基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉小鼠的作用機(jī)制

林穎，司紅彬，王海林

(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/廣西畜禽繁育與疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004；2. 重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院，重慶 404100)

脾虛腹瀉(spleen-deficiency diarrhea，SDD)是中醫(yī)常見(jiàn)的泄瀉證型之一，臨床表現(xiàn)與西醫(yī)常見(jiàn)的腸易激綜合征腹瀉(irritable bowel syndrome with diarrhea，IBS-D)基本相似[1-2]。脾虛泄瀉是一種臨床常見(jiàn)的消化道疾病，它會(huì)破壞腸黏膜結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致腸道微生物組成發(fā)生變化[3]。目前脾虛泄瀉的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。臨床上用于治療脾虛泄瀉的常用藥物主要包括洛哌丁胺、阿托品和蒙脫石散等，但這些藥物在使用時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)不同程度的副作用[4]。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)治療脾虛泄瀉的新藥物。

七味白術(shù)散出自《小兒藥證直訣》，主要由人參、白茯苓、炒白術(shù)、藿香葉、木香、甘草、葛根組成，具有健脾益氣和胃生津的功效。在臨床上廣泛用于脾虛泄瀉的治療[5-7]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。因此，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用情況，將原方人參換為黨參，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合番瀉葉誘導(dǎo)的脾虛泄瀉模型，探討七味白術(shù)散改善脾虛泄瀉的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉及機(jī)制探討提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 中藥材來(lái)源及七味白術(shù)散制備

試驗(yàn)所用番瀉葉、黨參片、麩炒白術(shù)、茯苓、甘草片、木香、廣藿香和葛根等中藥材均購(gòu)于重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院中藥房，經(jīng)鑒定均符合2020版《中國(guó)藥典》；蒙脫石散(dictahedral smectite powder，DSP)購(gòu)于中興大藥房。

番瀉葉水煎液的制備：稱取番瀉葉500 g，加水適量浸泡后，煮沸10 min后過(guò)濾，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀65 ℃對(duì)濾液進(jìn)行濃縮，濃縮到相當(dāng)于原生藥濃度為1 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

七味白術(shù)散水煎液制備：參考2020年版《中國(guó)藥典》，結(jié)合臨床及課題組的方法進(jìn)行制備。黨參10 g、麩炒白術(shù)12 g、茯苓12 g、甘草片3 g、木香6 g、廣藿香10 g、葛根15 g，浸泡半小時(shí)，大火煮沸后改用小火煎煮，每次煎煮時(shí)間20～30 min。先后煎煮2次過(guò)濾，將2次煎煮的濾液混合，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)濾液進(jìn)行濃縮，濃縮到相當(dāng)于原生藥濃度為1 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)公司，許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0004。飼養(yǎng)于重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院動(dòng)物房。試驗(yàn)經(jīng)重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有試驗(yàn)操作均按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。

1.3 主要試劑

HE染液套裝(Servicebio，G1003)、Occludin抗體(Servicebio,GB111401)和Claudin-1(Servicebio,GB112543)抗體均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；D-木糖試劑盒(A035-1-1)購(gòu)自于南京建成生物工程研究所。

1.4 七味白術(shù)散活性成分的篩選和靶點(diǎn)的收集

依據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)“OB≥30%和DL≥0.18”的篩選規(guī)則，分別檢索七味白術(shù)散中各單味中藥的有效成分和對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白。通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)，將靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行均一化處理。

1.5 脾虛泄瀉疾病靶點(diǎn)的收集

鑒于西醫(yī)中無(wú)“脾虛泄瀉”的說(shuō)法，其癥狀與IBS-D基本相似，因此借助IBS-D疾病靶點(diǎn)來(lái)推測(cè)脾虛泄瀉疾病的靶點(diǎn)。通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取GSE14841數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集對(duì)4個(gè)健康志愿者和5個(gè)IBS-D患者的結(jié)腸進(jìn)行了基因測(cè)序。利用GEO2R進(jìn)行在線分析，獲取潛在的疾病靶點(diǎn)。在GeneCards、OMIM和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“irritable bowel syndrome with diarrhea”為檢索詞，收集IBS-D疾病相關(guān)的靶點(diǎn)。最后，將上述數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)進(jìn)行去重、合并。

