基于銅死亡相關(guān)lncRNA構(gòu)建乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型

張慶雪，趙碩，張瑩瑩，高東程，李靖若

1 鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院乳腺外科，鄭州 450052；2 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科

目前女性乳腺癌已超過(guò)肺癌成為2020 年全球發(fā)病率最高的癌癥，發(fā)病人數(shù)占所有新發(fā)癌癥患者的11.7%，同時(shí)，死亡人數(shù)占所有癌癥死亡患者的6.9%，是導(dǎo)致全球女性死亡人數(shù)最多的癌癥［1］。隨著手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療、靶向治療以及免疫治療等多種治療策略的快速發(fā)展，女性乳腺癌患者的平均五年生存率達(dá)到了91%［2］，但耐藥和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致乳腺癌患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素［3］。乳腺癌是一種高度異質(zhì)性疾病，根據(jù)雌激素受體、孕激素受體、人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER-2）及細(xì)胞增殖指數(shù)ki-67 的表達(dá)水平，可分為L(zhǎng)uminal A型、Luminal B 型、HER-2 陽(yáng)性及三陰性乳腺癌四種類型［4-5］，具有相同臨床分期和病理分型的患者預(yù)后也可能存在較大差異［6］。目前，21 基因檢測(cè)［7］、70 基因檢測(cè)［8］、7 基因乳腺癌指數(shù)［9］、50 基因復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［10］和12 基因檢測(cè)［11］等多基因檢測(cè)僅適用于激素受體陽(yáng)性、HER-2陰性的早期乳腺癌患者，臨床暫無(wú)用于預(yù)測(cè)其他類型乳腺癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)模型。因此，迫切需要開發(fā)新的預(yù)測(cè)方法，為乳腺癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)和個(gè)體化抗癌治療提供指導(dǎo)。

