臍血來(lái)源干細(xì)胞治療早產(chǎn)兒疾病臨床研究進(jìn)展與挑戰(zhàn)

李 芳 王 利

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院兒科（重慶 401120）

近年來(lái)，隨著我國(guó)圍生醫(yī)學(xué)和新生兒醫(yī)學(xué)迅速發(fā)展[1]，越來(lái)越多的早產(chǎn)兒得以存活，早產(chǎn)相關(guān)疾病成為新生兒死亡的重要原因[2]。早產(chǎn)兒出生胎齡的不斷提前，早產(chǎn)相關(guān)疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也日益增加，如支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）、腦室內(nèi)出血（intraventricular hemorrhage，IVH）、腦白質(zhì)損傷（white matter injury，WMI)、壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）等，極大影響存活早產(chǎn)兒的遠(yuǎn)期生存質(zhì)量[3]。常規(guī)治療對(duì)于已受損組織的修復(fù)以及器官功能的恢復(fù)往往作用有限。干細(xì)胞可分化為各種組織，并具有免疫調(diào)節(jié)、改善微環(huán)境作用，還可以通過(guò)旁分泌作用產(chǎn)生大量有益的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和外泌體，有助于組織修復(fù)[4]，為臨床棘手的早產(chǎn)兒并發(fā)癥治療帶來(lái)了新的曙光。干細(xì)胞來(lái)源廣泛，其中臍血來(lái)源的干細(xì)胞（umbilical cord blood，UCB）具有獲取方便、不損害母體與胎兒、含量豐富、分化潛能高、免疫原性低、安全性高、低溫保存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)[5-6]。因此，臍血來(lái)源的干細(xì)胞移植（umbilical cord blood transplantation，UCBT）長(zhǎng)期以來(lái)成為臨床研究的重點(diǎn)。本文將圍繞UCBT在治療早產(chǎn)兒疾病的臨床研究現(xiàn)狀和面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行探討。

1 UCB的組成和UCBT類型

1.1 UCB的組成

UCB 含有間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem/stromal cells，MSCs）、造血干/祖細(xì)胞（hematopoietic stem/progenitor cells，HSCs）、內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitors，EPCs）、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等[7-8]。MSCs 是一類多能干細(xì)胞，具有分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞譜系的潛力[9]，還可分泌促進(jìn)組織修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞外囊泡[10]。MSCs 在UCB的含量較少，要提取到適用的MSCs，至少需要采集90 mL臍帶血且自采集到細(xì)胞提取的時(shí)間間隔不能超過(guò)2 小時(shí)[11]。與骨髓或外周血來(lái)源相比，UCB 來(lái)源的HSCs 更不成熟，在接受外來(lái)抗原刺激時(shí)增殖能力更強(qiáng)[12]。HSCs 可進(jìn)一步分化成骨髓系統(tǒng)的各種血細(xì)胞和淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞[13]。EPCs 是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，它們的功能主要是參與出生后缺血組織的血管生成和血管損傷后的修復(fù)[14]。淋巴細(xì)胞是免疫反應(yīng)的核心。與成人外周血相比，UCB 的B淋巴細(xì)胞占比類似、T淋巴細(xì)胞占比較少[15]。UCB來(lái)源的淋巴細(xì)胞表型和功能上都不成熟。單核細(xì)胞是血液中循環(huán)的未成熟吞噬細(xì)胞[16]，單核細(xì)胞可以分化為樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成骨細(xì)胞。單核細(xì)胞作為抗原呈遞免疫細(xì)胞，它們可以吞噬和降解微生物和顆粒物[17]。目前UCBT 治療新生兒疾病，根據(jù)移植成分不同分為：臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞移植（mesenchymal stem/stromal cells，MSCs）、臍帶血單個(gè)核細(xì)胞移植（cord blood-mononuclear cells，CBMNCs）和全臍帶血移植治療。

1.2 UCBT類型

1.2.1 臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞移植 MSCs 因易提取、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、低免疫原性和強(qiáng)大的分化潛力而獨(dú)具優(yōu)勢(shì)[18-19]，一直是新生兒細(xì)胞治療研究的重點(diǎn)。目前，國(guó)外商品化的臍帶血來(lái)源MSCs已經(jīng)用于臨床研究。歐盟資助的PREMSTEM 聯(lián)盟致力于對(duì)商品化的MSCs通過(guò)體內(nèi)和體外篩選進(jìn)行全面測(cè)試，將進(jìn)一步促進(jìn)臨床轉(zhuǎn)化[20]。近年來(lái)，MSCs細(xì)胞外囊泡的治療作用逐漸被發(fā)現(xiàn)[21-22]。

