獲能前后綿羊精子的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析

毛飛，楊燕燕，蘇杰，，趙高平，李秀男，，王大清，巴音吉日嘎拉，曹貴方，*，王彩云*

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3. 內(nèi)蒙古賽科星家畜種業(yè)與繁育生物技術(shù)研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011517)

蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)組織或細(xì)胞中蛋白質(zhì)的研究，精子蛋白質(zhì)組學(xué)是鑒定精子中蛋白質(zhì)的種類(lèi)以及對(duì)其功能進(jìn)行分析的研究。質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展為精子蛋白質(zhì)組學(xué)奠定了基礎(chǔ)[8]。早期二維電泳(2-DE)可以分離蛋白質(zhì)，分離出的蛋白質(zhì)收集到數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配；現(xiàn)在主要使用高效液相色譜使樣品預(yù)分集，與2-DE相比具有更好的覆蓋率與分辨率。精子的主要生成器官是睪丸，占所有已經(jīng)鑒定組織特異性蛋白的1/3以上[9]。使用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，鑒定出7 346種蛋白，其中有300個(gè)蛋白編碼基因主要在人類(lèi)睪丸中表達(dá)[10]。有研究者使用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(TMT)技術(shù)結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)分析了杜泊羊精子體外獲能前后差異蛋白的表達(dá)，主要鑒定到的差異蛋白有熱應(yīng)激蛋白質(zhì)家族和前列腺特異性膜抗原(PMSA)家族等蛋白等[11]。本試驗(yàn)利用生物信息學(xué)手段分析了綿羊精子獲能前后的差異表達(dá)蛋白，結(jié)合參考文獻(xiàn)篩選出乳鐵蛋白(LTF)進(jìn)行驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究杜泊羊體外受精技術(shù)奠定基礎(chǔ)，以便提高母羊受胎率，實(shí)現(xiàn)地區(qū)經(jīng)濟(jì)效益的最大化。

1 材料與方法

1.1 綿羊精液

以手握法采集自?xún)?nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市賽科星研究院2～4歲、體格健康的3只雄性杜泊羊精子。

1.2 主要試劑

全蛋白提取試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒購(gòu)自生工生物(上海)股份有限公司；LTF抗體、β-actin內(nèi)參抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶(Trypsin)、二硫蘇糖醇(DTT)、硫脲(Thiourea)、蛋白酶抑制劑(Protease inhibitor)均購(gòu)自Sigma公司。

1.3 精子獲能的處理

將綿羊新鮮精子4 ℃下111g離心10 min，用PBS重懸精子制成精子懸液，將精子濃度調(diào)整為1×108個(gè)/mL，均分為2份，即獲能前的對(duì)照組與獲能后的獲能組。獲能組置于獲能培養(yǎng)基(0.0194 g咖啡因，0.06 g BSA，140 IU肝素，pH=7.5～7.8)孵育1 h，將獲能組與對(duì)照組精子各取5 μL，考馬斯亮藍(lán)染色，封片觀察。

1.4 總蛋白的提取及濃度測(cè)定

將對(duì)照組與獲能組精子用等體積的PBS清洗，加入含有1 μL蛋白酶抑制劑、10 μL的磷酸酶抑制劑和PMSF的預(yù)冷裂解液。將精子用研磨法研磨，12 000g，4 ℃離心5 min，上清液即為精子蛋白，提取的精子蛋白在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎肂CA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 SDS-PAGE

將精子細(xì)胞通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分離，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，厚度為1 mm，電壓為80 V，待蛋白條帶進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)到120 V。電泳完成后，用考馬斯亮藍(lán)染色液對(duì)凝膠染色15 min，用脫色液脫色2 h。觀察蛋白條帶分布。

1.6 數(shù)據(jù)檢索與生物信息學(xué)分析

收集好各個(gè)樣本，采用FASP酶解法對(duì)蛋白質(zhì)分解，取出部分酶解多肽，用反向高效液相色譜法(High PH RP)進(jìn)行分級(jí)，將上述得到的各個(gè)組分使用數(shù)據(jù)依賴(lài)采集(DDA)與數(shù)據(jù)非依賴(lài)采集(DIA)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與定量分析，每個(gè)樣本各采集1針。定量差異倍數(shù)閾值為≥1.5或≤0.6時(shí)選取為差異表達(dá)蛋白質(zhì)，通過(guò)DAVID軟件進(jìn)行GO分析，分別是生物進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能，通過(guò)KEGG在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異蛋白信號(hào)通路分析(北京奧維森基因科技有限公司協(xié)助完成)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證

