膠體金免疫層析試紙定量檢測豬肉中沙丁胺醇的研究

宋春美, 崔夢杰, 劉金鑫, 王德國

(許昌學(xué)院 食品與藥學(xué)院;河南省食品安全生物標(biāo)識(shí)快檢技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 許昌 461000)

沙丁胺醇是一種腎上腺類β2-受體激動(dòng)劑,是一種違禁藥物[1].沙丁胺醇?xì)埩舻某Ｒ姍z測方法如色譜法[2]、免疫法[3]、傳感器法[4]等,操作過程復(fù)雜、對儀器設(shè)備要求高.而色譜—質(zhì)譜法[5]、免疫學(xué)和層析技術(shù)的結(jié)合[6]、傳感器和分子技術(shù)的結(jié)合[7],能提高檢測靈敏度、擴(kuò)大檢測范圍.因此,需要建立一種簡便、靈敏、快速的檢測方法.

膠體金免疫層析技術(shù)結(jié)合了免疫反應(yīng)和層析原理,具有簡單、快速、直觀、方便等優(yōu)點(diǎn),缺點(diǎn)是肉眼判斷具有誤差,只能定性檢測或半定量檢測,且無法對檢測結(jié)果實(shí)時(shí)留存[8].膠體金免疫層析技術(shù)和便攜式免疫層析讀條儀的結(jié)合能夠?qū)崿F(xiàn)定量檢測、實(shí)時(shí)記錄存儲(chǔ)和現(xiàn)場高效檢測.基于此,以豬肉中的沙丁胺醇為檢測對象,用膠體金試紙—讀條儀定量檢測,為食品中沙丁胺醇的定量檢測提供技術(shù)借鑒.

1 材料與儀器

材料:沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品,壇墨質(zhì)檢—標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;沙丁胺醇檢測卡,深圳市白鰭豚生物科技有限公司;豬肉,胖東來超市、美高美超市、新大新超市.

儀器:ESLR11-MB-6404便攜式免疫層析試紙讀條儀,德國Qiagen;HC-B3002電子天平,慈溪市華徐衡器實(shí)業(yè)有限公司;H1850R臺(tái)式離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;DK-8D水浴鍋,常州普天儀器制造有限公司.

2 試驗(yàn)方法

2.1 膠體金試紙的檢測步驟及讀卡方法

將試紙放在桌面上待測,試紙應(yīng)即開即用.先向加樣孔中滴加2～3滴待測液,然后在3～10 min內(nèi)用肉眼比色法判斷,并記錄結(jié)果.同時(shí)打開便攜式免疫層析試紙讀條儀的電源,用USB接口銜接電腦,打開LFstudio軟件,將試紙?jiān)诳勺x值的時(shí)間范圍內(nèi)放入試紙卡槽中.在軟件中編輯樣品信息進(jìn)行讀值.通過軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線后,將其輸入讀條儀,無需再連接電腦,可攜帶讀條儀進(jìn)行實(shí)時(shí)的相關(guān)定量檢測.

2.2 靈敏度測定

將沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品配置成不同濃度的溶液:0、5、10、50、150、250 ng/mL.使用試紙用讀條儀讀值.

完全抑制濃度:對于定性分析,完全抑制濃度為肉眼觀察T線不顯示的最低濃度;對于定量分析,使用讀條儀掃描讀取試紙條信息,完全抑制濃度為T線無強(qiáng)度值時(shí)的最低濃度.

肉眼比色檢測限:用一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液滴加到試紙,顯色結(jié)果和滴加水樣的試紙進(jìn)行比較,觀察T線顯色,肉眼可明顯分辨出比水樣T線顯色弱的最低濃度,為肉眼檢測限.

定量檢測限:用讀條儀重復(fù)讀6個(gè)以上的水樣,空白值取T線讀值的平均強(qiáng)度值.以IC20為最低檢測限,即強(qiáng)度值比空白值弱20%的檢測濃度.

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:在定量檢測限與完全抑制濃度之間選擇不同濃度的標(biāo)品溶液進(jìn)行檢測,以強(qiáng)度值為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),通過讀條儀建立標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2.3 特異性測定

選擇同系物鹽酸克倫特羅(1、5 μg/mL)和萊克多巴胺(50、100 μg/mL)檢測沙丁胺醇試紙的特異性.以無交叉反應(yīng)為特異性好.