銅是所有生物體必需的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)素，與能量代謝、活性氧解毒、鐵攝取和信號(hào)傳導(dǎo)等多種生物過(guò)程相關(guān)［12］。研究［13］顯示，腫瘤對(duì)銅的需求更高，銅通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移參與多種腫瘤的進(jìn)展，然而過(guò)量的銅可能會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞銅死亡［14］。銅死亡是一種由TSVETKOV 等［15］于2022 年發(fā)現(xiàn)的新型調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡，不同于凋亡、壞死和鐵死亡等已知細(xì)胞死亡形式，它依賴于銅積累和線粒體呼吸。銅與三羧酸循環(huán)的酯?；煞种苯咏Y(jié)合，誘導(dǎo)酯酰化蛋白質(zhì)聚集及鐵硫簇蛋白質(zhì)丟失，從而誘發(fā)蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞死亡［15］。因此，誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生銅死亡在抗癌治療中具有巨大潛力。長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸（lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò) 200 個(gè)核苷酸的線性非編碼RNA［16］，通過(guò)在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及表觀遺傳學(xué)水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、干細(xì)胞重編程及腫瘤發(fā)生或耐藥等多種病理生理過(guò)程［17］。RNA 療法可以通過(guò)增加或沉默特定蛋白質(zhì)的表達(dá)調(diào)節(jié)靶細(xì)胞，在乳腺癌治療中具有高選擇性和低脫靶風(fēng)險(xiǎn)［18］。目前，銅死亡相關(guān)lncRNA在乳腺癌中的研究尚不全面，篩選銅死亡相關(guān)lncRNA，并構(gòu)建乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型有助于實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)抗癌治療。本研究篩選出與乳腺癌預(yù)后關(guān)系密切的銅死亡相關(guān)lncRNA，基于銅死亡相關(guān)lncRNAs 構(gòu)建了乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型，并驗(yàn)證了其效能。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)及其來(lái)源 從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載女性乳腺癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床信息，截至2023 年2月17 日。共下載1 105 例乳腺癌樣本和112 例正常乳腺樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。使用Perl 軟件（版本5.32.1）對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、ID 轉(zhuǎn)換，并分離mRNA 和lncRNA 表達(dá)譜，獲得19 962 個(gè)mRNAs和16 901 個(gè)lncRNAs。從已發(fā)表文獻(xiàn)中獲取銅死亡相關(guān)基因［15，19-22］，共19 個(gè)，分別為NFE2L2、NLRP3、ATP7B、ATP7A、SLC31A1、FDX1、LIAS、LIPT1、LIPT 2、DLD、DLAT、PDHA1、PDHB、MTF1、GLS、CDKN2A、DBT、GCSH、DLST。TCGA 為公開可用的數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究遵循TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的訪問(wèn)政策和出版指南，故無(wú)需倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 乳腺癌預(yù)后關(guān)系密切的銅死亡相關(guān)lncRNA篩選及預(yù)后預(yù)測(cè)模型構(gòu)建 ①乳腺癌組織中銅死亡相關(guān)lncRNA 篩選：使用R 軟件（版本4.1.2）的R 包“l(fā)imma”對(duì)mRNA 表達(dá)譜和19 個(gè)銅死亡相關(guān)基因取交集，獲取乳腺癌組織中表達(dá)的銅死亡相關(guān)基因。進(jìn)一步采用Pearson 相關(guān)性分析乳腺癌組織中表達(dá)的銅死亡相關(guān)基因與lncRNA 的相關(guān)性，以|r|>0.4和P<0.001為標(biāo)準(zhǔn)篩選出乳腺癌組織中的銅死亡相關(guān)lncRNA，并使用R 包“dplyr”、“ggalluvial”和“ggplot2”繪制?；鶊D。②乳腺癌組織中與預(yù)后關(guān)系密切的銅死亡相關(guān)lncRNA 篩選：選擇銅死亡相關(guān)lncRNA 表達(dá)譜與臨床資料均完整的患者885例（整體組），用R 包“caret”的“createDataPartition”函數(shù)按照1∶1 的比例將整體組患者隨機(jī)分為訓(xùn)練組443 例與驗(yàn)證組442 例，并使用χ2檢驗(yàn)分析組間臨床資料（包括生存時(shí)間、生存狀態(tài)、年齡、臨床分期及T、N、M 分期）差異。在訓(xùn)練組中，使用R 包“survival”進(jìn)行單因素Cox 回歸分析初步篩選與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)的銅死亡相關(guān)lncRNA，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。為避免lncRNA 的過(guò)度擬合，使用R 包“survival”和“glmnet”進(jìn)行最小絕對(duì)收縮和選擇算子（LASSO）回歸進(jìn)一步篩選預(yù)后關(guān)系密切的銅死亡相關(guān)lncRNA。隨后，使用R 包“survival”和“survminer”進(jìn)行多因素Cox 回歸分析。③乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建：根據(jù)赤池信息準(zhǔn)則（AIC）確定最佳預(yù)后預(yù)測(cè)模型（AIC值最?。ＤＰ凸饺缦拢?/p>

其中n表示納入模型的lncRNA 數(shù)量，coefi為各lncRNA的回歸系數(shù)，Xi為各lncRNA的表達(dá)量。

1.3 乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的效能驗(yàn)證 根據(jù)乳腺癌的預(yù)后預(yù)測(cè)模型，計(jì)算訓(xùn)練組患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。以訓(xùn)練組患者的中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分作為截?cái)嘀?，將?xùn)練組、驗(yàn)證組和整體組的患者分別劃分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。 乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的區(qū)分能力驗(yàn)證：分別在訓(xùn)練組、驗(yàn)證組和整體組中使用R 包“survival”和“survminer”進(jìn)行生存分析，繪制生存曲線，比較高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存率；將整體組患者按不同臨床特征分為亞組，使用R 包“survival”和“survminer”繪制生存曲線并比較不同亞組中高、低風(fēng)險(xiǎn)患者的生存率差異。乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性驗(yàn)證：使用R 包“timeROC”繪制ROC，并計(jì)算曲線下面積（AUC）評(píng)估預(yù)后預(yù)測(cè)模型對(duì)乳腺癌患者1、3、5 年生存率的預(yù)測(cè)效能。在整體組中，使用R 包“timeROC”、“rms”和“pec”繪制風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分及臨床特征的多指標(biāo)ROC 及一致性指數(shù)曲線比較不同指標(biāo)的預(yù)測(cè)性能。乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的獨(dú)立性驗(yàn)證：使用R包“survival”對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分及各臨床特征進(jìn)行單因素及多因素 Cox 回歸分析評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是否是乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。臨床實(shí)用性驗(yàn)證： 高、低風(fēng)險(xiǎn)組間差異表達(dá)基因本體功能及信號(hào)通路富集分析；高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者免疫浸潤(rùn)分析。

