糞便微生物移植及其在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用前景

周 剛 ，蘇衍龍 ，秦 毅 ，徐家康 ，王禮偉 ，秦 彤 ，謝 鵬 ,汪國蓮 ，劉 穎 ，秦進華

（1.江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 淮安 223399；2.淮陰師范學(xué)院，江蘇 淮安 223300；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100091；4.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院休閑農(nóng)業(yè)研究所，江蘇 南京 210023；5.淮陰區(qū)三樹鎮(zhèn)農(nóng)村工作局，江蘇 淮安 223399）

人類和其他脊椎動物的腸道內(nèi)寄居著龐大的微生物群，主要成員是細(xì)菌，同時還包括病毒、真菌、原生動物等，作為一個整體，它們之間相互競爭、協(xié)同和拮抗，從而影響宿主的健康和行為。健康的腸道微生物組在較長時間內(nèi)保持相對穩(wěn)定，但是微生物的豐度可以在外界干擾下發(fā)生變化，例如大量抗生素的攝入、飲食結(jié)構(gòu)的劇烈變化等，如Hildebrand 等研究發(fā)現(xiàn)使用抗生素干擾可使宿主腸道菌群發(fā)生長期改變。大量研究表明腸道菌群通過易位進入血液后，可通過微生物相關(guān)分子模式（LPS、dsRNA等）來激活宿主的模式識別受體（TLR、NOD1/2 等），參與心血管疾病的發(fā)病機制。在動物和人體研究中發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性炎癥性疾病與腸道微生物組中產(chǎn)短鏈脂肪酸菌數(shù)量下降相關(guān)。在人類醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用中，糞菌微生物移植（Fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT） 是治療艱難梭菌感染（Clostridium diff icile infection，CDI）的有效方法，而糞便銀行的建立將推動FMT 成為更易獲取和安全的治療方法。

在人類醫(yī)學(xué)上利用FMT 作為標(biāo)準(zhǔn)化的治療手段進行使用，還需要大量的長期隨訪數(shù)據(jù)，F(xiàn)MT 的潛在影響仍是未知或尚未發(fā)現(xiàn)的，特別是一些基于腸道菌群組成變化誘發(fā)自身免疫性疾病的潛在關(guān)系還需進一步研究。豬作為一種雜食哺乳動物，除了在消化系統(tǒng)的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)和生理特性與人類相近外，其腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群也與人具有高度的相似性，主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門和螺旋菌門等，因此利用豬作為研究FMT的模型動物將在一定程度上加速推進人類FMT 的研究進程。

1 FMT與人類疾病治療

1.1 FMT 可改善腸道微生物組紊亂

正常成年人的體內(nèi)由總數(shù)約為3.8×1013個微生物組成復(fù)雜的微生態(tài)群落，這些微生物通過集體代謝活動與宿主相互作用，為機體提供基本的代謝和生物學(xué)功能，例如提供能量、刺激免疫系統(tǒng)和產(chǎn)生定殖抗性等。健康成年人的腸道中細(xì)菌種類最多，由超過2 000 種細(xì)菌構(gòu)成核心微生物群，其中從胃到結(jié)腸的細(xì)菌密度和豐度都在逐漸增加。健康的腸道微生物群是一個具有功能冗余性的微生物生態(tài)系統(tǒng)，而現(xiàn)在越來越多的研究表明，腸道菌群在疾病的發(fā)病機制和發(fā)展進程中發(fā)揮了重要作用，但關(guān)于腸道菌群與疾病之間的因果關(guān)系和基本機制還沒有闡明，只知道FMT 可能是通過（圖1 所示）途徑改善腸道菌群進而影響疾病進程。腸道微生物群與機體健康的密切關(guān)系為FMT 進行相關(guān)疾病治療成為潛在可能?？缥锓NFMT 證實腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致乳腺炎，在不攝入酒精的情況下利用FMT 調(diào)節(jié)腸-肝軸，可改善酒精性肝病。賴氨酸特異性組蛋白脫甲基酶5（lysine-specific demethylase5，KDM5）功能的喪失與智力殘疾和自閉癥有著重要聯(lián)系，劉星吟等人利用果蠅KDM5 突變型模型，揭示宿主的基因突變與以腸道微生物為代表的環(huán)境因素之間的相互作用相關(guān)，通過靶向腸道菌群的干預(yù)，在一定程度上可以改善果蠅的異常社會行為。

