中國北方3-羥基異戊酰肉堿異?；純捍x及遺傳分析

張萬巧 閆 磊 朱麗娜 馬秀偉

中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學中心兒科醫(yī)學部 1.兒科研究所，2.兒內(nèi)科，3.出生缺陷防控關鍵技術(shù)國家工程實驗室，4.兒童器官功能衰竭北京市重點實驗室（北京 100700）

基于串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）的?；鈮A分析可用于輔助診斷有機酸血癥、脂肪酸氧化異常等多種遺傳代謝病[1]（inherited metabolic diseases，IMD）。參與支鏈氨基酸及奇數(shù)碳脂肪酸代謝的多種羧化酶功能障礙導致體內(nèi)3 羥基異戊酰輔酶A 和3 羥基2 甲基丁酰輔酶A 的累積，二者通過肉堿?；D(zhuǎn)移酶酯化為3 羥基異戊酰肉堿（3-hydroxyisovalerylcarnitine，C5OH）[2]。據(jù)報道C5OH 是篩查多種羧化酶缺乏（multiple carboxylase deficiency，MCD）、3-甲基巴豆酰輔酶A 羧化酶缺乏（3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency，3MCCD）、3 羥基3 甲基戊二酸尿癥（hydroxymethylglutaric aciduria，HMGA）、β-酮硫解酶缺乏（beta-ketothiolase deficiency，BKT）等多種疾病的有效標志物，在新生兒篩查中得到廣泛應用[3]。由于C5OH 相關疾病眾多，臨床表現(xiàn)及干預治療差異巨大，如何快速有效地對篩查異?；純哼M行鑒別、診斷十分關鍵。為探討中國北方臨床高危兒中C5OH 指標的異常情況及對后續(xù)診斷的貢獻，本研究綜合利用基于MS/MS、氣相質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）的 代謝分析以及基于外顯子組測序的遺傳分析，通過研究C5OH 異?；純旱募膊∽V、代謝表型與變異基因型的關系，以期為優(yōu)化臨床診斷及干預決策提供參考和依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2012年11月至2021年10月中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學中心所有行MS/MS 篩查的0～7歲住院患兒的臨床資料。

本研究獲得患兒家長的知情同意和醫(yī)院倫理委員會的批準（No.2018-1）。

1.2 方法

1.2.1 血/尿遺傳代謝病篩查 干血斑樣本采用非衍生化的方法，在Xevo TQD 串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（美國Waters 公司）上，使用氨基酸和脂酰肉堿同位素內(nèi)標NSK-A、NSK-B（美國劍橋同位素實驗室）進行檢測分析[4]。對初檢陽性患兒進行召回，重新采血樣復查?；鈮A譜并接受尿液GC-MS 檢測。尿液樣本采用尿素酶前處理，經(jīng)三甲基硅烷衍生化通過TRACE GC ULTRA-ISQ 氣相色譜質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher 公司）進行分析[5]；尿素酶、甲基硅烷化試劑BSTFA+TMCS(99:1)為美國Sigma 公司產(chǎn)品。所用化學試劑為色譜級純的甲醇、甲酸（美國Fisher Scientific 公司），分析級純的丙酮、正己烷、無水乙醇（北京化工廠）。質(zhì)譜檢測各代謝物指標的切值，參考國家臨檢中心2019 版專家共識[6]，結(jié)合本實驗室質(zhì)控優(yōu)化確定[7]。指標檢測結(jié)果超出切值上限或下限之外的認定為指標異常（升高或降低）。在疾病判斷時，某指標異常直接提示某種IMD 的被歸為篩查該病的主要指標；某指標異常與某種IMD 相關，但需與主要指標結(jié)合才能做出判斷的被歸為次要指標[8]。

1.2.2 基因變異分析及診斷標準 采集患兒及其父母EDTA 抗凝外周血，提取血液基因組DNA。采用Nimblegen 全外顯子芯片進行捕獲，利用Illumina Hiseq 測序平臺進行高通量測序分析（北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心）。所得疑似致病變異采用Sanger 測序驗證，并參考美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）分類標準對可疑變異進行致病性評估[9]。患者在同一致病基因上存在純合或復合雜合變異，且變異評估為“致病或可能致病”，結(jié)合血、尿代謝篩查結(jié)果及臨床表現(xiàn)給予診斷[10-11]。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以例（%）表示。非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)M（P25～P75）表示。