高、低風(fēng)險(xiǎn)組間差異表達(dá)基因本體功能及信號(hào)通路富集分析：使用R 包“l(fā)imma”篩選高、低風(fēng)險(xiǎn)組間差異表達(dá)的基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2差異倍數(shù)|>1，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率<0.05。使用R 包“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”和“enrichplot”進(jìn)行京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析識(shí)別差異表達(dá)的基因主要參與的信號(hào)通路，進(jìn)行基因本體功能（GO）分析差異表達(dá)的基因主要涉及的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能，P<0.05和校正后的P值<1被認(rèn)為顯著富集。使用R包“ggplot2”將富集結(jié)果可視化。

高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者免疫浸潤(rùn)分析：使用R 包“estimate”進(jìn)行ESTIMATE 算法計(jì)算乳腺癌患者的免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、腫瘤純度及綜合評(píng)分［23］，使用R 包“l(fā)imma”和“ggpubr” 進(jìn)行Wilcoxon 檢驗(yàn)比較高、低風(fēng)險(xiǎn)組間差異。對(duì)患者的表達(dá)譜進(jìn)行歸一化校正，利用CIBERSORT 算法計(jì)算兩組患者免疫細(xì)胞的相對(duì)浸潤(rùn)豐度［24］，采用Wilcoxon檢驗(yàn)比較組間差異。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型 Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示乳腺癌組織中銅死亡相關(guān)lncRNAs 719 個(gè)。訓(xùn)練組（n=443）和驗(yàn)證組（n=442）臨床特征比較，P均>0.05，見(jiàn)表1，說(shuō)明兩組基線資料均衡可比。在訓(xùn)練組中，單因素Cox 回歸分析初步篩選出17 個(gè)與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)的銅死亡相關(guān)lncRNAs，包括7個(gè)保護(hù)lncRNAs［風(fēng)險(xiǎn)比（HR）<1］和10 個(gè)危險(xiǎn)lncRNAs（HR>1）；LASSO回歸分析進(jìn)一步確定了14個(gè)與乳腺癌預(yù)后關(guān)系密切的銅死亡相關(guān)lncRNAs。采用多因素Cox 回歸分析最后構(gòu)建了由10 個(gè)lncRNAs組成的乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型，模型公式如下：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（-1.129 216 501 573 150×AKT3.IT1 表達(dá)量） +（-1.166 095 685 256 72×AL137847.1 表 達(dá) 量） +（0.729 804 497 137 164×LINC02043 表 達(dá) 量） +（0.745 696 645 441 295×AL683813.1 表 達(dá) 量） +（-0.903 562 388 041 113×AL807757.2 表達(dá)量） +（1.040 608 675 397 110×AC073127.1 表 達(dá) 量） +（2.160 133 554 898 460×MFF.DT 表 達(dá) 量） +（1.417 144 256 517 410×AC091588.1 表 達(dá) 量） +（-0.764 700 719 748 750×AC079766.1 表達(dá)量） +（-3.608 177 447 126 010×AL451123.1 表達(dá)量）。