1.6 七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉靶點(diǎn)的收集和PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用韋恩圖篩選七味白術(shù)散活性成分和IBS-D的交集靶點(diǎn)，該交集靶點(diǎn)被視為七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉的潛在靶點(diǎn)。將潛在靶點(diǎn)輸入到String數(shù)據(jù)庫(kù)中，以獲取蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interactions，PPI)的相關(guān)信息。接下來(lái)，采用Cytoscape軟件構(gòu)建可視化的PPI網(wǎng)絡(luò)，計(jì)算各個(gè)節(jié)點(diǎn)的Degree值，并獲得PPI網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.7 七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉潛在靶點(diǎn)富集分析

將七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG的富集分析。P<0.01為參考閾值進(jìn)行檢索，借助微生信網(wǎng)站對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.8 造模及分組

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為正常組(NC)8只和造模組40只。造模組采用番瀉葉水煎液建立脾虛泄瀉小鼠模型，給藥劑量為0.02 mL/g，連續(xù)給藥5周；正常組給予相應(yīng)劑量的生理鹽水。以小鼠腹瀉表現(xiàn)明顯以及小鼠體重減輕、活躍狀態(tài)減少和大便稀溏判斷為造模成功[8]。將造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組(Model)、蒙脫石散2 g/kg組(DSP)和七味白術(shù)散5 g/kg(低劑量)、10 g/kg(中劑量)和20 g/kg(高劑量)組，每組8只。蒙脫石散組和七味白術(shù)散組分別灌胃對(duì)應(yīng)劑量藥物，正常組和模型組灌胃等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥7 d，每天1次。給藥結(jié)束后，眼眶采血，收集血清和結(jié)腸組織。

1.9 相關(guān)指標(biāo)觀察和檢測(cè)

1.9.1 小鼠一般情況觀察

每日觀察并記錄各組小鼠體重、耗食量、糞便性狀、活動(dòng)度、精神狀態(tài)及死亡等情況。

1.9.2 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

將小鼠結(jié)腸組織分離、清洗干凈后，置于4%多聚甲醛溶液中固定，參照HE染色法制備切片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.9.3 免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織Claudin-1、Occludin蛋白的表達(dá)情況

參考文獻(xiàn)[9]方法，將包埋的結(jié)腸組織進(jìn)行免疫組化染色，在顯微鏡鏡檢拍照并掃描圖片，分析各組結(jié)腸組織樣本中Claudin-1、Occludin蛋白的表達(dá)情況。

1.9.4 血清D-木糖檢測(cè)

小鼠禁食不禁水24 h后，將3%D-木糖溶液按10 mL/kg的量灌胃，1 h后眼球取血，離心取血清，按照D-木糖試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 9軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05表示組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 七味白術(shù)散活性成分的篩選和靶點(diǎn)的收集

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)檢索七味白術(shù)散的化合物，然后依據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選規(guī)則收集七味白術(shù)散活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)，見(jiàn)表1。經(jīng)過(guò)合并和去重后，共獲得367個(gè)潛在靶點(diǎn)。

表1 七味白術(shù)散“中藥-化合物-活性成分-潛在靶標(biāo)”信息 個(gè)

2.2 脾虛泄瀉疾病靶點(diǎn)的篩選與分析

通過(guò)GEO2R在線分析發(fā)現(xiàn)GSE14841數(shù)據(jù)集中共有17 271個(gè)差異基因，以P<0.05和|log2FC|≥1.5為篩選條件，繪制火山圖和熱圖，共獲得77個(gè)差異基因，其中30個(gè)基因上調(diào)，47個(gè)基因下調(diào)，見(jiàn)圖1。然后將Genecards、OMIM、Disgenet和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)合并，刪除重復(fù)項(xiàng)后共獲得742個(gè)IBS-D的潛在治療靶點(diǎn)。

2.3 七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉潛在靶點(diǎn)的篩選與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

如圖2所示，七味白術(shù)散活性成分與IBS-D共有36個(gè)交集靶點(diǎn)，上述交集靶點(diǎn)被視為七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉的潛在靶點(diǎn)。構(gòu)建上述交集靶點(diǎn)的PPI圖，節(jié)點(diǎn)的大小和顏色反映Degree值的大小。根據(jù)Degree值的排序，AKT1(蛋白激酶)、EGFR(表皮生長(zhǎng)因子受體)、TNF(腫瘤壞死因子)和IL6(白介素6)等可能是七味白術(shù)散改善SDD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。表明七味白術(shù)散可能通過(guò)減輕脾虛泄瀉患者的炎癥，來(lái)減輕腸道損傷。