2 結(jié)果

2.1 血/尿樣本代謝分析結(jié)果

共檢測患兒53 119 例，檢測年齡3.0（2.0～3.7）天，男31 087 例、女22 032 例，男女比例1.41:1.53 119 例患兒中檢出C5OH 增高48 例，其中伴有其他指標升高的共12 例，包括：單伴3-羥基丁酰肉堿（3-hydroxybutyryl carnitine，C4OH）升高4 例，單伴丙酰肉堿（propionyl carnitine，C3）升高4 例，同時伴C4OH、C3 升高2 例，同時伴甲基巴豆酰肉堿（methyl butyl carnitine，C5:1）、C4OH 升高2例。通過尿液GC-MS 檢測，其中9 例檢出C5OH相關疾病代謝異常，生化診斷為有機酸血癥：包括MCD 4 例（血中C5OH、C3 同時增高），MCD 或3MCCD 2 例（血中僅見C5OH 升高，但部分MCD病例C3 可正常），BKT 2 例，HMGA 1 例。

2.2 患者血酰基肉堿水平分析

生化診斷IMD 的9 例患兒的異常?；鈮A水平分析見表1。C5OH 指標在其余未診斷的53 110 例住院患兒干血斑樣本中的檢測濃度為0.13（0.10～0.18）μmol/L；在2 例診斷BKT（ACAT1變異）的患兒中僅輕度升高（平均濃度為切值上限的1.5倍），且同時伴有C5:1、C4OH 升高；在6 例診斷MCD（HLCS或BTD變異）的患兒中顯著升高（平均濃度為切值上限的9.6 倍）；4 例（66.7%）伴C3升高；其中2 例（33.3%）還同時伴有C3/乙酰肉堿（C2）升高。

表1 各基因型診斷病例的血液?；鈮A分析結(jié)果(μmol·L-1）

2.3 確診患者基因檢測結(jié)果

提示MCD 的4 例患兒中，2 例檢出HLCS變異，確診為全羧化酶合成酶缺乏（holocarboxylase synthetase deficiency，HLCSD）；2 例檢出BTD變異，確診為生物素酶缺乏（biotinidase deficiency，BTD）。提示BKT 的2 例均檢出ACAT1變異；提示HMGA的1 例檢出HMGCL變異。生化診斷未分型疑似MCD 或3MCCD 的2 例，1 例檢出HLCS 變異，另1 例檢出BTD變異，最終確診MCD。

9 例患兒的基因診斷均與生化診斷相符，MCD或3MCCD 的6 例患兒的變異檢出情況見表2，共檢出2 種變異基因，5 例為復合雜合，1 例為純合；共檢出9 種變異型，其中3 種為新發(fā)現(xiàn)的，分別為c.1313delC（HLCS）、c.172T＞C（BTD）、c.491dupG（BTD）。HLCS病例1 和3 為滿族、同胞姐弟。

2.4 代謝指標診斷效率

本研究干血斑MS/MS 檢測中C5OH 單一指標篩查陽性率0.090%（48/53119），最終診斷IMD 9 例，陽性檢出率1: 5902，假陽性率0.073%（39/53110），陽性預測值18.75%（9/48）；C5OH 合并多指標（C4OH、C3、C5:1）篩查陽性率0.022%（12/53119），其中7例確診，假陽性率0.009%（5/53110）顯著降低，陽性預測值升高（58.33%，7/12）。另一血篩主要指標C5:1 在53 119 例住院兒中升高的例數(shù)為92例，篩查陽性率0.173%，高于C5OH，但C5OH合并C5:1 升高僅2 例，且后續(xù)均確診為BKT，陽性預測值達100%。C5OH 異?；純赫倩貜筒椴⑿蠫C-MS 檢測時，C5OH 升高合并尿代謝物異常9 例，后續(xù)全部確診，無一假陽性，陽性預測值100%。

