刺葡萄與歐美雜交種葡萄“夏黑”幼葉花色苷比較分析

陶慧慧,付鵬鴻,陳 錢,王斯妤,張 萌,楊思潮,胡新龍

(1 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所,南昌,330200;2 江西省撫州市南城縣農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究中心,江西撫州,347000 )

花青素(又叫花色素)是具有3-羥基色原烯結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物,是苯丙氨酸代謝途徑中產(chǎn)生的重要代謝產(chǎn)物,賦予植物器官組織從桔紅色到藍(lán)紫色等不同色澤,并在植物應(yīng)對(duì)紫外線損傷、抗逆脅迫及吸引昆蟲授粉等方面扮演重要作用[1-3]。常見(jiàn)花色素可分為6類:天竺葵素(Pelargonidin,Pg)、矢車菊色素(Cyamdin,Cy)、飛燕草素(Delphinidin,Dp)、芍藥素(Peonidin,Pn)、牽牛素(Petunidin,Pt)及錦葵素(Malvidin,Mv)[4]。不同花色素具不同色澤,在不同環(huán)境條件下穩(wěn)定性不一,在自然界中通常以糖苷鍵與糖類結(jié)合形成花色苷而穩(wěn)定存在[5]。天竺葵素主要呈現(xiàn)為紅色,在pH值<2時(shí)穩(wěn)定存在;矢車菊素和芍藥素常為洋紅色,飛燕草素、牽牛素和錦葵素為紫色,在68條件下分別以無(wú)色的碳醇甲基和查爾酮形式存在,分別呈現(xiàn)為無(wú)色和亮黃色[6-7]。長(zhǎng)期攝入花色苷含量豐富的植物產(chǎn)品,對(duì)抗癌、預(yù)防心血管疾病、維持血糖平衡具有積極效應(yīng)[8-9]。因此,花色苷作為植物重要外觀品質(zhì)組成及營(yíng)養(yǎng)保健功能性成分,廣受研究者的熱愛(ài)與關(guān)注[3,6,10-11]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2022年進(jìn)行試驗(yàn)。刺葡萄和“夏黑”葡萄材料取自江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所內(nèi)葡萄園?！跋暮凇逼咸押痛唐咸丫鶠?年生自根苗,株行距2.3 m×3.8 m,雙十字架低干小“V”形葉幕,栽培管理措施一致。刺葡萄和“夏黑”葡萄幼嫩葉片于3月22日取得。每種材料各取3個(gè)生物學(xué)重復(fù),帶回實(shí)驗(yàn)室后液氮速凍保存,送至武漢邁維代謝生物有限公司進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 花色苷提取 利用球磨儀將幼葉材料研磨(30 Hz,1.5 min)至粉末狀,稱取50 mg粉末,加入500 μL提取液(50%甲醇水溶液,含0.1%鹽酸),渦旋5 min,超聲5 min,離心3 min(12 000 轉(zhuǎn)/min,4 ℃),吸取上清液,沉淀再重復(fù)提取1次。合并兩次上清液,用微孔濾膜(0.22 μm pore size)過(guò)濾后,保存于進(jìn)樣瓶中,用于LC-MS/MS分析[16]?；ㄉ蘸繛闇y(cè)得的6類花色苷含量總和。

1.2.2 花色苷類物質(zhì)色譜檢測(cè)分離 使用WatersTMACQUITY UPLC-PDA檢測(cè)器分離花色苷。色譜柱為BEH C18[2.1 mm(內(nèi)徑)×100 mm,粒徑1.7 μm],柱溫40 ℃;進(jìn)樣量2 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm。流動(dòng)相A為超純水(加入0.1%甲酸),B相為甲醇(加入0.1%甲酸),流速0.35 mL/min。洗脫梯度(以B相體積占比計(jì)):0～6 min為5%～50%,6～12 min為50%～95%,保持2 min,14 min降至5%,并平衡2 min[16]。