圖2 七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉潛在靶點(diǎn)GO富集

圖4 七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉潛在靶點(diǎn)KEGG通路富集

A.正常組；B.模型組；C.蒙脫石散組；D～F.分別為七味白術(shù)散低、中、高劑量組。

A.正常組；B.模型組；C. 蒙脫石散組；D～F.分別為七味白術(shù)散低、中、高劑量組。

A.正常組；B.模型組；C. 蒙脫石散組；D～F.分別為七味白術(shù)散低、中、高劑量組。

2.4 七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉潛在靶點(diǎn)的富集分析

將上述36個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行GO和KEGG通路分析。圖3表示七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉主要與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生(vascular endothelial growth factor production)、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)(membrane microdomain)和細(xì)胞因子活性(cytokine activity)等生物進(jìn)程有關(guān)。由于癌癥相關(guān)信號(hào)通路不是我們關(guān)注的重點(diǎn)，故KEGG富集分析主要為非癌癥信號(hào)通路。根據(jù)P值大小對(duì)富集通路進(jìn)行分析，七味白術(shù)散可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡(Apoptosis)、T細(xì)胞受體信號(hào)通路(T cell receptor signaling pathway)、炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease)和TNF(TNF signaling pathway)等信號(hào)通路改善脾虛泄瀉，主要涉及炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)生物進(jìn)程，見(jiàn)圖4。

2.5 七味白術(shù)散對(duì)各組小鼠一般情況和體重的影響

在試驗(yàn)期間，正常組小鼠飲食正常、反應(yīng)靈敏、糞便呈條狀或顆粒狀，體重增加。與正常組相比，模型組小鼠飲食減少，體重下降，反應(yīng)遲鈍，膽怯聚集，糞便為稀軟或帶有血絲，肛門(mén)紅腫并有污穢附著。如圖5所示，給藥7 d后，與正常組相比，模型組體重顯著降低；與模型組相比，蒙脫石散和七味白術(shù)散3個(gè)劑量組小鼠體重也明顯升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。小鼠的飲食情況、精神狀態(tài)和活動(dòng)度等也有一定程度的改善。

2.6 七味白術(shù)散對(duì)各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)的影響

正常組小鼠結(jié)腸黏膜上皮完整，上皮細(xì)胞排列整齊，刷狀緣清晰可見(jiàn)，有大量杯狀細(xì)胞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少(圖6A)。模型組小鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞壞死、脫落，其形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性被破壞，細(xì)胞排列紊亂，結(jié)腸黏膜層可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞減少(圖6B)。蒙脫石散和七味白術(shù)散低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸黏膜出現(xiàn)上皮再生，其形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性得到恢復(fù)，細(xì)胞排列規(guī)則有序，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少(圖6C～F)。結(jié)果表明，七味白術(shù)散能有效減輕脾虛泄瀉小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)損傷。

2.7 七味白術(shù)散對(duì)各組小鼠結(jié)腸組織Claudin-1、Occludin蛋白的影響

與正常組相比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中Claudin-1、Occludin蛋白的表達(dá)明顯降低；與模型組相比較，蒙脫石散和七味白術(shù)散高劑量組(20 g/kg)小鼠結(jié)腸組織中Claudin-1、Occludin蛋白的表達(dá)顯著升高，見(jiàn)圖7、8和表2。表明七味白術(shù)散具有明顯改善脾虛泄瀉小鼠腸道屏障的作用。

表2 各組小鼠結(jié)腸組織中Claudin-1、Occludin表達(dá)平均光密度值比較(n=3)

2.8 七味白術(shù)散對(duì)各組小鼠血清D-木糖的影響

與正常組小鼠相比，模型組小鼠血清D-木糖含量明顯降低(P<0.05)。D-木糖進(jìn)入體內(nèi)后，通過(guò)消化道到達(dá)小腸，在小腸吸收入血，血清D-木糖的含量降低表明模型組小鼠小腸吸收功能下降。與模型組相比，蒙脫石散和七味白術(shù)散20 g/kg組血清D-木糖水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖9。

