一株望天樹根際高效解磷細菌解磷能力的研究

田 湘，韓小美，黃平升，李萬年，楊欽潮，楊 梅

（1.廣西南寧良鳳江國家森林公園，南寧 530004，2.廣西大學林學院，南寧 530004）

磷元素對植物生長具有重要影響，其在植物的光合作用、呼吸作用等方面均發(fā)揮著重要的作用，同時還能夠促進植物根系的發(fā)育，對苗木初期的生長影響較大［1］。中國南方大部分土壤呈酸性，土壤中具有較高的磷含量，但由于酸性土壤對磷有強烈固化作用，絕大多數磷是以核酸、卵磷脂、磷灰石的形式存在于土壤中，并與土壤中的Al3+、Ca2+、Fe3+等離子結合成難溶性磷化合物［2，3］，土壤中能夠被植物直接吸收利用的磷不足5%，很難滿足植物生長的需求［4］。當植物體內缺少磷元素時，植株會出現生長緩慢、根系發(fā)育遲緩、光合能力減弱、抵抗力下降等現象。

解磷菌又被稱作溶磷菌，能夠將土壤中難溶性的磷轉化成植物自身可從土壤中吸收利用的有效磷，能夠部分解決土壤有效磷低的問題，因此從土壤中篩選高效解磷菌生產生物肥料可減少土壤化肥的使用，防止土壤板結，增強土壤肥力，促進林木根系的生長［5-7］。研究發(fā)現在馬尾松根際土壤中黃褐假單胞菌溶磷效果最佳，該菌具有較大的應用潛力，可作為生物菌肥的優(yōu)良菌株［8］。徐睿等［9］在降香黃檀根際土壤中篩選到19 株解磷菌，其中有3 株菌株溶磷量在170 μg/mL 以上，同時有2 株菌株具有分泌IAA 能力。崔邢等［10］的研究發(fā)現，不同土壤條件下的巨尾桉經過根際土壤高效解磷菌處理后，其土壤中有效磷含量顯著提升?？梢姀牧帜靖低寥乐蟹蛛x、篩選解磷細菌是制備目標樹種生物菌肥、活化林地土壤難溶性磷、提高有效磷利用率的重要途徑。

望天樹（Parashorea chinensisWang Hsie.）又名擎天樹，是龍腦香科柳安屬植物，熱帶雨林標志種及瀕危樹種，國家一級重點保護野生植物［11］，云南省和廣西壯族自治區(qū)為其主要分布地區(qū)。望天樹具有很高的科學價值和經濟價值，通過前期研究及生產實踐發(fā)現，望天樹苗木在苗期時根系發(fā)育遲緩，側根發(fā)育不發(fā)達，導致苗期生長緩慢、存活率低。本試驗以望天樹人工林為研究對象，通過分離、篩選、鑒定望天樹根際高效解磷菌，探討其解磷能力，以期為望天樹苗期和幼樹根系發(fā)育遲緩、生長較慢的問題提供有效辦法，對提高望天樹人工林栽培技術和森林質量、加速廣西壯族自治區(qū)珍貴樹種基地建設和發(fā)展均具有重要的理論價值和應用前景。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試細菌菌株為解無機磷細菌洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia），編號為P4，保存于中國科學院微生物研究所。該菌株分離于廣西南寧樹木園2019 年造林的望天樹根際土壤中，通過篩選和功能評價已證實該菌株具有較好的降解無機磷特性。

1.2 培養(yǎng)基

無機磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖10.000 g，（NH4）SO40.500 g，酵母浸粉0.500 g，NaCl 0.300 g，KCl 0.300 g，MgSO4·7H2O 0.300 g，FeSO4·7H2O 0.030 g，MnSO4·H2O 0.022 g，Ca3（PO4）25.000 g，蒸 餾 水1 000 mL，pH 7.0~7.5。

無機磷固體培養(yǎng)基：瓊脂15 g，其他與液體培養(yǎng)基相同。

種子培養(yǎng)基（LB）：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，定容至1 000 mL，pH 7.0~7.5。