1.2.2 臍帶血單個(gè)核細(xì)胞移植 CB-MNCs是將人臍帶血采用密度梯度離心法分離得到單個(gè)核細(xì)胞[23]，包含豐富的造血干/祖細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等[24]。CB-MNCs 移植治療腦損傷、支氣管肺發(fā)育不良等研究較多，但究竟是哪種細(xì)胞發(fā)揮作用尚不清楚。CB-MNCs具有自我更新、多向分化為各種細(xì)胞表型的功能，其外分泌功能還參與了組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)[24]。自體CB-MNCs可以在出生后數(shù)小時(shí)或數(shù)天內(nèi)方便且安全地移植，其數(shù)量充足，不需要擴(kuò)增即可產(chǎn)生治療效果。

1.2.3 全臍帶血移植 全臍帶血移植于1989年報(bào)道可用于治療兒童范可尼貧血，此后被廣泛用于造血系統(tǒng)疾病的骨髓重建[25]。臍帶血干細(xì)胞的數(shù)量異常和早產(chǎn)兒并發(fā)癥相關(guān)[26-27]，且臍帶血富含胎兒血紅蛋白和大量的生長(zhǎng)因子、趨化因子，因此有學(xué)者采用全臍帶血移植以充分發(fā)揮臍帶血的優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)早產(chǎn)兒采集、制備和儲(chǔ)存臍帶血是方便可行的[28]，臨床上已經(jīng)有應(yīng)用全臍帶血移植治療早產(chǎn)兒貧血的I期研究。

2 UCBT在新生兒疾病治療中的臨床應(yīng)用

2.1 BPD

BPD 是一種由多種因素綜合作用引起的疾病，其發(fā)病率始終居高不下。早產(chǎn)兒未發(fā)育成熟的肺在機(jī)械通氣、感染等因素的影響下發(fā)育受阻，導(dǎo)致肺泡與毛細(xì)血管數(shù)量減少、發(fā)育不良或受損傷后修復(fù)障礙。盡管肺表面活性物質(zhì)使用、肺保護(hù)性通氣策略及其他藥物應(yīng)用于BPD的預(yù)防和治療，但并未根本性解決導(dǎo)致BPD發(fā)病的肺泡和血管發(fā)育受阻和損傷后的修復(fù)障礙問(wèn)題。干細(xì)胞的作用特點(diǎn)為UCBT 用于BPD 治療奠定基礎(chǔ)。近年來(lái)，各國(guó)均開(kāi)展了大量UCBT 治療BPD 的臨床研究，一些研究目前已經(jīng)進(jìn)入III 期臨床研究階段，其安全性、可行性和有效性均得到了初步驗(yàn)證。

2.1.1 UCBT 治療BPD 的安全性和可行性 韓國(guó)Chang 等[29]和杜克大學(xué)Powell 等[30]在超早產(chǎn)兒接受低劑量（1×107/kg）或高劑量（2×107/kg）氣管內(nèi)注射人臍帶血來(lái)源的MSCs 移植，未發(fā)現(xiàn)與移植相關(guān)的不良的結(jié)局。國(guó)內(nèi)重慶市兒童醫(yī)院Xia等[31]和越南Nguyen 等[32]以人源臍血MSCs靜脈注射治療重度BPD患兒，隨訪未發(fā)現(xiàn)移植相關(guān)不良事件。

