合肥市原發(fā)性肉堿缺乏癥新生兒篩查及基因變異分析

胡海利 李衛(wèi)東 王 燕 宋旺生 馬慶慶

1.合肥市婦女兒童保健中心（安徽合肥 230092）；2.安徽省婦幼保健院（安徽合肥 230001）

原發(fā)性肉堿缺乏癥（primary carnitine deficiency，PCD）是脂肪酸代謝障礙類疾病之一，是由于肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC 22A5基因變異引起的一種脂肪酸β氧化代謝病，由于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性降低，導(dǎo)致由腸道攝入的肉堿不足，體內(nèi)游離肉堿（free carnitine，C0）降低，脂肪酸氧化代謝障礙，引起能量代謝障礙和低血糖，又稱為肉堿攝取障礙或肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)障礙[1]。在目前可查及的文獻(xiàn)中，該病的檢出率國內(nèi)外差異較大，法羅群島的檢出率最高，達(dá)1/400[2]，澳大利亞檢出率最低（1/120000）[3]。國內(nèi)的檢出率為1/34517～1/11189[4-5]。

隨著串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在新生兒遺傳代謝病篩查（以下簡稱“新篩”）中的廣泛應(yīng)用，越來越多的PCD新生兒患者獲得早期篩查和確診。該病早期診斷的重要意義在于早防早治、避免功能損害和猝死，特別是學(xué)齡期患兒在學(xué)校體育課要盡量避免長跑或其他高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，從而避免意外發(fā)生。確診患兒還可以通過早期服用左卡尼汀避免該病對(duì)身體器官功能的長期損害。

現(xiàn)對(duì)合肥市新生兒疾病篩查中心近6 年串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，探討本地區(qū)PCD 檢出情況，分析本地區(qū)PCD檢出率與其他地區(qū)的差異、確診患兒基因變異類型及常見位點(diǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2016 年1 月至2021 年12 月在合肥市各級(jí)助產(chǎn)機(jī)構(gòu)分娩的新生兒共631 839例。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2016-003），患兒家長均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 新生兒篩查方法 按照《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范2010 年版》的要求，由分娩機(jī)構(gòu)產(chǎn)科護(hù)理人員采集新生兒足底血，制成干血濾紙片，由新篩物流系統(tǒng)統(tǒng)一遞送至合肥市新篩中心。采用美國Waters公司生產(chǎn)的Waters TQD 串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)試劑采用由芬蘭PE 公司生產(chǎn)的非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測(cè)定試劑盒。C0 參考值范圍10～55 μmol/L，如初篩血值＜10μmol/L者，召回新生兒及其母親進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜檢查，結(jié)果仍然偏低者進(jìn)行基因檢測(cè)。

1.2.2 基因變異檢測(cè)方法 抽取患兒及父母靜脈全血3 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝處理后，快遞至北京邁基諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，采用北京天根DP 318-03分離試劑盒提取DNA，–20℃保存?zhèn)溆?。靶向外顯子捕獲后，進(jìn)行二代測(cè)序（NGS），測(cè)序范圍包括10 個(gè)外顯子和外顯子上下游200 個(gè)堿基對(duì)的內(nèi)含子，對(duì)患兒及其父母SLC 22A5基因可疑變異位點(diǎn)進(jìn)行一代測(cè)序驗(yàn)證，可疑大片段缺失重復(fù)進(jìn)行多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)驗(yàn)證。所有變異位點(diǎn)的篩選分析依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）2015指南。

1.2.3 干預(yù)與隨訪 對(duì)確診的PCD患兒，按照《原發(fā)性肉堿缺乏癥篩查與診治共識(shí)》[6]及時(shí)給予左卡尼汀100～300 mg/(kg·d)，嬰兒期C0 濃度監(jiān)測(cè)1～3個(gè)月1次，兒童期每年2～3次，根據(jù)血漿C0濃度適當(dāng)調(diào)整藥量。每年監(jiān)測(cè)1次肝腎功能、血糖、血紅蛋白、肌酸激酶等，每半年進(jìn)行1次體格發(fā)育評(píng)價(jià)。做好家長宣教工作，避免患兒停藥、饑餓、劇烈運(yùn)動(dòng)等應(yīng)激狀態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的以中位數(shù)（M）（P25～P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 近6年合肥市串聯(lián)質(zhì)譜篩查及PCD發(fā)病情況