圖1 FMT 可恢復(fù)腸道微生物群組成

1.2 FMT 可改善短鏈脂肪酸生成

短鏈脂肪酸（Short-Chain Fatty Acids，SCFAs）是飼糧纖維發(fā)酵的產(chǎn)物，結(jié)腸中專性厭氧菌的種類和數(shù)量是影響其產(chǎn)生的主要因素。SCFAs 主要包括乙酸、丙酸和丁酸等，其中擬桿菌門主要產(chǎn)生乙酸和丙酸，厚壁菌門主要產(chǎn)生丁酸。不同器官對SCFAs 有著不同的代謝特征，乙酸在小腸中被利用為機體提供能量，從而參與心臟、大腦以及肌肉的代謝。丙酸經(jīng)結(jié)腸吸收后通過肝臟的代謝成為組織能源，有研究表明在結(jié)腸中增加丙酸可以減少腹腔內(nèi)脂肪組織分布和肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量；巨噬細(xì)胞可清除入侵機體的病原體，在巨噬細(xì)胞分化期間，丁酸可抑制組蛋白脫乙酰酶3，從而驅(qū)動巨噬細(xì)胞的代謝變化、增強其抗微生物活性，提高抗腸道病原體的能力。此外，SCFAs 能降低結(jié)腸pH，提高其酸性環(huán)境，從而減少有害菌的生長，防止腸道功能紊亂，進而維持腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)。SCFAs 在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)方面也發(fā)揮重要作用，SCFAs 作為一種非特異性的組蛋白去乙?；敢种苿?，可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，控制原癌基因的表達(dá)，繼而防止結(jié)腸癌變的發(fā)生。FMT 通過增加或減少特定菌群（如霍氏真桿菌、微生子梭桿菌、雙歧桿菌、AKK 菌）或直接轉(zhuǎn)移SCFAs 來影響SCFAs 代謝。II 型糖尿病與SCFAs 產(chǎn)生不足有一定關(guān)系，利用FMT 將一些已經(jīng)鑒定出的與SCFAs 產(chǎn)生相關(guān)的細(xì)菌進行移植，或以這些關(guān)鍵細(xì)菌為靶點用個性化營養(yǎng)方案來防治II 型糖尿病。

1.3 FMT 可治療艱難梭菌感染

艱 難 梭 菌（Clostridioides diff icile，C-diff）是一種革蘭陽性厭氧芽孢條件性腸道致病菌，廣泛存在于自然界以及人和部分禽畜的糞便中，艱難梭菌芽孢在環(huán)境中抵抗力較強，耐高溫、耐氧氣、耐乙醇。艱難梭菌其主要的毒力因子是毒素A 和毒素B，作用于腸道而導(dǎo)致腸道炎癥和組織病變，進而可引起人的偽膜性結(jié)腸炎，甚至導(dǎo)致死亡。對艱難梭菌感染（clostridium diff icile infection，CDI）患者和模式動物的研究表明，腸道固有菌群可以抑制C-diff 的繁殖并降解其產(chǎn)生的毒素，從而不會表現(xiàn)出致病性。但由于近幾年廣譜抗生素的濫用，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，CDI 發(fā)病率逐年上升，其較高的復(fù)發(fā)率和病死率，給治療帶來了一定困難。Khanna等人研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性艱難梭菌感 染（recurrent Clostidium diff icile infection，rCDI）患者經(jīng)過FMT 治療后腸道微生物多樣性顯著增加，同時通過FMT 可成功治療rCDI。最近的一項Meta 分析得出結(jié)論，F(xiàn)MT 可以在高達(dá)90%的患者中解決CDI 癥狀。

