百部湯對博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的抑制作用

謝偉娜，丁 奇，孫 靜，張朝鳳，張 勉，許翔鴻

(中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，南京 211198)

肺纖維化是各種內(nèi)外致病因素引起肺臟受損后反復(fù)異常修復(fù)的結(jié)果，其病理改變主要表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞受損、肺間質(zhì)細(xì)胞大量增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積增多[1]，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[2]。發(fā)病早期以肺泡炎為主，有大量炎性細(xì)胞浸潤和多種細(xì)胞因子滲出，形成慢性肺間質(zhì)性炎癥；慢性炎癥導(dǎo)致肺成纖維細(xì)胞活化增殖，使細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積、組織結(jié)構(gòu)改變，肺組織逐漸變硬，患者肺功能受損直至呼吸衰竭[3]。近年來，由于環(huán)境惡化，間質(zhì)性肺疾病的發(fā)病率逐年增高[4]，但長期以來無藥可醫(yī)。2014年10月，美國FDA批準(zhǔn)吡非尼酮和尼達(dá)尼布用于特發(fā)性肺纖維化的治療[5]，也只能延緩肺纖維化發(fā)展的進(jìn)程。肺纖維化在中醫(yī)中多歸于“肺痿”范疇，中醫(yī)在治療“肺痿”方面具有歷史悠久的方藥和經(jīng)驗(yàn)，臨床上已顯示出獨(dú)特的治療優(yōu)勢[6]。

中藥百部為百部科植物直立百部(StemonasessilifoliaMiq.)、蔓生百部(S.japonicaMiq.)或?qū)θ~百部(S.tuberosaLour.)的干燥塊根[7]，收載于歷版《中華人民共和國藥典》，具有鎮(zhèn)咳祛痰、平喘、殺蟲等傳統(tǒng)功效，含有百部的復(fù)方制劑被廣泛應(yīng)用于治療各種慢性肺疾病如肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病等[8-9]。百部湯為載于《本草匯言》(明·倪朱謨)的治療肺痿的古方，其組成為百部、薏苡仁、百合、麥門冬各三錢，桑白皮、白茯苓、沙參、黃耆、地骨皮各一錢五分，用于治療久嗽不已、咳吐痰涎、重亡津液、漸成肺痿。由于對葉百部分布較廣，蘊(yùn)藏量和產(chǎn)量均較高，已成為目前市場上百部的主流品種。因此，本文主要研究對葉百部為君藥組成的百部湯對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的影響。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

百部藥材樣品S1、S2分別于2014年9月購于河北安國，樣品S3于2016年11月購于廣西桂林，經(jīng)本文作者鑒定均為對葉百部S.tuberosa的干燥塊根。薏苡仁、百合、麥冬、桑白皮、茯苓、沙參、黃芪和地骨皮2016年8月購于南京頤和藥店，經(jīng)本文作者鑒定分別為薏苡Coixlacryma-jobivar.mayuenStapf.的種仁、百合Liliumbrowniivar.viridulumBaker的肉質(zhì)鱗葉、麥冬Ophiopogonjaponicus(L.f.) Ker-Gawl.的塊根、桑MorusalbaL.的根皮、茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf的菌核、珊瑚菜GlehnialittoralisFr.Schmidt ex Miq.的根、蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao的根和枸杞LyciumchinenseMill.的根皮。憑證標(biāo)本均存放于中國藥科大學(xué)生藥學(xué)研究室。注射用鹽酸博來霉素(海正輝瑞制藥有限公司)；水合氯醛(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；尼達(dá)尼布(上海煜柯化學(xué)品有限公司)；羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物工程研究所)；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

高效液相色譜：Agilent 1200分析型液相色譜。低溫高速離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、冷凍干燥機(jī)(日本Eyela公司)；酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；AL104型電子天平(上海天平儀器廠)；BX51型顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 動(dòng) 物

清潔級(jí)ICR小鼠，雄性，4～8周齡，由南京青龍山動(dòng)物繁殖場提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0001。喂養(yǎng)于中國藥科大學(xué)動(dòng)物中心。動(dòng)物于(24±2)℃分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，動(dòng)物室采用12 h光照和12 h黑暗的光暗周期，動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 百部湯的制備

稱取百部、薏苡仁、百合和麥冬各10 g，桑白皮、茯苓、沙參、黃芪和地骨皮各5 g，加8倍量水或70%乙醇回流提取1 h，濾過，藥渣再加4倍量水或70%乙醇回流提取0.5 h，濾過，合并濾液，減壓揮去溶劑，即得百部湯浸膏(BBT)。為了保證實(shí)驗(yàn)效果的可重復(fù)性和可比性，除百部樣品(S1～S3)外，其余八味藥材均為同一批次。由百部樣品S1組成的百部湯水提取物浸膏得率為22.3%；由百部樣品S1、S2、S3組成的百部湯70%乙醇提物浸膏得率分別為19.7%、18.5%和17.8%。將浸膏混懸于CMC-Na制成0.5 g/mL(生藥量)的溶液，即浸膏濃度分別為112 mg/mL(S1-BBT水提物)、99 mg/mL(S1-BBT醇提物)、93 mg/mL(S2-BBT醇提物)和89 mg/mL(S3-BBT醇提物)，備用。