1.3 試驗方法

1.3.1 解磷菌解磷能力、pH 的測定 將待測菌株接種于50 mL 的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，吸取1 mL 菌液接種到1 00 mL 無機磷液體培養(yǎng)基中，以不接菌為對照，每個處理設置3 個重復，28 ℃、170 r/min 培養(yǎng)168 h，每天取樣10 mL 檢測菌液pH 和有效磷含量，用pH 計直接測定pH，將培養(yǎng)液于4 ℃下6 000 r/min離心10 min，取上清液采用鉬銻抗比色法測定菌液中有效磷含量。

1.3.2 不同溫度條件下菌株解磷量的測定 將待測菌液接種于50 mL 的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后，吸取菌液1 mL 接種到無機磷液體培養(yǎng)基中，分別置于10、15、20、25、30、35、40、45 ℃溫度下?lián)u瓶培養(yǎng)，以不接菌為對照，每個處理設3 個重復，170 r/min 培養(yǎng)168 h，采用鉬銻抗比色法測定菌液中有效磷含量。

1.3.3 不同pH 條件下菌株解磷量的測定 滅菌前將無機磷液體培養(yǎng)基初始pH 調至3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 和8.5，滅菌后吸取1 mL 培養(yǎng)24 h 的菌液接種到無機磷液體培養(yǎng)基中，以不接菌為對照，每個處理設3 個重復，170 r/min 培養(yǎng)168 h，采用鉬銻抗比色法測定菌液中有效磷含量。

1.3.4 不同碳源條件下菌株解磷量的測定 將無機磷液體培養(yǎng)基中的葡萄糖用含碳量相等的乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇替換，分裝于150 mL 三角瓶中，每瓶30 mL，121 ℃高溫滅菌20 min，不同碳源培養(yǎng)基中的接種量和搖床培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)168 h 后測定菌液中有效磷含量。

1.3.5 不同氮源條件下菌株解磷量的測定 將無機磷液體培養(yǎng)基中的硫酸銨用含氮量相等的尿素、硝酸鉀、硝酸鈉、草酸銨替換，分裝于150 mL 三角瓶中，每瓶30 mL，121 ℃高溫滅菌20 min。不同氮源培養(yǎng)基中的接種量和搖床培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)168 h后測定菌液中有效磷含量。

1.3.6 不同碳氮比（C/N）條件下菌株解磷量的測定 分別以無機磷液體培養(yǎng)基中葡萄糖和硫酸銨為碳源、氮源，將C/N 比調至40∶1、20∶1 和8∶1，分裝于150 mL 三角瓶中，每瓶30 mL，121 ℃高溫滅菌20 min。不同C/N 培養(yǎng)基中接種量和搖床培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)168 h 后測定菌液中有效磷含量。

1.3.7 不同鹽濃度條件下菌株解磷量的測定 配制NaCl 濃度為0、0.5%、1.5%、2.5%、5.0%、10.0%的無機磷液體培養(yǎng)基，分裝于150 mL 三角瓶中，每瓶30 mL，121 ℃高溫滅菌20 min。不同NaCl 濃度培養(yǎng)基中接種量和搖床培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)168 h 后測定菌液中有效磷含量。

1.4 數據處理

采用SPSS19.0 軟件對數據進行差異顯著性和相關性分析，采用Microsoft Excel 2003 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 解磷細菌P4 解磷能力和菌液pH 的動態(tài)變化

由圖1 可知，菌株P4 菌液中有效磷含量在培養(yǎng)48~72 h 時增長速率最快，說明菌株P4 在培養(yǎng)48~72 h 時解磷能力最佳，隨后在培養(yǎng)72~120 h 增長速率減小，但菌液中有效磷含量仍處于增長狀態(tài)，在培養(yǎng)120 h 時P4 有效磷含量達最高，為552.87 mg/L，120 h 后菌液中有效磷含量開始下降，在168 h 時菌液中有效磷含量降至428.48 mg/L，解磷量較120 h時降低了22.50%。在培養(yǎng)168 h 內菌株P4 菌液pH呈先下降后稍有上升的趨勢，在培養(yǎng)48~72 h 菌株菌液pH 下降最快，在培養(yǎng)120 h 時菌液pH 達最低，為4.95，120 h 后菌液pH 略微升高。

圖1 菌株P4 解磷能力和菌液pH 的動態(tài)變化

由圖2 可知，解無機磷細菌P4 解磷量與菌液pH間呈顯著的負相關關系，即解磷細菌溶解無機磷量越高，其菌液的pH 越低，說明菌株在溶解無機磷過程中會分泌酸性物質，使菌液pH 降低，進而達到溶解無機磷的效果。