將對(duì)照組與獲能組精子純化，用PBS洗3遍后向離心沉淀的精子團(tuán)加入1 mL TRIzol 裂解液，室溫靜置 5 min后加入 0.2 mL 氯仿，室溫靜置5 min。4 ℃、12 000g離心，將上層水相小心移入新的 1.5 mL EP管，加入0.5 mL異丙醇，4 ℃、12 000g離心，棄上清液，加入1 mL經(jīng)DEPC處理過(guò)的75%乙醇，4 ℃、7 500g離心。棄上清液，紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA的純度和濃度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。所有操作均在冰上操作。

依據(jù)熒光定量說(shuō)明書(shū)，將各個(gè)試劑置于冰上，按照2×ChamQ Μniversal SYBR qPCR Master Mix(10.0 μL)、上游引物(0.4 μL)、下游引物(0.4 μL)、 cDNA (1.0 μL)和ddH2O(8.2 μL)配置反應(yīng)體系，總體積共20 μL。操作完成后，按照反應(yīng)程序，每個(gè)樣品做3次重復(fù)。樣品基因?yàn)長(zhǎng)actoferrin，內(nèi)參為Protamine，利用NCBI設(shè)計(jì)特異性引物，物種為綿羊，引物序列如表1。

表1 引物序列

1.8 Western blot驗(yàn)證

將篩選出的差異蛋白進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。用SDS-PAGE分離獲能組與對(duì)照組的等量精子蛋白質(zhì)，用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后置于無(wú)蛋白快速封閉液中，于搖床上封閉15 min，分別加入LTF抗體(1∶1 000)、β-actin內(nèi)參抗體(1∶9 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。隨后用TBST清洗3次，孵育二抗(1∶2 000)2 h，清洗后顯色成像。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

使用Image J軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，使用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，使用GraphPad Prism對(duì)數(shù)據(jù)分析并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊精子獲能鑒定分析

通過(guò)咖啡因、肝素誘導(dǎo)的方法使獲能組精子發(fā)生頂體反應(yīng)。如圖1所示，未獲能的精子頭部前段被考馬斯亮藍(lán)染成藍(lán)紫色(紅色箭頭)，獲能精子由于頂體破裂，精子頭部呈淺藍(lán)色(橙色箭頭)。表明精子體外獲能成功并發(fā)生頂體反應(yīng)。

注：紅色箭頭代表未獲能，橙色箭頭代表獲能。

2.2 SDS-PAGE分析

精子細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品SDS-PAGE分析結(jié)果見(jiàn)圖2，對(duì)照組3個(gè)樣品與獲能組3個(gè)樣品的精子細(xì)胞蛋白質(zhì)電泳條帶清晰。分離出的蛋白質(zhì)質(zhì)量大多在35～100 kDa。

M. Marker；1～3. 對(duì)照組3個(gè)樣品；4～6. 獲能組3個(gè)樣品。

2.3 獲能前后綿羊精子差異蛋白表達(dá)GO分析

鑒定到杜泊綿羊精子蛋白共2 118個(gè)，其中獲能前后差異表達(dá)蛋白203個(gè)，獲能后表達(dá)上調(diào)蛋白質(zhì)27個(gè)，表達(dá)下調(diào)蛋白質(zhì)176個(gè)。對(duì)203個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO分析，共有193個(gè)蛋白質(zhì)存在注釋信息。從生物學(xué)進(jìn)程(biological processes)上看，參與解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育(anato-mical structure development)的29個(gè)差異表達(dá)蛋白，上調(diào)3個(gè)，下調(diào)26個(gè)，參與生殖(reproduction)的25個(gè)差異表達(dá)蛋白，上調(diào)4個(gè)，下調(diào)21個(gè)(圖3A)。從細(xì)胞組分(cellular component)上看，定位在細(xì)胞溶質(zhì)(cytosol)的差異蛋白有43個(gè)，36個(gè)下調(diào)，7個(gè)上調(diào)，定位在質(zhì)膜(plasma membrane)的差異蛋白有33個(gè)，28個(gè)下調(diào)，5個(gè)上調(diào)(圖3B)。從分子功能(molecular functions)上看，參與氧化還原(oxidoreductase activity)的有2個(gè)上調(diào)蛋白，17個(gè)下調(diào)蛋白(圖3C)。