從2016 年至2021 年，全市活產(chǎn)數(shù)661 172 例，串聯(lián)質(zhì)譜新生兒篩查數(shù)631 839 例，總體篩查率95.6%，年度篩查率從2016至2021年逐年升高。確診PCD 患兒32 例，其中臨床+基因診斷30 例，臨床診斷2 例（1 例行基因檢測(cè)但未檢出變異位點(diǎn)，1例因家長拒絕未行基因檢測(cè)），PCD總體發(fā)病率為1/19745。見表1。

表1 2016—2021年合肥市新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查及PCD檢出情況

2.2 PCD患兒臨床特點(diǎn)及串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)C0結(jié)果

32 例患兒中，男20 例、女12 例；足月兒29 例，早產(chǎn)兒3 例；31 例出生體重正常，1 例為巨大兒。出生時(shí)未見其他缺陷及異常，確診時(shí)未出現(xiàn)臨床癥狀，患兒肝腎功能和血糖未見異常。有4 例患兒分別在1歲1個(gè)月、1歲5個(gè)月、1歲10個(gè)月、2歲1個(gè)月出現(xiàn)肌酸激酶增高。C0 初篩血值最低值為2.20 μmol/L，最高值為8.75 μmol/L，均數(shù)為（5.90±1.75）μmol/L，其中男孩（5.83±1.66）μmol/L，女孩（6.03±1.96）μmol/L，男、女孩差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.30，P=0.512）。C0確診血值最低值為2.14μmol/L，最高值為9.30 μmol/L，均數(shù)為（5.02±1.73）μmol/L，其中男孩（5.13±1.83）μmol/L，女孩（4.83±1.60）μmol/L，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.47，P=0.492）。

2.3 PCD基因檢測(cè)結(jié)果

32例臨床診斷為PCD的患兒中，31例進(jìn)行高通量測(cè)序聯(lián)合Sanger 驗(yàn)證，30 例檢出基因變異，其中復(fù)合雜合變異25例、純合變異5例，1例未檢出基因變異，基因確診率為96.8%（30/31）。在基因檢測(cè)陽性的30 例患兒SLC 22A5基因的60 個(gè)變異中，變異比例最高的為c.1400C＞G，占48.3%（29/60），其次為c.51C＞G，占15.0%（9/60）。有24例患兒至少攜帶1個(gè)c.1400C＞G，攜帶率為80.0%（24/30）。有8例患兒檢出c.51C＞G/c.1400C＞G基因型（26.7%，8/30），5 例檢出c.1400 C＞G/c.1400 C＞G 基因型（16.7%，5/30）。見表2。

基因確診的30 例患兒中男18 例、女12 例。復(fù)篩血值低于初篩血值24 例，復(fù)篩血值高于初篩血值6 例。在6 例復(fù)篩血值增高的患兒中有5 例攜帶c.1400C＞G變異。見表2。

2.4 C0血值與c.1400C＞G變異關(guān)系

根據(jù)是否攜帶c.1400C＞G變異，將患兒分為攜帶組和不攜帶組，其中攜帶組24 例。攜帶組的初篩C0值、確診C0值均高于不攜帶組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組間血C0值下降（初篩C0值-確診C0值）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 是否攜帶c.1400C＞G變異在初篩和確診時(shí)C0值比較(μmol·L-1)