3 討論

基于MS/MS 的IMD 篩查指標的設置既要盡量避免陽性患兒的漏診、誤診，又要將陽性召回率、假陽性率控制在可接受的范圍，以避免不必要的入院、檢查、隨訪以及家屬的焦慮。目前關于MS/MS 篩查指標的陽性率、假陽性率以及陽性患兒疾病譜等，國內(nèi)鮮見報道。C5OH 是MS/MS檢測的重要指標，已列入包括我國在內(nèi)的多個國家、地區(qū)的新生兒IMD 篩查項目[12]。由于該指標與MCD 等多個有機酸血癥相關，僅憑單一指標難以實現(xiàn)分型鑒別。另外，嚴重感染、腦梗、腦出血、早產(chǎn)、營養(yǎng)不良等因素也可繼發(fā)血中C5OH 的增高[13-14]，造成假陽性的增加[15]。目前，可利用臨床表現(xiàn)、GC-MS 尿代謝譜分析、酶學檢測和基因分析等多種手段來實現(xiàn)后續(xù)的確診。為考察C5OH 指標的診斷效能，以及如何綜合利用各手段以優(yōu)化診斷程序，本研究在53 119 例0～7 歲的高危兒中進行了為期9 年的觀察，發(fā)現(xiàn)C5OH 單一指標的假陽性率為0.073%，陽性預測值為18.75%。與梅奧醫(yī)學實驗室提出的MS/MS 新生兒篩查指標的推薦要求（假陽性率＜0.3%，陽性預測值＞20.0%）[16]大致相當。本研究利用C5OH 合并多指標C4OH、C3、C5:1 綜合分析，可顯著降低假陽性率，并提高陽性預測值，C5OH 合并C5:1 升高確診BKT 的陽性預測值達100%。

尿GC-MS 代謝分析是降低MS/MS 篩查假陽性的重要手段。本研究在對C5OH 異?；純翰裳獜筒榈耐瑫r，采集尿樣進行GC-MS 檢測。通過血、尿代謝譜綜合分析，生化診斷IMD 9 例。其中7 例，包 括4 例MCD、2 例BKT、1 例HMGA 可根據(jù)異常代謝物明確分型；另外2 例疑似診斷MCD 或3MCCD，未得到分型。后續(xù)對9 例生化診斷病例，利用全外顯子組測序技術(shù)進行遺傳分析，2 例疑診病例均明確為MCD；全部遺傳診斷結(jié)果均與生化診斷相符。血MS/MS 聯(lián)合GC-MS 尿檢測可生化確診HMGA、BKT 等疾??；且后續(xù)基因測序驗證中，未出現(xiàn)假陽性病例，陽性預測值高達100%。本研究未觀察到MS/MS 篩查陰性患兒出現(xiàn)C5OH 相關IMD 的疑似癥狀。由于隨訪時間較短，難以獲得篩查陰性患兒的基因信息，存在缺乏篩查假陰性相關結(jié)果等局限。

本研究中C5OH 代謝異常的主要疾病類型為MCD。MCD 是由于患者不能利用生物素所導致的可引發(fā)包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的多系統(tǒng)異常的有機酸血癥，包括HLCS和BTD兩種基因變異類型[16]。根據(jù)基因分析，本研究中HLCS和BTD缺陷占C5OH異常病因的66.7%（各為33.3%）。上述結(jié)果與南方浙江地區(qū)針對新生兒人群的發(fā)現(xiàn)不同。浙江新生兒篩查的C5OH 異常病例除3MCCD 外，未檢出其他疾病類型，致病主要遺傳原因為MCCC1、MCCC2基因變異[17]。本研究結(jié)果提示了中國北方C5OH異?；純旱倪z傳特點，并在此基礎上發(fā)現(xiàn)了MCD相關的3 種新變異型：HLCS（c.1313delC）、BTD（c.172T＞C）和（c.491dupG）。

本研究結(jié)果顯示MS/MS 篩查單一指標異常存在較高的假陽性，可通過結(jié)合多指標聯(lián)合分析、GC-MS 尿代謝檢測以及遺傳分析降低假陽性率，提高診斷特異性和準確性。MS/MS 聯(lián)合GC-MS 的血尿代謝分析可快速、有效獲得C5OH 相關異常的生化診斷，于明確分子診斷前及時指導臨床干預。基因檢測對鑒別HLCSD、BTD 等類型，以及后續(xù)進行遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷仍具有重要意義。