圖2 菌株P4 解磷量與菌液pH 的關系

2.2 不同培養(yǎng)條件對望天樹根際解磷細菌解磷能力的影響

2.2.1 溫度對菌株P4 解磷能力的影響 溫度對微生物的生長和代謝具有重要影響，當溫度在微生物適宜的范圍內變化時，微生物生長和代謝正常且平穩(wěn)，當溫度超過適宜范圍時，微生物生長代謝緩慢甚至停滯死亡。為使菌株較好地發(fā)揮其解磷能力，本試驗對不同溫度下解磷細菌P4 解磷能力進行研究。由圖3 可知，菌株P4 在30 ℃時菌液中有效磷含量最高，為552.87 mg/L，其次為25 ℃和35 ℃有效磷含量，分別為472.68 mg/L 和500.98 mg/L；在25、30、35 ℃時菌株P4 菌液中有效磷含量明顯高于其他溫度條件下的，說明菌株P4 的最適解磷溫度范圍為25~35 ℃且最佳解磷溫度為30 ℃。

圖3 溫度對菌株P4 解磷能力的影響

2.2.2 pH 對菌株P4 解磷能力的影響 pH 的變化會造成培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)物質離子濃度發(fā)生變化，從而間接影響菌株從培養(yǎng)液中吸收營養(yǎng)物質，同時pH 還會影響酶活性，菌株體內的所有代謝過程都需要酶的參與，pH 通過影響酶活性進而間接影響菌株體內的代謝過程，從而說明了pH 的變化對菌株的生長和繁殖具有重要影響。

由圖4 可知，解無機磷細菌P4 在不同pH 條件下解磷能力不同，pH 為3.5 時菌株P4 表現為較低的解磷能力，說明菌株在強酸環(huán)境下不利于其生長，同時也不利于其發(fā)揮解磷能力，隨著pH 的升高，菌株菌液中有效磷含量呈先升高后降低的趨勢，在pH 為6.5 時菌液中有效磷含量最高，為551.83 mg/L，說明在弱酸環(huán)境下菌株P4 的解磷能力較強。

圖4 pH 對菌株P4 解磷能力的影響

2.2.3 碳源對菌株P4 解磷能力的影響 組成生物細胞最基本的元素是碳源，生物體內的各種代謝活動均離不開碳源，同時碳源也是細胞內物質儲藏的主要原料。本研究選取5 種常見的糖類碳源，分別為葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘露醇作為培養(yǎng)基的碳源，探討在5 種碳源條件下菌株P4 的解磷效果。從圖5 可以看出，不同碳源條件下，菌株P4解磷能力不同，其解磷能力大小順序為乳糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇，在以乳糖為碳源時解磷量為500.98 mg/L，顯著高于其他碳源（P<0.05），其次為葡萄糖和蔗糖，二者差異不顯著，在以甘露醇為碳源時解磷量最低，為130.54 mg/L，與乳糖相比，在以甘露醇為碳源時菌株解磷量降低了73.94%，說明菌株P4 對碳源的利用均以單糖和雙糖為主，對多糖的利用效率較低，5 種碳源中菌株P4 在以乳糖為碳源時解磷量最高，說明菌株P4 的最佳碳源為乳糖。

圖5 碳源對菌株P4 解磷能力的影響

2.2.4 氮源對菌株P4 解磷能力的影響 氮是構成微生物細胞蛋白質和核酸的主要元素。由圖6 可知，在5 種不同的氮源中，菌株P4 解磷能力大小順序為草酸銨、硫酸銨、尿素、硝酸鈉、硝酸鉀，在以草酸銨為氮源時菌株P4解磷量最高，為477.37 mg/L，其次為硫酸銨，為453.36 mg/L，在以硝酸鉀和硝酸鈉為氮源時解磷量較低，說明菌株P4 在以銨態(tài)氮為氮源時解磷效果較好，且在以草酸銨為氮源時解磷效果最好，在硝態(tài)氮為氮源時解磷效果較差。綜上可知，菌株P4 的最佳氮源為草酸銨。