2.2 模型制備及給藥方法

小鼠腹腔注射4%水合氯醛(10 mL/kg)麻醉，仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙向氣管內(nèi)緩慢注入生理鹽水溶液(假手術(shù)組，Sham)或博來霉素溶液(3.5 mg/kg)。注射后迅速將小鼠直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布。造模后第1天(預(yù)防給藥)或第8天(治療給藥)開始，連續(xù)14 d每天1次灌胃給予BBT(5 g/kg，生藥量)，以尼達(dá)尼布(30 mg/kg)為陽性對照，假手術(shù)組和模型組給予等量CMC-Na溶液；給藥體積為0.1 mL/10 g體重。小鼠灌胃給予BBT的劑量經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)(5、10、15 g/kg，其中10 g/kg為小鼠換算劑量)確定。

2.3 肺組織標(biāo)本采集

第22天小鼠稱重后摘眼球取血處死，迅速開胸分離肺臟，用預(yù)冷的生理鹽水快速洗凈組織表面，剔除殘余支氣管及結(jié)締組織，吸干表面生理鹽水后稱重，計(jì)算肺系數(shù)。小鼠左上肺葉用于羥脯胺酸含量測定，左下肺葉于4%福爾馬林中固定用于制作組織切片。其他肺葉凍存于-80 ℃冰箱備用。

2.4 肺組織病理切片制作和羥脯氨酸含量測定

小鼠肺組織于4%福爾馬林中固定24 h后制作H&E或Masson染色切片。H&E染色切片由專業(yè)人員閱片評分，根據(jù)病變和炎癥程度由輕到重標(biāo)記為0、0.5、1、2、3分。Masson染色切片采用積分光密度數(shù)值(IOD，integrated optical density)半定量估算膠原的含量，即每張組織切片選取上、下、左、右和中間五個(gè)視野進(jìn)行拍照，再用Graphpad Prism 5.0數(shù)據(jù)分析軟件對每個(gè)照片進(jìn)行膠原積分，求其平均值，即為該組織切片的膠原積分。膠原羥脯胺酸含量按照試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A030-2)所附說明書進(jìn)行測定。

2.5 HPLC-ELSD色譜條件

色譜條件：Agilent Extend C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)及Agilent預(yù)柱，流動(dòng)相為0.1%三乙胺-甲醇(43∶57)，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃；ELSD漂移管溫度80 ℃，氮?dú)饬魉?.1 mL/min，增益為8。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 百部湯醇提物和水提物抗肺纖維化作用的比較

傳統(tǒng)百部湯是水煎液，但是化學(xué)成分分析結(jié)果顯示，醇提物比水提物成分多、含量高，因此采用博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠，采用預(yù)防給藥的方式，對百部湯水提物和醇提物的抗肺纖維化效果進(jìn)行了比較研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。肺纖維化小鼠的存活率是評價(jià)肺纖維化治療效果的重要指標(biāo)之一。給藥14天后，各組小鼠的存活率如圖1-A所示。與假手術(shù)組小鼠(100%)相比，模型組和百部湯水提物組小鼠的存活率均為50%，百部湯醇提物組和陽性藥的小鼠存活率分別為90%和80%，提示醇提物和陽性藥可顯著降低小鼠死亡率，而水提物則無明顯改善作用。從小鼠體重來看，與模型組相比，假手術(shù)組和醇提物組小鼠的體重明顯上升，而水提物組小鼠體重?zé)o明顯改變(圖1-B、1-C)。肺系數(shù)是評價(jià)實(shí)驗(yàn)性肺水腫及肺纖維化的常用指標(biāo)，模型組小鼠肺系數(shù)顯著增高，給藥組小鼠肺系數(shù)均有下降的趨勢，但僅百部湯醇提物和陽性藥顯著降低了小鼠肺系數(shù)(圖1-D)。羥脯氨酸是評價(jià)組織纖維化中膠原纖維的常用指標(biāo)，模型組小鼠肺組織中羥脯胺酸含量顯著升高，給藥組小鼠肺組織中羥脯胺酸含量均不同程度地下降，百部湯醇提物的效果略優(yōu)于水提物(圖1-E)。小鼠肺組織H&E染色結(jié)果(圖1-F)顯示，假手術(shù)組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，模型組小鼠肺組織內(nèi)成纖維細(xì)胞增生明顯，肺泡壁有炎細(xì)胞浸潤或肺泡炎，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)單核巨噬細(xì)胞，肺泡壁有以單核巨噬細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤，肺泡壁有不同程度的塌陷，表現(xiàn)為肺組織實(shí)變，肺泡腔消失，肺內(nèi)支氣管上皮細(xì)胞有輕度或中度變性，排列不整齊。與模型組相比，給藥組小鼠的病變程度均有所減輕，其中百部湯醇提物的效果最為明顯，肺組織炎性評分結(jié)果(圖1-G)顯示，僅百部湯醇提物對博來霉素引起的炎癥具有顯著性的改善作用，陽性藥尼達(dá)尼布也不能顯著改善炎癥，說明抗炎不是其抗肺纖維化的機(jī)制。小鼠肺組織Masson染色結(jié)果(圖1-H)顯示，模型組小鼠肺組織有大量的膠原沉積(藍(lán)色)，給藥組的膠原沉積均明顯減少，百部湯醇提物效果優(yōu)于水提物；肺組織膠原半定量結(jié)果(圖1-I)顯示，百部湯醇提物和水提物均可顯著抑制膠原的沉積，但醇提物的效果更為顯著。綜上，百部湯醇提物的抗肺纖維化效果優(yōu)于百部湯水提物，因此采用百部湯醇提物繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 不同化學(xué)型對葉百部對百部湯抗肺纖維化作用的影響