1.2.3 花色苷定性和定量檢測(cè) 基于標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建MWDB(Metware Database)數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(Electrospray Ionization,ESI)溫度550 ℃,正離子模式下質(zhì)譜電壓5 500 V,氣簾氣(Curtain Gas,CUR)241.32 kPa(35 psi)。在Q-TrapTM6500+質(zhì)譜系統(tǒng)中,每個(gè)離子對(duì)根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓(Declustering Potential,DP)和碰撞能(Collision Energy,CE)進(jìn)行掃描檢測(cè)[17-18]。

定量是利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(Multiple Reaction Monitoring,MRM)分析完成。供試標(biāo)準(zhǔn)品詳見(jiàn)表1,均分別配制成濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500、10 00、2 000、5 000 ng/mL溶液。獲取各個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)質(zhì)譜峰強(qiáng)度數(shù)據(jù),以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(Concentration)為橫坐標(biāo),峰面積(Area)為縱坐標(biāo),繪制不同物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將檢測(cè)到的樣本檢測(cè)液積分峰面積代入相應(yīng)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程進(jìn)行計(jì)算,獲得樣本檢測(cè)液中某物質(zhì)的濃度(c),再計(jì)算樣本中某物質(zhì)的含量。計(jì)算式:樣本某代謝物含量(μg/g)= (cV/m)×10-6[17-18]。式中,c為樣本檢測(cè)液中某物質(zhì)濃度(ng/mL),V為提取時(shí)所用溶液體積(μL),m為稱取的樣本質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件進(jìn)行方差及顯著性(α=0.05)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄幼葉花色苷含量及組成

從表2可看出,刺葡萄幼葉總花色苷、錦葵素類、矢車菊素類、芍藥素類和天竺葵素類花色苷含量均顯著高于夏黑葡萄幼葉,飛燕草素類和牽牛素類花色苷含量顯著低于夏黑葡萄幼葉。在刺葡萄幼葉總花色苷中,芍藥素類、矢車菊素類、錦葵素類、牽牛素類、天竺葵素類和飛燕草素類花色苷的占比分別為74.21%、12.33%、11.61%、1.55%、0.21%和0.08%;在夏黑葡萄幼葉總花色苷中,芍藥素類、矢車菊素類、牽牛素類、錦葵素類、飛燕草素類和天竺葵素類花色苷占比分別為41.86%、36.52%、11.83%、6.46%、3.15%和0.18%?？梢?jiàn),與刺葡萄幼葉相比,夏黑葡萄幼葉花色素的組成更加均衡。

表2 刺葡萄和夏黑葡萄幼葉樣品各類花色苷含量 μg/g

2.2 葡萄幼葉前8單體花色苷組成及含量

在測(cè)得的所有單體花色苷中,取含量排名前8的單體花色苷進(jìn)行比較分析。發(fā)現(xiàn),刺葡萄幼葉主要的單體花色苷包括芍藥花素-3,5-O-二葡萄糖苷、錦葵素-3,5-O-二葡萄糖苷和芍藥花素-3-O-葡萄糖苷等,含量分別為2 219.81、307.66和171.72 μg/g。夏黑葡萄幼葉主要單體花色苷為芍藥花素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、芍藥花素-3,5-O-二葡萄糖苷等,含量分別為122.40、102.66、56.68 μg/g。在含量前3的單體花色苷中,錦葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷是刺葡萄幼葉的的特異組分,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷是夏黑葡萄幼葉的特異組分(見(jiàn)圖1)。

圖1 刺葡萄和夏黑葡萄幼葉樣品含量排名前8的單體花色苷組成及含量

2.3 葡萄幼葉不同糖類花色苷種類及含量

由表3可知,夏黑葡萄幼葉花色苷種類數(shù)比刺葡萄幼葉多。在花色苷組成含量上,刺葡萄嫩葉以二葡萄糖花色苷為主,夏黑葡萄嫩葉以單糖花色苷為主(見(jiàn)表3)。