3 討論

合肥市新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查起步于2015年7月，2016年開始在全市范圍內(nèi)針對(duì)常住人口實(shí)行部分免費(fèi)新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查，2018 年實(shí)行全免費(fèi)，近幾年串聯(lián)質(zhì)譜篩查率不斷提高。針對(duì)PCD的篩查指標(biāo)合肥市主要應(yīng)用C0，從確診的32例PCD患兒來看，所有患兒的C0均低于切值（10 μmol/L），提示串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)于PCD的篩查靈敏度較高，但目前的篩查評(píng)估方法可能導(dǎo)致首次篩查血值略高于切值的患兒漏篩，尤其是初篩血值在10～15 μmol/L 同時(shí)伴有其他種類酰基肉堿的降低，在今后的工作中應(yīng)予關(guān)注。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，不同年度PCD 的篩查檢出率差異較大，這可能與PCD 是罕見病，某一年度由于篩查量的制約不能很好地反映PCD的真實(shí)疾病檢出情況有關(guān)。從6 年60 多萬例篩查總量看，合肥市PCD總體檢出率為1/19745，高于河南省2013年至2017 年72 萬多例新生兒的檢出結(jié)果（1/34317）[5]，低于泉州54萬多例新生兒的檢出結(jié)果（1/11189）[4]、廣州市2015年至2019年20萬多例新生兒篩查檢出結(jié)果（1/13345）[7]以及石家莊地區(qū)16萬多例新生兒的調(diào)查結(jié)果（1/17785）[8]，與南京2013年至2018年新生兒篩查檢出率（1/19607）相近[9]。從目前可查及的文獻(xiàn)來看，由于PCD 為罕見病，且國內(nèi)各地區(qū)的檢出率均在1/20000 上下波動(dòng)，顯示PCD 的檢出率在中國地區(qū)間的差異不明顯。

本研究PCD患兒的基因診斷率為96.8%，高于相關(guān)研究對(duì)95例成纖維細(xì)胞肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)體低下患者的調(diào)查結(jié)果（70.5%）[10]以及 40例初篩陽性PCD患兒的基因診斷率（35.0%）[11]。本研究的基因診斷率明顯高于其他相關(guān)調(diào)查結(jié)果，可能與基因檢測(cè)方法不同有關(guān)，也可能與合肥市PCD患兒的基因變異種類及分布有關(guān)。本研究有1 例臨床確診患兒做了基因檢測(cè)，但未查及變異，可能是由于目前高通量測(cè)序方法主要對(duì)外顯子區(qū)域及其側(cè)翼序列上下游50 bp 深度的內(nèi)含子進(jìn)行測(cè)序，理論上可能會(huì)遺漏深度內(nèi)含子區(qū)域及啟動(dòng)子區(qū)域變異，也可能是SLC 22A5基因甲基化修飾的原因。這需要在今后的工作中進(jìn)一步加強(qiáng)基因診斷方法的研究，以提高檢測(cè)技術(shù)水平以及基因診斷率。

本研究發(fā)現(xiàn)SLC 22A5c.1400 C＞G 基因變異是本地PCD 患兒的熱點(diǎn)變異，占48.3%。其次為c.51 C＞G 基因變異（15.0%）。相關(guān)研究表明，c.51 C＞G 和c.1400 C＞G 變異分別占泉州地區(qū)SLC 22A5基因變異的第2 位和第3 位[4]，與本研究相近。有研究對(duì)2 093例正常新生兒進(jìn)行SLC 22A5基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，柳州地區(qū)的熱點(diǎn)變異為c.51 C＞G（56.5%）[12]。另有研究對(duì)12 例PCD 患兒進(jìn)行基因分析發(fā)現(xiàn)，c.760 C＞T 和c.1400 C＞G 變異占比最高，分別為37.5%和29.2%[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶SLC 22A5c.1400 C＞G 基因變異的患兒，初篩和確診C0血值均顯著高于不攜帶此變異的患兒，而且該基因變異相對(duì)于SLC 22A5其他類型的基因變異對(duì)血值下降的影響較小。這與相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)SLC 22A5c.1400 C＞G 變異會(huì)減少肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)，使血值下降，但其能保留較高活性的殘余肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)活性的結(jié)論相符[14]。

綜上，串聯(lián)質(zhì)譜篩查技術(shù)能夠有效篩查出C0偏低的新生兒，通過對(duì)SLC 22A5基因的二代測(cè)序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，從分子層面對(duì)其進(jìn)行確診，從而驗(yàn)證臨床診斷。這為PCD 患兒的早期治療干預(yù)、再生育遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷等都提供了重要的參考信息。