2.1.2 UCBT治療BPD的有效性 Ahn等[33]2021年發(fā)表了Ⅱ期RCT臨床研究結(jié)果，33例超早產(chǎn)兒接受氣管內(nèi)移植人臍帶血來(lái)源的MSCs 1×107/kg；和對(duì)照組相比，干細(xì)胞移植組的氣道灌洗液的炎癥因子水平顯著下降。在亞組分析中，23～24 周組的嚴(yán)重BPD發(fā)病率顯著降低，干細(xì)胞移植后的患兒計(jì)劃隨訪至糾正年齡5歲，該研究結(jié)果尚未發(fā)表。同時(shí)研究者團(tuán)隊(duì)正在招募23～24 周患兒，開(kāi)展更大規(guī)模的Ⅱ期RCT 試驗(yàn)。廣東省婦幼保健院Ren 等[34]在早產(chǎn)兒生后8小時(shí)內(nèi)靜脈注射自體臍帶血單個(gè)核細(xì)胞（ACBMNCs，5×107/kg），試驗(yàn)組顯著減少了機(jī)械通氣時(shí)間和需氧治療時(shí)間。2023年廣東省婦幼保健院Zhuxiao等[35]在62例極早產(chǎn)兒生后24 h靜脈注射一劑ACBMNCs（5×107/kg），ACBMNCs注射組中重度BPD 發(fā)病率顯著降低，呼吸機(jī)拔管率更高；在校正18～24月齡時(shí)發(fā)育遲緩的發(fā)病率更低，CD4+T細(xì)胞、Treg細(xì)胞比例顯著增加，IL-10水平顯著升高，TNF-α 和CRP 水平顯著降低。該團(tuán)隊(duì)旨在探索自體臍帶血單個(gè)核細(xì)胞移植預(yù)防超早產(chǎn)兒BPD的多中心Ⅲ期隨機(jī)對(duì)照RCT 研究（NCT 04440670）正在開(kāi)展中。

2.2 新生兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病

極低出生體重兒（VLBW）救治存活率的提高使得遠(yuǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙問(wèn)題逐漸凸顯。約10%的VLBW 患者伴隨腦癱，高達(dá)50%的VLBW 患兒存在需要干預(yù)的學(xué)習(xí)困難或者行為異常[36]。盡管亞低溫治療對(duì)HIE、IVH、WMI等常見(jiàn)新生兒腦損傷有效，但是亞低溫只能達(dá)到部分神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)已造成損傷的神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)修復(fù)功能[37]，且只能用于治療（近）足月HIE。

目前應(yīng)用干細(xì)胞治療新生兒腦損傷的研究主要集中于IVH 和HIE，且尚處于安全性研究階段。Ahn 等[38]研究發(fā)現(xiàn)9 例胎齡（26.1±2.1）周的患兒在診斷IVH-IV ?后1 周內(nèi)腦室內(nèi)接受移植單次、低劑量（5×106/kg）或高劑量（2×107/kg）人臍帶血來(lái)源的MSCs 是安全和可行的。Cotton 等[39]發(fā)現(xiàn)予以亞低溫的HIE 患兒，予以自體臍帶血細(xì)胞移植是可行的，干細(xì)胞移植+亞低溫組和僅接受亞低溫組1 歲時(shí)Bayley III 評(píng)分≥85 為13/18（74%）對(duì)19/46（41%），移植后1 年內(nèi)未發(fā)生相關(guān)不良事件。日本Tsuji等[40]在發(fā)生重度窒息接受亞低溫治療的患兒中生后12～72 h 內(nèi)共接受3 次靜脈輸注自體臍帶血后，未發(fā)生相關(guān)移植不良事件。目前進(jìn)行中的臨床試驗(yàn)NCT 01284673 研究新生兒窒息的臍帶血干細(xì)胞的特點(diǎn)，目前已經(jīng)完成研究，尚未發(fā)表結(jié)果。ACTRN 12619001637134 旨在探索，超早產(chǎn)兒采集自體臍帶血和靜脈輸注單個(gè)核細(xì)胞的安全性和可行性[41]。

2.3 NEC

干細(xì)胞治療NEC 的研究目前絕大多數(shù)仍處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。Akduman等[42]2019年發(fā)表1例室上性心動(dòng)過(guò)速相關(guān)的新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎患兒臨床病例報(bào)告，該患兒術(shù)中發(fā)現(xiàn)腸道廣泛壞死，切除60 cm壞死、穿孔腸道后，靜脈移植1×107/kg臍帶血來(lái)源同種異體MSCs，移植后腸道血供恢復(fù)，逐步建立全腸道喂養(yǎng)；該患兒1 歲時(shí)的體格和神經(jīng)發(fā)育和同齡兒水平相當(dāng)。