2.4 葡萄幼葉不同修飾成分花色苷含量

在測(cè)定的花色苷中,刺葡萄幼葉被修飾花色苷比例(91.12%)高于夏黑葡萄幼葉(73.65%)。甲基化是主修飾類型,其次為香豆?；?乙酰化和丙二?；揎棻壤^小(見(jiàn)表4)。

表4 刺葡萄和夏黑葡萄幼葉樣品不同修飾成分花色苷含量及比例

3 討論與結(jié)論

作為植物的一類重要次生代謝產(chǎn)物,花色苷廣泛存在于植物葉、花及果實(shí)等組織中,不同組織間花色苷組成和含量存在明顯差異,總體表現(xiàn)為果皮高于葉子、葉子高于種子、種子高于果肉[10]。刺葡萄從幼葉到成熟葉片,相繼經(jīng)歷了從紅變綠整個(gè)過(guò)程[19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),“夏黑”葡萄和刺葡萄幼葉早期呈現(xiàn)紅色,其顯紅色的主要原因是芍藥花素類衍生物的積累;其中,刺葡萄幼葉花色苷含量顯著高于夏黑葡萄幼葉。

花色素由于結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性,常會(huì)通過(guò)分子修飾形成穩(wěn)定物質(zhì)。常見(jiàn)的修飾類型包括糖基化、甲基化、?；⑾愣辊；取；ㄉ氐奶腔图谆诡伾t,而?；淖儾ㄩL(zhǎng)吸收最大值,使顏色更藍(lán)。其中,花青素類花色苷(包括矢車菊色素類和芍藥花素類花色苷)衍生物含量越高,果實(shí)紅色至紫紅色色調(diào)越強(qiáng);花翠素類花色苷(包括飛燕草素類、牽牛素類和錦葵素類花色苷)衍生物含量越高,果實(shí)的藍(lán)紫色調(diào)越強(qiáng)[20-22]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),呈紫紅色調(diào)的刺葡萄嫩葉與夏黑葡萄嫩葉花色苷主要成分為芍藥花素類衍生物。其中,紫色調(diào)明顯的刺葡萄幼葉含有錦葵素類衍生物,以二葡萄糖苷為主,修飾程度大于夏黑葡萄幼葉;呈紅色調(diào)的夏黑葡萄幼葉含有矢車菊素類衍生物,以單葡萄糖苷為主。這也說(shuō)明了野生資源刺葡萄幼葉花色苷以二葡萄糖苷為主,與果皮一致[15,23]。刺葡萄幼葉明顯的紫色調(diào)和夏黑葡萄幼葉紅色調(diào)分別是因?yàn)殄\葵素類衍生物和矢車菊素類衍生物的特殊積累。

植物色素不僅在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用,對(duì)人體營(yíng)養(yǎng)保健也具一定功效。由于植物色素的不穩(wěn)定性,其作為天然色素在食品染色工業(yè)中的開(kāi)發(fā)與利用也受到限制[24]。葡萄作為我國(guó)重要果樹種類,其果皮花色苷的研究報(bào)道已有很多,但關(guān)于幼葉花色苷的研究甚少[24-25]。楊臘等[26]利用3種不同的刺葡萄葉片(嫩尖、黃綠色幼葉、紅褐色幼葉)制葉茶的研究表明,紅褐色幼葉更具葉茶開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)刺葡萄幼葉和夏黑葡萄幼葉進(jìn)行定性定量分析的結(jié)果表明,花色苷總含量(以幼葉鮮質(zhì)量計(jì))分別為3 452.16和565.17 μg/g;刺葡萄幼葉中含量最高的花色苷為芍藥花素-3,5-O-二葡萄糖苷;夏黑葡萄幼葉含量最高的花色苷為芍藥花素-3-O-葡萄糖苷。可見(jiàn),刺葡萄幼葉花色苷含量高,具有很大的開(kāi)發(fā)利用前景,值得我們深入探究。