2 豬FMT技術(shù)應(yīng)用及前景

2.1 豬FMT 與健康養(yǎng)殖

腸道微生物群在宿主體內(nèi)起著十分關(guān)鍵的作用，包括提供保護性腸道屏障、消化和代謝營養(yǎng)素以及調(diào)節(jié)免疫力等。許多變量可影響豬最初幾周內(nèi)腸道微生物的定植，包括母豬的陰道、皮膚和糞便微生物群、母乳和飼料消耗量、豬舍和豬只欄環(huán)境、病毒和細(xì)菌感染、抗菌劑使用以及屠宰或運輸過程中的應(yīng)激。這些因素可能影響豬只整個生產(chǎn)周期的微生物群組成。越來越多的證據(jù)表明腸道微生物是影響疾病的重要因素，對腸道微生物群的控制為預(yù)防疾病提供了新的思路和方法，糞便移植（Fecal Microbiota Transplantation，F(xiàn)MT）就是這樣一種新型的調(diào)控手段，F(xiàn)MT 還被研究作為提高家畜飼料效率的潛在工具。研究發(fā)現(xiàn)，豬只配種前增加飼糧纖維可促進卵母細(xì)胞成熟、提高胎兒期存活率和產(chǎn)仔數(shù)。我國飼糧纖維類型多樣，產(chǎn)量豐富且相比其他種類飼料具有一定的價格優(yōu)勢，但現(xiàn)階段卻不能科學(xué)地利用，造成了極大的浪費。在生豬養(yǎng)殖中，合理利用FMT 改善豬只腸道菌群以提高母豬對飼糧纖維的利用，對改善母豬的繁殖性能、提高母豬終身產(chǎn)仔數(shù)具有巨大的應(yīng)用潛力。Hu等人（2018）將成年金華豬糞便移植到杜長大三元仔豬中，發(fā)現(xiàn)外源糞便菌群可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群的組成對豬生長性能、腸道屏障功能和先天免疫有顯著影響。目前我國母豬的年生產(chǎn)力遠(yuǎn)低于歐美等發(fā)達(dá)國家，而當(dāng)國外品種肌間脂肪達(dá)到4%以上時，我國地方豬種的高肌間脂肪的特點也將不再突顯。腸道菌群對改善人類肥胖的研究給了人們一定的啟示，如果利用腸道菌群FMT 技術(shù)定向改變中國地方豬種的高背膘、低瘦肉率的特點，將提高我國豬肉的國際競爭力。

FMT 在豬疾病治療中也具有很好的應(yīng)用前景。抗菌藥使用不當(dāng)致使的藥物殘留和耐藥問題日益突出，發(fā)展無抗養(yǎng)殖是中國未來養(yǎng)豬業(yè)保障豬肉安全的趨勢，腸道菌群中的益生菌與病原菌直接或間接的相互作用從而影響疾病的進程，通過FMT 技術(shù)移植益生菌可達(dá)到減少利用抗生素治療疾病的作用。供體糞便中的微生物多樣性決定了FMT 成功與否，而FMT 中“超級供體”的提出，對于未來腸道微生物群的鑒定和為更有針對性的細(xì)菌治療方法提供可能。韓新燕團隊利用大腸桿菌K88 感染新生仔豬為模型，發(fā)現(xiàn)FMT 能觸發(fā)大腸桿菌K88引起的腸黏膜自噬，減輕腸屏障損傷。家養(yǎng)動物腸道單優(yōu)勢菌的出現(xiàn)與抗生素的大量使用有著極大的關(guān)系。隨著有益菌群在生長和免疫方面的作用得到進一步的確定，在畜禽生產(chǎn)中利用FMT 進行益生菌移植來替代抗生素和生長促進劑將成為可能。

