過(guò)抑制生成miR-155的轉(zhuǎn)錄因子實(shí)現(xiàn)的[15,23]。

綜上所述，熱打擊能刺激單核細(xì)胞促進(jìn)肝細(xì)胞炎癥性損傷，這可能是通過(guò)釋放外泌體miR-155靶向肝細(xì)胞內(nèi)SOCS1 實(shí)現(xiàn)的。使用烏司他丁可能抑制熱打擊單核細(xì)胞釋放外泌體miR-155，從而發(fā)揮潛在抑炎作用。