表1 各組臨床病理特征

2.2 乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的效能驗(yàn)證結(jié)果 根據(jù)乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型公式，訓(xùn)練組患者的中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為1.066，根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。生存曲線顯示在訓(xùn)練組、驗(yàn)證組和整體組中，高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者的總體生存率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），且高風(fēng)險(xiǎn)組患者預(yù)后較差，見(jiàn)圖1~3。亞組分析顯示不同年齡、臨床分期、T、N 和M0 分期亞組中高風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存率均低于低風(fēng)險(xiǎn)組（T3-4 亞組P=0.003，其余P均<0.001）（圖4、5、6、7 及圖8 的M0 分期），M1 分期亞組中高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.139）（圖8）。

圖1 訓(xùn)練組高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者總生存率的生存曲線

圖2 驗(yàn)證組高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存曲線

圖3 整體組高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存曲線

圖4 不同年齡亞組中高低風(fēng)險(xiǎn)組的生存曲線

圖5 不同臨床分期亞組中高低風(fēng)險(xiǎn)組的生存曲線

圖6 不同T分期亞組中高低風(fēng)險(xiǎn)組的生存曲線

圖7 不同N分期亞組中高低風(fēng)險(xiǎn)組的生存曲線

圖8 不同M分期亞組的生存曲線

訓(xùn)練組中，乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)乳腺癌患者1、3、5 年生存率的AUC 分別為0.848、0.783、0.793，驗(yàn)證組中分別為0.764、0.697、0.675，在整體組中分別為0.807、0.739、0.709。在整體組中，多指標(biāo)ROC（圖9）及一致性指數(shù)曲線（圖10）顯示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的AUC 值和一致性指數(shù)均高于其他臨床特征。

圖9 整體組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分及各臨床特征的多指標(biāo)預(yù)測(cè)乳腺癌患者生存率的ROC

圖10 整體組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分及各臨床特征的一致性指數(shù)曲線

單因素COX 回歸分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與乳腺癌患 者的預(yù) 后顯著 相關(guān)［（HR（95%CI）為1.063（1.045～1.081），P<0.001］；多因素Cox回歸分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是乳腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后影響因素［（HR（95%CI）為1.065（1.047～1.082），P<0.001］。

高、低風(fēng)險(xiǎn)組間差異表達(dá)基因129 個(gè)。GO 分析顯示，差異表達(dá)基因富集于銨離子代謝過(guò)程、體液免疫反應(yīng)和內(nèi)分泌激素分泌等生物過(guò)程，血液微粒子、角蛋白絲和中間絲等細(xì)胞成分，以及氨基酸結(jié)合、免疫球蛋白結(jié)合和ATP 酶-偶聯(lián)的無(wú)機(jī)陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活動(dòng)等分子功能。KEGG 分析顯示，這些差異表達(dá)基因顯著富集于B 細(xì)胞受體信號(hào)通路、色氨酸代謝、PI3K-Akt 信號(hào)通路和鉑類耐藥性等通路。

免疫細(xì)胞評(píng)分、基質(zhì)細(xì)胞評(píng)分、腫瘤純度及綜合評(píng)分的中位數(shù)在高風(fēng)險(xiǎn)組分別為411.670、518.220、969.350、0.734，在低風(fēng)險(xiǎn)組中分別為594.006、757.348、1394.424、0.690。與低風(fēng)險(xiǎn)組比較，高風(fēng)險(xiǎn)組免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及綜合評(píng)分低，腫瘤純度高（P<0.001）。低風(fēng)險(xiǎn)組中幼稚B 細(xì)胞、靜息自然殺傷細(xì)胞、活化自然殺傷細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞浸潤(rùn)豐度較高，高風(fēng)險(xiǎn)組中M0 和M2 巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)豐度較高（P均<0.05），見(jiàn)表2。