目前，關(guān)于艱難梭菌相關(guān)疾?。–lostridioides difficile-associated disease，CDAD）的研究大部分都是在人類上，對于動物源性艱難梭菌（Clostridioides difficile，C-diff）的研究較少，但C-diff 是一種公認(rèn)的導(dǎo)致初生仔豬腸炎的病原體之一，歐美和其他國家C-diff 在初生仔豬中檢出率非常高（根據(jù)毒素檢測呈陽性），在CDAD 中若僅考慮CDI 的直接影響，仔豬病死率可能較低，所以并沒有引起人們的重點關(guān)注。但在受感染的畜舍中無臨床癥狀的仔豬也可發(fā)現(xiàn)C-diff 及其毒素，對于缺乏護理的母豬C-diff 常常導(dǎo)致無乳癥。在FMT 治療人CDI非常有效的背景下，可以利用FMT來治療豬只的CDI，以減少CDI 的發(fā)病率，同時利用仔豬還可以為人類CDAD 的各個方面提供適當(dāng)?shù)哪Ｐ汀?/p>

除了在動物性疾病治療中的潛力外，F(xiàn)MT 在預(yù)防動物腹瀉和提高動物自身免疫力方面的用途也同樣值得重點關(guān)注。目前我國的豬病預(yù)防與治療過分地依賴疫苗和藥物，從而導(dǎo)致豬群長期處于亞健康狀態(tài)，豬病發(fā)生在很大程度上并不是由病原微生物引起的，而是與其自身免疫力下降有著巨大關(guān)系，增強豬只自身的免疫系統(tǒng)對于現(xiàn)代的養(yǎng)豬生產(chǎn)極為重要。豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）與豬圓環(huán)病毒2 型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是豬場常見的兩種導(dǎo)致豬免疫抑制的病毒，PRRSV 與PCV2的混合感染對全球豬肉生產(chǎn)造成了重大經(jīng)濟損失。最新的研究還表明，F(xiàn)MT 可以作為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾 ?。╬orcine circovirus associated disease，PCVAD）的預(yù)防工具，接受FMT 的豬只PCVAD 相關(guān)臨床癥狀減少，豬生殖與呼吸綜合癥病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）和豬圓環(huán)病毒2 型（porcine circovirus type 2，PCV-2）病毒復(fù)制減少，體重增加，兩種疾病的抗體數(shù)量增加。可見，腸道微生物和糞便微生物移植是用于改善豬只健康并預(yù)防疾病的潛在方法。

2.2 豬FMT 技術(shù)方法與標(biāo)準(zhǔn)化

腸道微生物組的構(gòu)成受多種因素的共同作用，但宿主遺傳背景在其中的影響程度一直不明確。近日，Rothschild 等研究證明腸道微生物組沒有顯著的家族遺傳傾向，宿主遺傳背景在決定微生物組的組成方面影響甚微。共同生活在一起但沒有親緣關(guān)系的人群，微生物群落的組成卻具有高度相似性，飲食和地理環(huán)境是決定微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的兩個主要因素。在不用考慮宿主遺傳背景的影響下利用FMT 來改善仔豬腸道菌群組成，生產(chǎn)中可以使用標(biāo)準(zhǔn)化的FMT 流程進行移植，這將使得降低在商品化飼養(yǎng)條件下仔豬疾病的發(fā)生和促進生長變得易行有效。在目前的研究與應(yīng)用中，對于FMT 的具體操作過程尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，制定相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或操作規(guī)程將對FMT 的開展和廣泛應(yīng)用產(chǎn)生巨大的推動作用。菌群移植主要涉及到供體篩選、糞便處理、受體準(zhǔn)備、移植介入方式、移植次數(shù)等過程。FMT 首選移植介入方式仍在探索階段，上消化道可以通過口服膠囊、口服糞便菌液或鼻十二指腸管；下消化道可以通過結(jié)腸鏡、灌腸等方法進行糞便微生物移植。在豬生產(chǎn)中實施FMT 技術(shù)，從實際的可操作性首先應(yīng)當(dāng)考慮采取糞便菌液添加于日糧中進行飼喂或口腔直接灌服的方式。建議參考Hamilton 等人研究制定豬FMT 糞便菌液標(biāo)準(zhǔn)化的制備方法，稱取供體豬糞便（從大便中間取樣，供體糞便最好為6 h內(nèi)）于合適的無菌容器，加入無菌生理鹽水，為了保護厭氧菌需要在充滿氮氣的生物專用柜中進行糞樣勻漿，然后使用不同規(guī)格的實驗篩逐次過濾糞液，以除去未消化的食物殘渣和顆粒物質(zhì)，將濾液在低溫離心機中離心，棄去上清，對沉淀使用無菌生理鹽水重懸制成糞便菌液，制備好的糞便菌液可以直接進行移植。如進行糞便菌液進行凍存，需添加10%無菌甘油，然后-80℃凍存24 h 后，浸入液氮中進行長期保存，為了保證糞便中微生物的活性，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。糞便菌液的復(fù)蘇要在FMT 灌注的當(dāng)天進行，糞便菌液在37℃水浴中快速解凍，且在解凍開始后6 h 內(nèi)進行移植。