2.4 添加回收試驗(yàn)

樣品預(yù)處理:稱取陰性豬肉樣50 g,絞碎,盛于小燒杯中密封,水浴鍋內(nèi)加熱10～15 min,自然冷卻后移入離心管內(nèi),蓋緊管蓋放入離心機(jī)離心5 min,取出上清液備用.

添加標(biāo)準(zhǔn)品:在可定量檢測范圍內(nèi)選擇高中低三個(gè)添加量.沙丁胺醇的添加量為10、50、150 ng/mL.

測定回收率:通過建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線,用讀條儀對每個(gè)樣品進(jìn)行讀值,重復(fù)3次,取平均值.計(jì)算公式為

回收率=測量濃度值/添加濃度值×100%.

2.5 實(shí)際樣品檢測

在胖東來生活廣場、美高美超市和新大新購物廣場購買豬肉樣品,用免疫層析試紙進(jìn)行定量檢測.

3 結(jié)果與分析

3.1 靈敏度測定結(jié)果

沙丁胺醇試紙的靈敏度測定結(jié)果見圖1.當(dāng)沙丁胺醇的濃度為10 ng/mL時(shí),T線比水樣明顯變?nèi)?由此判定氯霉素試紙的肉眼檢測限為10 ng/mL.肉眼的完全抑制濃度為250 ng/mL.

圖1 沙丁胺醇試紙靈敏度測定結(jié)果

選取5、50、100、150、200、250 ng/mL的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.試紙檢測結(jié)果見圖2,標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3.由圖2可知,隨著標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增加,T線顯色越來越淺,有肉眼可見的梯度下降趨勢.由圖3可知,繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y=-1.8400X+466.6000,R2=0.998 0,說明沙丁胺醇試紙靈敏度較高,在5～250 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.在此范圍內(nèi)計(jì)算出的最低檢測限IC20為5 ng/mL,將試紙放入讀條儀可直接讀取濃度;當(dāng)沙丁胺醇濃度大于250 ng/mL時(shí),T線不顯色,直接判定為陽性.

圖2 用于定量檢測的沙丁胺醇試紙檢測結(jié)果

圖3 沙丁胺醇定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 特異性測定結(jié)果

沙丁胺醇試紙的特異性測定結(jié)果如圖4所示.可以看出,兩種試紙與其同系物均無交叉反應(yīng),即試紙不能檢測其他β2-受體激動(dòng)劑,表明試紙的特異性較好.

圖4 交叉反應(yīng)結(jié)果

3.3 添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

沙丁胺醇添加量為10、50和150 ng/mL時(shí)的回收率分別為87.97 %、110.51 %、118.79 %,平均回收率為105.76 %,具體結(jié)果見表1.可以看出,該定量檢測方法的回收率較好,而且精密度、準(zhǔn)確度較高.

表1 沙丁胺醇添加回收試驗(yàn)

圖5 實(shí)際豬肉樣品檢測結(jié)果

3.4 實(shí)際樣品檢測

對購買于胖東來生活廣場、美高美超市、新大新購物廣場的豬肉樣品進(jìn)行檢測,均檢測3次,代表性結(jié)果見圖5.可以看出,三種豬肉樣品試紙的檢測結(jié)果均為陰性.說明從三個(gè)超市購買的豬肉樣品中均不含有沙丁胺醇,食品安全可靠.另外將試紙用讀條儀進(jìn)行讀值,結(jié)果均為陰性,與肉眼結(jié)果一致.建立的定量檢測沙丁胺醇的免疫層析試紙技術(shù)成功用于實(shí)際樣品檢測.

4 結(jié)論

建立了定量檢測豬肉中沙丁胺醇的免疫層析試紙方法.該法的定量檢測限為5 ng/mL,定量檢測范圍為5～250 ng/mL,試紙與鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺無交叉反應(yīng).用其檢測模擬沙丁胺醇?xì)埩舻呢i肉樣品,平均回收率為105.76 %.檢測時(shí)間為5～10 min,肉眼判定后便可直接機(jī)讀記錄和保存結(jié)果.該方法應(yīng)用前景廣闊,可以為新型食品安全快速定量檢測技術(shù)的研發(fā)提供借鑒.