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。

3 討論

脾虛泄瀉是臨床常見(jiàn)的胃腸道綜合征，以泄瀉為最常見(jiàn)的癥狀。常表現(xiàn)為大便稀溏、腹痛、精神狀態(tài)不佳等[10]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾虛泄瀉主要是由于脾氣虛導(dǎo)致運(yùn)化失常，引起腹瀉、久瀉不愈和消瘦或乏力等癥狀，臨床上主要采用健脾滲濕止瀉的方法治療[11]。中醫(yī)藥治療脾虛泄瀉不僅可有效改善其臨床癥狀，而且具有成本低廉、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)[12-13]。七味白術(shù)散是根據(jù)現(xiàn)代社會(huì)脾虛泄瀉患者中醫(yī)辨證論治，在《小兒藥證直訣》原方上改良的經(jīng)驗(yàn)方劑。研究表明七味白術(shù)散對(duì)脾虛泄瀉等癥狀具有明顯的改善作用[14]，但其作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可為中藥復(fù)方的作用機(jī)制研究提供一定的參考。本研究整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)和藥理學(xué)研究探索七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉潛在作用機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，AKT1、EGFR、TNF和IL6等可能是七味白術(shù)散抗脾虛泄瀉的關(guān)鍵靶點(diǎn)，七味白術(shù)散可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、炎癥性腸病和TNF等信號(hào)通路改善脾虛泄瀉，主要涉及炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等途徑改善脾虛泄瀉。腹瀉和試驗(yàn)性腹瀉患者常伴有腸道炎癥，以及嚴(yán)重脫水和腸道屏障受損[15]。炎癥介質(zhì)水平的升高與腸炎過(guò)程中黏膜的病理?yè)p傷有關(guān)，反映了疾病的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果表明，患有脾虛泄瀉小鼠的結(jié)腸組織中存在嚴(yán)重的炎癥浸潤(rùn)，伴隨著組織結(jié)構(gòu)的喪失和杯狀細(xì)胞數(shù)量的減少，七味白術(shù)散干預(yù)可減輕結(jié)腸組織的病理?yè)p傷。Claudin-1、Occludin是腸道屏障完整性相關(guān)蛋白，與腸道吸收、分泌和代謝密切相關(guān)[16-18]。腹瀉時(shí)緊密連接蛋白的表達(dá)下調(diào)，腸黏膜屏障功能受損，免疫組化結(jié)果證實(shí)在給予七味白術(shù)散后，脾虛泄瀉小鼠結(jié)腸中Claudin-1、Occludin的表達(dá)明顯上調(diào)，表明其具有改善腸道通透性和維持腸上皮完整性的作用。

血清D-木糖是一種戊糖，在小腸內(nèi)通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散的方式進(jìn)行吸收，吸收在體內(nèi)不被肝臟代謝，其吸收水平能反映小腸的吸收功能水平。故能通過(guò)各組小鼠的血清D-木糖含量來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的腸道功能[19]。本文中模型組小鼠D-木糖含量明顯下降，表明脾虛時(shí)小鼠的胃腸功能紊亂。使用七味白術(shù)散治療后，小鼠血清D-木糖含量增加，提示七味白術(shù)散可通過(guò)改善小鼠胃腸道功能發(fā)揮作用。

本研究仍存在一些不足之處。首先，數(shù)據(jù)庫(kù)篩選獲取的七味白術(shù)散活性成分和靶點(diǎn)可能不夠準(zhǔn)確。因?yàn)槠呶栋仔g(shù)散是通過(guò)口服吸收發(fā)揮作用的，七味白術(shù)散的化學(xué)成分可能在體內(nèi)進(jìn)行了代謝和轉(zhuǎn)化；其次，雖然我們發(fā)現(xiàn)七味白術(shù)散可能通過(guò)抗炎、調(diào)節(jié)免疫等途徑改善脾虛泄瀉的癥狀，但具體的分子調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步驗(yàn)證；最后，腸道菌群也是脾虛泄瀉發(fā)生發(fā)展的最關(guān)鍵因素之一，在未來(lái)的研究中需進(jìn)一步關(guān)注七味白術(shù)散對(duì)脾虛泄瀉小鼠腸道菌群的影響。

綜上，通過(guò)整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息學(xué)分析和試驗(yàn)驗(yàn)證，預(yù)測(cè)了七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉的物質(zhì)基礎(chǔ)，關(guān)鍵靶點(diǎn)與潛在分子機(jī)制，初步闡明了七味白術(shù)散可通過(guò)“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”改善脾虛泄瀉癥狀，為七味白術(shù)散治療脾虛泄瀉的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。