2.3 建立豬糞便銀行

使用FMT 技術(shù)的同時存在著傳播疾病的風(fēng)險，特別是像非洲豬瘟等烈性傳染病，一旦暴發(fā)將對養(yǎng)豬業(yè)造成災(zāi)難性的后果。豬糞便銀行的建立讓糞液質(zhì)量控制和移植全程追溯成為可能，從而對FMT 技術(shù)的安全性提供保障。豬場在進行FMT 后若產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，糞便銀行也可提供緊急救助，更為重要的是糞便銀行數(shù)據(jù)庫可以采集所有接受FMT 技術(shù)養(yǎng)殖場的使用數(shù)據(jù)，從而進行更深層次的試驗研究，如在菌株水平進行追蹤分析，將某些可預(yù)防仔豬腹瀉的特定菌株鑒定出來，發(fā)現(xiàn)特定腸道微生物與宿主互作的關(guān)系，同時為利用益生菌替代抗生素來預(yù)防動物腹瀉提供可靠依據(jù)。

豬糞便銀行可以在科研機構(gòu)、地方政府或國家督導(dǎo)等層面上運作。糞便庫的主要目的是提供預(yù)先篩選出來源明確、高質(zhì)量、隨時可用的供體糞便懸浮液，從而使FMT治療變得安全、簡單、經(jīng)濟。冷凍糞便是標(biāo)準(zhǔn)化FMT 流程和按需求提供糞便的最佳方法，根據(jù)Lee 研究結(jié)果顯示，使用標(biāo)準(zhǔn)化冷凍糞便與使用新鮮糞便在治療CDI 的病例時效果無統(tǒng)計學(xué)差異，因此建立豬糞便銀行并使用標(biāo)準(zhǔn)化冷凍糞便菌液進行FMT 在豬生產(chǎn)中具有可行性。豬糞便銀行工作流程如圖2 所示。

圖2 豬糞便銀行運行流程圖

3 小結(jié)

FMT 在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的成功應(yīng)用為其在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了很好的啟示和指導(dǎo)，反之，F(xiàn)MT 在人類醫(yī)學(xué)上的大規(guī)模應(yīng)用還需要大量的臨床試驗去確保安全性，而在養(yǎng)豬生產(chǎn)領(lǐng)域上的研究和應(yīng)用將成為推進FMT 在人類醫(yī)學(xué)應(yīng)用的催化劑。隨著豬標(biāo)準(zhǔn)化FMT 方案的制定，同時針對每個單獨的適應(yīng)癥對FMT 方案進行標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)化，以證明針對特定疾病微生物發(fā)揮靶向治療的潛力，將使人們可以更好地理解FMT 治療的機制。糞便銀行對供體的安全性和移植結(jié)果進行統(tǒng)一控制，對FMT 的長期安全性有了保障。相信未來通過對腸道菌群的深入了解，并不斷完善FMT 技術(shù)，將對人類醫(yī)學(xué)和生豬健康養(yǎng)殖都具有重要意義和推動作用。