表1 UCBT在新生兒疾病的臨床研究

2.4 早產(chǎn)兒貧血

Rudnicki 等[28]開(kāi)展了一項(xiàng)納入14例＜32周出生時(shí)貧血早產(chǎn)兒的臨床研究，其中5 例接受自體臍帶血移植，整個(gè)臍帶血輸注過(guò)程中和隨后的48小時(shí)內(nèi)，氧飽和度顯著增加，說(shuō)明早產(chǎn)兒中進(jìn)行全自體臍帶血移植的總體安全性和耐受性。Kotowski等[43]在5 例生后貧血的早產(chǎn)兒在生后5 天內(nèi)接受單次臍帶血輸注，15例患兒作為對(duì)照組接受同種異體的紅細(xì)胞輸注，臍帶血輸注組發(fā)生IVH 的比例是40%，低于對(duì)照組86.7%，推測(cè)自體臍帶血輸注在這個(gè)小樣本研究中是可行的、安全的。

2.5 先天性心臟異常

Burkhart等[44]對(duì)10例左心發(fā)育不良綜合征患兒接受II 期緩解手術(shù)的同時(shí)心肌內(nèi)注入（1～3）×106自體臍帶血來(lái)源的MNCs，其中1例發(fā)生干細(xì)胞注射相關(guān)不良事件注射部位心外膜出血，需要簡(jiǎn)單縫合，手術(shù)和干細(xì)胞移植后隨訪6個(gè)月，未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重MNCs移植不良反應(yīng)，且手術(shù)+干細(xì)胞移植（7 例）的嬰兒體重增長(zhǎng)、右心室分?jǐn)?shù)面積變化和射血分?jǐn)?shù)方面相較于既往單純手術(shù)對(duì)照組均有顯著改善。

3 臍血來(lái)源干細(xì)胞臨床應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)

盡管UCBT為早產(chǎn)兒疾病治療帶來(lái)了新的曙光，然而迄今為止的臨床研究雖然涉及多種臍帶血來(lái)源干細(xì)胞、多種移植途徑、多種早產(chǎn)兒疾病，但是多為前期安全性研究，研究設(shè)計(jì)多為小樣本單中心研究。見(jiàn)表1。UCBT治療早產(chǎn)兒疾病的臨床應(yīng)用中干細(xì)胞來(lái)源選擇、移植的方案包括時(shí)機(jī)、途徑、劑量、移植成分、與其他治療措施的相互作用以及潛在風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題亟待解決。

3.1 自體還是異體臍帶血移植

自體臍血干細(xì)胞采集是理想的移植材料，因?yàn)闆](méi)有移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)、且通常不存在倫理問(wèn)題。然而自體臍帶血移植可能存在采集量不足的問(wèn)題，尤其是早產(chǎn)兒經(jīng)延遲臍帶結(jié)扎處理后，如存在絨毛膜羊膜炎等產(chǎn)科并發(fā)癥將進(jìn)一步限制自體UCB 輸注[45]。NetCord-FACT 建議只采集沒(méi)有并發(fā)癥的分娩時(shí)孕周＞34 周嬰兒的臍帶血。胎齡越小，自體臍帶血采集量越低。Segler 等[46]研究中42%的＜30 周早產(chǎn)兒無(wú)法采集到足夠的臍帶血。此外，自體干細(xì)胞的采集、制備和移植均需要時(shí)間，可能導(dǎo)致錯(cuò)過(guò)了BPD和HIE等最佳的治療時(shí)間窗。

目前Ⅰ期和Ⅱ期的異體UC-MSCs 在新生兒疾病移植中已經(jīng)證實(shí)是安全可行的。異體UCB-MNCs移植治療兒童腦癱中正在開(kāi)展臨床研究[47]。臍帶血來(lái)源的其他干細(xì)胞的體外擴(kuò)增和異體移植，比如臍血來(lái)源的造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞目前尚處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段中[48-49]。