表2 免疫細(xì)胞相對(duì)浸潤(rùn)豐度

3 討論

乳腺癌是高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，在女性癌癥中占新診斷患者的31%，占死亡患者的15%，是導(dǎo)致20～59 歲女性死亡的首要原因［25］。耐藥和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素。腫瘤的異質(zhì)性導(dǎo)致具有相同臨床病理特征的患者預(yù)后亦可能存在較大差異，迫切需要探索有效的乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者預(yù)后，以利于進(jìn)一步的臨床決策。銅死亡是一種由銅觸發(fā)的線粒體細(xì)胞死亡方式［14］。研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌［26］、黑色素瘤［27］和肝細(xì)胞癌［28］等高線粒體代謝的腫瘤可能對(duì)銅離子載體誘導(dǎo)的銅死亡更敏感［29］。雙硫侖已被證實(shí)能夠作為銅離子載體誘導(dǎo)銅死亡發(fā)生［15］，研究［30］表明其在治療乳腺癌時(shí)還可以降低腫瘤抑制基因PTEN 的表達(dá)并激活乳腺癌組織中Akt 信號(hào)傳導(dǎo)，聯(lián)合應(yīng)用PI3K 抑制劑可以顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究基于銅死亡相關(guān)lncRNA構(gòu)建乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型，旨在為乳腺癌的預(yù)后評(píng)估提供新的視角。

本研究從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得719 個(gè)銅死亡相關(guān)lncRNAs，通過(guò)多因素Cox 回歸將10 個(gè)lncRNAs納入預(yù)后預(yù)測(cè)模型，LINC02043、AL683813.1、AC073127.1，MFF.DT 和AC091588.1 是 危 險(xiǎn)lncRNAs，AKT3.IT1、AL137847.1、AL807757.2、AC079766.1 和AL451123.1 是 保 護(hù)lncRNAs，這 些lncRNAs 可能是乳腺癌的生物標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)。據(jù)研究［31］報(bào)道，LINC02043 是酒精相關(guān)性肝細(xì)胞癌的危險(xiǎn)lncRNA，與其他lncRNAs 相結(jié)合可以預(yù)測(cè)酒精相關(guān)性肝細(xì)胞癌的無(wú)復(fù)發(fā)生存期。本研究發(fā)現(xiàn)LINC02043 亦是乳腺癌的危險(xiǎn)lncRNA，與患者的預(yù)后不良相關(guān)。YU 等［32］研究提示，MFF.DT 作為危險(xiǎn)lncRNA 與其他幾種銅死亡相關(guān)lncRNAs 聯(lián)合構(gòu)成乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素，本研究結(jié)果與之相符。然而暫時(shí)沒(méi)有關(guān)于其余8 種lncRNAs 的研究報(bào)道，它們?cè)谌橄侔┲械纳飳W(xué)機(jī)制未來(lái)有必要通過(guò)進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)探索，且有望成為乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。

根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將乳腺癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分升高患者死亡率增加。生存曲線顯示無(wú)論是訓(xùn)練組、驗(yàn)證組還是整體組，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存率均更低，表明預(yù)后預(yù)測(cè)模型對(duì)不同風(fēng)險(xiǎn)的患者有較好的區(qū)分能力。ROC 顯示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)測(cè)乳腺癌患者1 年、3 年和5 年生存率的AUC 值較高，表明預(yù)后預(yù)測(cè)模型具有較強(qiáng)的預(yù)測(cè)效能，且多指標(biāo)ROC 及一致性指數(shù)曲線表明模型的預(yù)測(cè)能力和臨床應(yīng)用效能優(yōu)于其他臨床特征。獨(dú)立預(yù)后分析表明，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。亞組生存分析表明，該預(yù)后預(yù)測(cè)模型適用于不同臨床階段的乳腺癌患者。由于樣本中M1 分期的患者人數(shù)較少，高、低風(fēng)險(xiǎn)組生存率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但結(jié)果仍表現(xiàn)出高風(fēng)險(xiǎn)組患者總生存率較低的趨勢(shì)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)后預(yù)測(cè)模型的效能，我們探索了高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者之間的生物學(xué)功能差異，對(duì)兩組間差異表達(dá)的基因進(jìn)行了功能富集分析。KEGG分析表明差異表達(dá)的基因主要富集于B細(xì)胞受體信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路和鉑類耐藥性等通路。GO 分析表明差異表達(dá)的基因富集于體液免疫反應(yīng)等生物過(guò)程。GARAUD 等［33］發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤(rùn)性B 細(xì)胞可以產(chǎn)生持續(xù)的體液免疫反應(yīng)，并有助于在乳腺癌腫瘤部位產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。HARRIS等［34］在三陰性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，B 淋巴細(xì)胞具有IgG偏向的克隆擴(kuò)張，并與良好的預(yù)后相關(guān)，這可能是抗原驅(qū)動(dòng)的體液免疫反應(yīng)。PI3K-Akt 信號(hào)通路在細(xì)胞代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞凋亡和血管生成等基本細(xì)胞活動(dòng)中起主要作用［35］，大約70%的乳腺癌患者攜帶PI3K/AKT 突變［36］，從而導(dǎo)致該通路的過(guò)度激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和血管生成，是導(dǎo)致乳腺癌的內(nèi)分泌治療、靶向治療和化療耐藥性的重要機(jī)制之一［37-38］。因此，高、低風(fēng)險(xiǎn)組間的預(yù)后差異可能與乳腺癌患者的免疫狀態(tài)及化療耐藥性相關(guān)。