A. 生物進(jìn)程分類(lèi)；B. 細(xì)胞組分分類(lèi)；C. 分子功能分類(lèi)。

2.4 獲能前后綿羊精子差異表達(dá)蛋白質(zhì)KEGG通路分析

為了獲得差異蛋白參與的信號(hào)通路，使用KEGG對(duì)差異蛋白進(jìn)行通路分析。KEGG分析表明，差異蛋白參與到25個(gè)相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，一些重要的信號(hào)通路如表2所示，其中，cAMP信號(hào)通路參與精子獲能、頂體反應(yīng)和酪氨酸磷酸化等調(diào)節(jié)。蛋白酶體和精子移動(dòng)有關(guān)，蛋白酶體與透明帶結(jié)合促進(jìn)頂體胞吐，精子泛素化和蛋白水解酶抑制劑有助于阻礙精子多精入卵，蛋白酶水解被抑制改變精子獲能進(jìn)程。Hedgehog信號(hào)通路與生物體組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，在精子發(fā)生的早期過(guò)程中起到調(diào)控作用，除此之外，還可以促進(jìn)卵巢中一些細(xì)胞的增殖、分化與修復(fù)。

表2 獲能前后綿羊精子表達(dá)差異蛋白質(zhì)KEGG信號(hào)通路

2.5 獲能前后部分差異表達(dá)蛋白

由表3可見(jiàn)，在篩選出的差異蛋白中，3個(gè)精子蛋白在獲能過(guò)程中豐度增加，13個(gè)精子蛋白在獲能過(guò)程中豐度下降。上調(diào)蛋白包括精子發(fā)生與中心粒關(guān)聯(lián)1樣蛋白、ADAM金屬肽酶結(jié)構(gòu)域2，下調(diào)蛋白包括乳鐵蛋白、β-防御素和精囊蛋白等，結(jié)合前人的研究，最終選取LTF做進(jìn)一步驗(yàn)證。

表3 獲能前后綿羊精子表達(dá)差異蛋白質(zhì)列表

2.6 獲能對(duì)綿羊精子LTF表達(dá)量的影響

通過(guò)質(zhì)譜分析篩選出LTF作為研究目標(biāo)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量與免疫印跡對(duì)LTF表達(dá)分布進(jìn)行分析。免疫印跡結(jié)果顯示(圖4)，LTF蛋白在對(duì)照組與獲能組均有表達(dá)，且獲能組的表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.000 1)。RT-qPCR結(jié)果顯示(圖5)，LTF基因mRNA在對(duì)照組與獲能組均表達(dá)，且獲能組表達(dá)量低于對(duì)照組(P<0.001)。