圖6 氮源對菌株P4 解磷能力的影響

2.2.5 C/N 對菌株P4 解磷能力的影響 不同的C/N條件下菌株P4 的解磷能力變化如圖7 所示。由圖7可 知，菌 株P4 在C/N 為20∶1 時 解 磷 量 最 高，為526.87 mg/L，說明菌株P4 的最適C/N 為20∶1，其次為40∶1，在C/N為8∶1時解磷量最低，在C/N為20∶1時菌株解磷量是C/N 為8∶1 時解磷量的2.28 倍，說明C/N 為8∶1 的培養(yǎng)條件不利于菌株發(fā)揮其解磷能力。

圖7 C/N 對菌株P4 解磷能力的影響

2.2.6 鹽濃度對菌株P4 解磷能力的影響 由圖8可知，當NaCl 濃度達2.5%時，菌株P4 菌液仍具有較高的有效磷含量，說明在NaCl 濃度為2.5%時菌株P4 仍具有較好的耐鹽能力，當NaCl濃度繼續(xù)升高達5.0%時，P4 菌液中有效磷含量顯著降低，當NaCl 濃度達10.0%時，菌株P4 有效磷含量降至最低，由此可知菌株具有一定的最適NaCl 濃度范圍，過高濃度的NaCl會顯著抑制菌株的解磷能力。從圖8 可以看出，菌株P4 的最適NaCl濃度范圍為0~2.5%，在NaCl濃度為0.5%時解磷能力最強，菌液中有效磷含量為349.15 mg/L，說明P4 的最適鹽濃度為0.5%，在NaCl濃度為0.5% 時菌株P4 的解磷量是NaCl 濃度為10.00%時解磷量的66.85 倍。

圖8 鹽濃度對菌株P4 解磷能力的影響

3 討論

3.1 望天樹根際解磷細菌解磷能力與培養(yǎng)液pH 變化的關系

菌株P4 溶解無機磷量為24.96~552.87 mg/L，林啟美等［12］的研究發(fā)現，解磷細菌在磷礦粉（磷酸鈣）培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，菌株溶磷量最高為11.73 mg/L。從北方黑土區(qū)的美青楊林、水曲柳林、落葉松林和樟子松林4 種林地土壤中篩選的具有較強解無機磷能力的2株溶磷菌的溶磷量分別為0.90、0.18 mg/L［13］，南方紅樹林根際土壤中篩選出1株具有較強解Ca3（PO4）2能力的菌株，其溶磷量為90.95 mg/L［14］，而本研究在望天樹根際篩選的解無機磷菌株P4 的解磷能力明顯高于黑土區(qū)4 種林地土壤中解磷細菌和紅樹林根際土壤解磷能力以及林啟美等［12］的研究結果。綜合對比可知，本研究中在望天樹根際篩選的解磷菌具有較好的解磷能力，但本研究中只選擇了Ca3（PO4）2作為磷源，為了更好地篩選出解磷能力較強的菌株，在后續(xù)研究中，條件允許的情況下可增加多種無機磷源培養(yǎng)基。

本研究表明，解無機磷細菌培養(yǎng)液中的溶磷量與菌液pH 呈極顯著的負相關關系，該結論與白文娟等［15］的結果一致。已有研究發(fā)現，菌株在以無機磷Ca3（PO4）2為磷源的解磷過程中，培養(yǎng)基溶磷量與pH呈顯著負相關［16］，解磷菌在溶解無機磷的同時菌液中會有多種有機酸產生［17，18］，解磷菌分泌的主要有機酸是葡萄糖酸，其次還有乙酸、檸檬酸、乳酸等多種有機酸［19-21］，其會使菌液的pH 降低，同時與鐵、鋁、鈣、鎂等離子通過螯合作用結合，使磷酸根從難溶性磷酸鹽中溶解出來，進而使土壤中難溶性磷轉化為有效磷［22］，因此無機磷細菌培養(yǎng)液中溶磷量與pH 呈極顯著負相關。解有機磷細菌解磷機理與無機磷有所不同［23］，李文紅等［24］在對以卵磷脂為磷源篩選出的解有機磷菌株菌液pH 的測定時發(fā)現，菌株在溶解有機磷過程中，其菌液pH 高于對照，說明其解磷機制不在于菌體分泌的有機酸，而是由于菌株在溶解有機磷過程中，菌體分泌了磷酸酶的作用。可見，菌株不同其解磷機制也不相同。