3.2 移植的最佳方案：時(shí)機(jī)、劑量和途徑

關(guān)于移植的時(shí)機(jī)，目前僅有動(dòng)物研究數(shù)據(jù)提示治療時(shí)間窗為損傷早期。研究表明，在藥物所致肺纖維化模型中，在給藥同時(shí)予以MSCs 可減輕肺纖維化，而給藥后1周作用不明顯[50]。另有研究表明，胎羊經(jīng)歷缺氧缺血事件后，和晚期移植（缺氧缺血后5 d）相比，早期移植（缺氧缺血后12 h）可顯著減輕腦白質(zhì)損傷[51]。關(guān)于移植的劑量，自體UCBMNCs移植治療腦癱的RCT研究發(fā)現(xiàn)：高劑量移植組（20×106/kg）的運(yùn)動(dòng)功能改善比低劑量移植組（10×106/kg）更好[52]。而前述多個(gè)臨床研究進(jìn)行了不同劑量的研究，著重關(guān)注了高劑量的安全性，而沒(méi)有比較高低劑量之間是否存在臨床結(jié)果的差異。目前UCBT 的途徑主要包括氣管滴入、靜脈注射和腹腔注射，而治療途徑又將影響治療劑量，因?yàn)橹苯酉驌p傷部位注射低劑量比靜脈注射高劑量要多出5 倍[53]。因此，在未來(lái)的臨床試驗(yàn)仍需解決在特定的新生兒疾病中，最佳的移植時(shí)機(jī)、移植劑量和移植途徑。

3.3 UCBT與其他治療措施的相互作用

早產(chǎn)兒常常需要多種措施治療，而這些治療措施與UCB 可能存在相互作用。如一氧化氮和促紅細(xì)胞生成素與MSC 治療有協(xié)同作用[54-55]，可以增強(qiáng)BPD 模型中的促血管生成和抗纖維化作用。而對(duì)HIE的研究表明亞低溫和間充質(zhì)干細(xì)胞可以具有協(xié)同作用[55]或拮抗作用[56]。這些研究表明，要將UCBT治療從可控制的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境轉(zhuǎn)向復(fù)雜和高度可變的臨床環(huán)境需要特別謹(jǐn)慎。

3.4 細(xì)胞治療的標(biāo)準(zhǔn)化

對(duì)于細(xì)胞的治療需要解決的一個(gè)重要問(wèn)題是要有一個(gè)穩(wěn)定的大量細(xì)胞供應(yīng)，其療效是持續(xù)一致的。由于不可能同時(shí)產(chǎn)生大量的細(xì)胞來(lái)滿足臨床需求，因此當(dāng)細(xì)胞從不同的來(lái)源和不同的時(shí)間獲得時(shí)，保持其一致的性能將是一個(gè)挑戰(zhàn)。因此，標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)生具有相同功效的細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)是至關(guān)重要的。基于MSCs 的治療面臨的另一個(gè)挑戰(zhàn)是，確定當(dāng)細(xì)胞傳代以增加細(xì)胞數(shù)量時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效果是否保持一致。

3.5 干細(xì)胞治療的遠(yuǎn)期風(fēng)險(xiǎn)

由于干細(xì)胞具有多向分化潛能，干細(xì)胞治療的遠(yuǎn)期潛在的致癌轉(zhuǎn)化一直以來(lái)是影響其臨床應(yīng)用安全性的一個(gè)關(guān)鍵因素。目前有不同的研究結(jié)果，有研究表明，長(zhǎng)期培養(yǎng)的骨髓來(lái)源的MSCs 容易發(fā)生自發(fā)性惡性轉(zhuǎn)化[57]，但最近的一項(xiàng)研究評(píng)估了hUBC-MSCs 在NOD SCID 小鼠模型中腫瘤發(fā)生中的作用，發(fā)現(xiàn)在NOD SCID小鼠中，hUC-MSCs沒(méi)有致瘤性，也沒(méi)有顯著促進(jìn)或抑制實(shí)體或血液學(xué)腫瘤的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移[58]。因此，所有接受干細(xì)胞治療的患兒需要長(zhǎng)期隨訪并且在治療前充分告知家屬潛在的風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)語(yǔ)

當(dāng)前早產(chǎn)兒疾病，特別是超/極早產(chǎn)兒相關(guān)疾病的有效治療對(duì)于新生兒科醫(yī)師來(lái)說(shuō)仍是巨大的挑戰(zhàn)。隨著對(duì)UCBT基礎(chǔ)和臨床研究的深入，大量的臨床研究已經(jīng)初步證實(shí)其在一些特定早產(chǎn)兒疾病治療中的安全性和潛在有效性，未來(lái)還需要在細(xì)胞治療來(lái)源選擇、治療機(jī)制、細(xì)胞治療的標(biāo)準(zhǔn)化管理和精準(zhǔn)治療方案等方面開(kāi)展進(jìn)一步的基礎(chǔ)和臨床研究以實(shí)現(xiàn)其在臨床實(shí)踐中發(fā)揮積極作用。