注：***表示P<0.001。

3 討論

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展對(duì)精子的功能提供了新的見(jiàn)解，鑒定到的蛋白質(zhì)可以作為促進(jìn)精子的生理功能的標(biāo)志物。有研究者分析杜泊羊精子體外獲能前后差異蛋白的表達(dá)，鑒定到差異蛋白共有348種，其中上調(diào)蛋白280種，下調(diào)蛋白68種。鑒定的差異蛋白有VCP蛋白和PMSA家族蛋白，與本研究所鑒定出的差異蛋白一致。這些蛋白主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生殖等過(guò)程，也參與了蛋白酶體信號(hào)通路[11]。本研究鑒定到差異蛋白質(zhì)數(shù)量與前人研究有所不相同，由于本研究設(shè)置的差異倍數(shù)閾值為≥1.5或≤0.6，而文獻(xiàn)中的差異倍數(shù)閾值是以1.5倍為變化；也可能是安徽與內(nèi)蒙不同地域環(huán)境對(duì)杜泊羊個(gè)體差異的影響等因素導(dǎo)致。前人研究得出PMSA家族蛋白在蛋白質(zhì)互作中作用明顯，而未具體研究信號(hào)通路分析。本研究得到的結(jié)果是在蛋白酶體信號(hào)通路中有PMSA家族蛋白參加。Hedgehog信號(hào)的調(diào)節(jié)表達(dá)是成人精子發(fā)生的一個(gè)特征，有研究表明Hedgehog信號(hào)通路參與小鼠精子的發(fā)生，通過(guò)SuFu蛋白可能會(huì)關(guān)閉單倍體生殖細(xì)胞中的Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)[15-16]。蛋白酶體是一種蛋白復(fù)合物，由催化蛋白和調(diào)節(jié)蛋白構(gòu)成，可以降解結(jié)構(gòu)發(fā)生錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)。泛素與蛋白質(zhì)連接后會(huì)產(chǎn)生泛素-蛋白酶系統(tǒng)(UPS)，UPS參與生殖過(guò)程中配子的發(fā)生、受精和獲能等過(guò)程[17]。蛋白質(zhì)泛素化是一種穩(wěn)定的共價(jià)修飾后翻譯，26S蛋白酶體和溶菌酶等可以降解底物蛋白。這種系統(tǒng)可以維持精子在受精時(shí)的正常功能，也是牛和其他哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和精子中存在的底物特異性蛋白質(zhì)回收途徑[18]。有研究表明，精子攜帶的蛋白酶體參與精子獲能已在人和豬精子中發(fā)現(xiàn)[19]。 LTF對(duì)精子獲能可能也有重要作用，參與了cAMP途徑，對(duì)獲能的作用還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

LTF是一種分子量為80 kDa的鐵結(jié)合糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵家族，首次在牛奶中分離出來(lái)，并在人乳中證明是鐵結(jié)合糖蛋白[20]。LTF在黏膜分泌物廣泛存在，例如淚液、唾液、陰道黏液、精漿、鼻腔和支氣管分泌物、膽汁、胃腸道液體和尿液等，在血液中主要是由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生[21]。LTF具有多種生物活性，參與多種生理和保護(hù)作用，主要有抗氧化、抗腫瘤、抗炎和抗菌等活性[14]。LTF在綿羊精子冷凍前后有顯著變化，可能與綿羊精子冷凍后品質(zhì)密切相關(guān)。LTF在先天免疫系統(tǒng)中起重要作用，存在于哺乳動(dòng)物的精漿中，包括馬、牛、狗和人。LTF是種馬附睪分泌的最豐富的蛋白質(zhì)之一，約占總蛋白質(zhì)分泌量的 41% 。研究顯示精液中的LTF與精子濃度和總精子呈正相關(guān)。LTF在附睪體和尾部細(xì)胞中表達(dá)可與精子結(jié)合，可能在保護(hù)和調(diào)節(jié)精子活性方面發(fā)揮生物學(xué)作用。Zumoffen等[22]報(bào)道在人的輸卵管分泌物中檢測(cè)到LTF，研究顯示LTF可以促進(jìn)生殖過(guò)程的調(diào)節(jié)，刺激精子獲能，調(diào)節(jié)精子亞群，使其與卵母細(xì)胞相互作用和受精。Kobayashi等[23]在牛的冷凍精液中添加了不同濃度的LTF，利用CASA分析了解凍后牛冷凍精液發(fā)現(xiàn)添加LTF有利于提高精子的活力和運(yùn)動(dòng)性能，人工授精率有所提高。Martins等[24]在冷凍馬精子中添加LTF有助于在冷凍期間保護(hù)馬精子。 Su等[25]研究發(fā)現(xiàn)10 μg/mL的LTF顯著改變了精子的活力。Estefanía等[26]研究發(fā)現(xiàn)LTF促進(jìn)大鼠精子的體外獲能，誘導(dǎo)頂體反應(yīng)的發(fā)生，影響胚胎移植的數(shù)量。在本研究中，LTF在獲能組中的表達(dá)量顯著降低，與前人研究結(jié)果一致。提示LTF對(duì)精子具有保護(hù)作用，且對(duì)獲能過(guò)程具有促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)鑒定出與綿羊精子獲能相關(guān)的差異表達(dá)蛋白共203個(gè)，其中27個(gè)上調(diào)蛋白，176個(gè)下調(diào)蛋白。蛋白參與解剖發(fā)育與生殖過(guò)程，也參加了cAMP和蛋白酶體等信號(hào)通路。并驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)LTF對(duì)精子獲能具有促進(jìn)作用。