3.2 望天樹根際解磷細菌解磷能力與外界環(huán)境的關系

溫度和pH 是影響微生物生長和代謝的重要因素，不同菌株由于其自身的生理生化特性不同，所以其最佳解磷溫度和pH 也不同，本研究中的菌株P4在溫度為30 ℃、pH 為6.5 時解磷能力最好。孫薇等［25］在對土壤有機磷降解菌的篩選鑒定和生長特性的研究中發(fā)現，卵磷脂降解菌的最適溫度為28 ℃，最適pH 為7.5。油茶根際解無機磷細菌WB38 的最佳培養(yǎng)溫度為28 ℃，最適pH 為6.5［26］。本研究中在望天樹根際篩選的的P4 菌株的最適pH為弱酸性，而中國南方土壤大部分偏酸性，因此在后續(xù)的生產應用制備微生物菌肥時，應考慮通過調節(jié)肥料的pH 來改善林木根際環(huán)境的酸度，并考慮解磷菌發(fā)揮最佳解磷活性的環(huán)境溫度，從而充分發(fā)揮菌肥的解磷能力。

不同碳源對菌株的解磷能力影響很大，本研究從望天樹根際篩選得到解無機磷細菌P4 的最適碳源為乳糖，在碳源為甘露醇時解磷效果最差，可知菌株對單糖和雙糖具有較好的利用，對多糖的利用率較低。Banik 等［27］研究了解磷微生物在葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乙酸鈉4 種不同碳源中的解磷能力，結果發(fā)現在較短的時間內，解磷微生物在以葡萄糖為碳源時解磷效果最好，長時間內以蔗糖為碳源解磷效果最好。柯春亮等［28］研究了3 株香蕉根際具有代表性的解磷菌株B3-5-6、M-3-01 和T1-4-01 在以葡萄糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、甘油、乳糖作為碳源時的解磷能力，結果得出菌株B3-5-6、M-3-01 和T1-4-01 的最適碳源分別為蔗糖、葡萄糖和乳糖，菌株對單糖和雙糖的利用率高于多糖，與本研究結果相似。與多糖相比，菌株對單糖的利用效率更高，主要是由于糖類不同的結構所導致，多糖的結構更復雜，進而導致菌株在利用多糖時需要酶的種類和數量更多，過程更長，菌株由于復雜的細胞代謝過程進而導致生長緩慢，其相應的解磷能力也較差［23］。不同氮源對解磷菌的解磷能力影響也很大，本研究中菌株P4 在以草酸銨為氮源時解磷效果最好，說明菌株P4 在以銨態(tài)氮為氮源時解磷效果最好。Illmer等［29］在研究氮源對解磷菌金黃色青霉菌和假單胞菌溶解無機磷酸鹽能力中發(fā)現銨態(tài)氮是解磷菌株的必要氮源；劉文干等［22］從花生根際分離得到1 株溶解無機磷酸鹽菌株C5-A，對其解磷條件進行研究發(fā)現，與硝態(tài)氮和尿素相比，菌株對銨態(tài)氮的利用效果更好。趙小蓉等［30］的研究發(fā)現節(jié)桿菌1TCRi7 和1TCRi14 在以NO3-為氮源時解磷活性降低，且只有在NH4+存在時，腸桿菌1TCRi15 和歐文氏菌4TCRi22 才具有溶解磷礦粉的能力。從以上的研究可見，氮源的不同對菌株的解磷效果具有顯著的影響，以上學者研究均表明，解磷菌株在銨態(tài)氮為氮源時溶解磷酸鹽效果最好，與本研究結果一致。

4 小結

本研究以1 株來源于廣西南寧樹木園2019 年造林的望天樹根際土壤的高效解無機磷細菌P4（鑒定為洋蔥伯克霍爾德菌）為材料，對其培養(yǎng)168 h 內解磷能力和菌液pH 動態(tài)變化情況和不同環(huán)境條件下的解磷量進行研究，結果表明菌株P4 在培養(yǎng)120 h時解磷量達最高，說明培養(yǎng)120 h 為菌株P4 的最佳解磷時間；對菌株P4 解磷量和菌液pH 進行相關性分析表明，菌株P4 解磷量與培養(yǎng)液pH 間存在極顯著的負相關。不同培養(yǎng)條件研究表明，菌株P4 在溫度為30 ℃、pH為6.5、碳源為乳糖、氮源為草酸銨、C/N為20∶1、NaCl濃度為0.5%時解無機磷效果最好。