腫瘤微環(huán)境包括腫瘤中的所有非癌宿主細(xì)胞（如免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞）以及非細(xì)胞成分［39］，不同浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞具有抗腫瘤或促腫瘤的功能，隨著免疫逃逸的發(fā)生，免疫療法成為癌癥治療的新策略［40］。ESTIMATE 算法顯示低風(fēng)險(xiǎn)組的基質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分和綜合評(píng)分高，腫瘤純度低，表明低風(fēng)險(xiǎn)組患者的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度更高。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可以分化為兩個(gè)亞型，M1型巨噬細(xì)胞主要通過(guò)介導(dǎo)ROS誘導(dǎo)的組織損傷發(fā)揮抗腫瘤作用，而M2型巨噬細(xì)胞通過(guò)激活血管生成、免疫抑制及細(xì)胞外基質(zhì)重塑表現(xiàn)出促腫瘤活性［41-42］。免疫浸潤(rùn)分析發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險(xiǎn)組患者M(jìn)2 型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)豐度較高，可能通過(guò)M2 型巨噬細(xì)胞的促腫瘤作用導(dǎo)致癌細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸而促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展。因此，高、低風(fēng)險(xiǎn)組患者之間可能存在免疫狀態(tài)差異，且低風(fēng)險(xiǎn)組患者的免疫原性更高，更可能從免疫治療中獲益。本研究構(gòu)建的預(yù)后預(yù)測(cè)模型能夠較為準(zhǔn)確地反映乳腺癌抗腫瘤免疫狀態(tài)，為評(píng)估乳腺癌患者對(duì)免疫治療敏感性提供參考。

綜上所述，本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了由10 個(gè)銅死亡相關(guān)lncRNAs 構(gòu)成的乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型，該模型具有良好的準(zhǔn)確性、區(qū)分能力、獨(dú)立性，不僅可以有效地預(yù)測(cè)乳腺癌患者的預(yù)后，還可以評(píng)估患者的免疫浸潤(rùn)狀態(tài)，反映免疫治療敏感性，為實(shí)現(xiàn)個(gè)體化抗癌治療提供參考。本研究也存在一定的局限性。首先，由于其他數(shù)據(jù)庫(kù)中缺乏完整的lncRNA 表達(dá)譜或臨床信息，本研究采用了內(nèi)部驗(yàn)證的方法，未來(lái)仍有必要基于獨(dú)立的外部數(shù)據(jù)集來(lái)驗(yàn)證乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型的有效性。此外，本研究在生物信息學(xué)層面分析了銅死亡相關(guān)lncRNAs 對(duì)乳腺癌患者預(yù)后的影響，未來(lái)需要通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步探索銅死亡相關(guān)lncRNAs 在乳腺癌中的病理生理功能。