百部是傳統(tǒng)的潤肺止咳中藥，其主要的活性成分為百部生物堿類化合物。目前市場上流通的百部主要為對葉百部(S.tuberosa)的塊根。已有研究表明，不同產(chǎn)地、不同批次的對葉百部中生物堿類成分變異較大，根據(jù)其所含的主要成分可將對葉百部分為主含新對葉百部堿(neotuberostemonine)、對葉百部堿(tuberostemonine)、百部新堿(stemoninine)和金剛大堿(croomine)4個(gè)化學(xué)型[10-11]。因此本課題組在對不同批次對葉百部成分分析的基礎(chǔ)上，選擇了3個(gè)以單一生物堿為主成分的對葉百部藥材(含金剛大堿的藥材與其他生物堿共存，故未選)，采用治療給藥的方式，研究不同化學(xué)型對葉百部組成的百部湯對肺纖維化的作用是否存在差異。

Figure1 Effects of ethanol extract and water extract fromBaibuTangon bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice

A:Survival rate of mice (n=10);B,C:Body weight of mice (n=5 - 10);D:Lung index (n=5- 10)；E:Content of hydroxyproline (n=5- 10);F,H:Representative sections of lung tissue stained by HE (F) or Masson′s trichrome (H) (n=5);G:Inflammatory score (n=5);I:Values of integrated optical density (n=5)

BBTst:Water extract;BBTct:Ethanol extract;Nib:Nintedanib

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsthe model group

3.2.1 3個(gè)對葉百部藥材樣品化學(xué)成分的比較 對3個(gè)對葉百部藥材樣品S1～S3的化學(xué)成分采用HPLC-ELSD方法進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)與對照品對照，樣品S1色譜圖中保留時(shí)間為20.07 min的主峰為新對葉百部堿，說明該藥材主含新對葉百部堿；樣品S2色譜圖中保留時(shí)間為21.28 min的主峰為對葉百部堿，說明該藥材主含對葉百部堿；樣品S3色譜圖中保留時(shí)間為9.91 min的主峰為百部新堿，說明該藥材主含百部新堿。HPLC色譜分析結(jié)果表明了樣品S1～S3主含不同的生物堿成分，為3個(gè)不同化學(xué)型的對葉百部，其中新對葉百部堿和對葉百部堿為立體異構(gòu)體。

Figure2 HPLC chromatograms ofBaibu(root ofStemonatuberosa) samples S1-S3 and the chemical structures corresponding to the main peaks

1:Neotuberostemonine;2:Tuberostemonine;3:Stemoninine

3.2.2 不同化學(xué)型對葉百部為君藥的百部湯抗肺纖維化作用的比較 分別由S1、S2和S3組成的百部湯(BBTs1、BBTs2、BBTs3)對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的影響如圖3所示。給藥14 d后，各組小鼠的存活率如圖3-A所示，與假手術(shù)組小鼠(100%)相比，模型組小鼠的存活率為60%，陽性藥為70%，而BBTs1、BBTs2和BBTs3各組小鼠的存活率分別為100%、90%和80%，略有差異。與模型組小鼠相比，BBTs1、BBTs2、BBTs3給藥小鼠的體重均有顯著性增加且相互之間無差別(圖3-B、3-C)；雖然BBTs2可顯著降低小鼠肺系數(shù)，從肺系數(shù)的平均值看，三者差別不大(圖3-D)。三種不同化學(xué)型對葉百部組成的百部湯均能明顯降低模型小鼠肺組織中羥脯氨酸的含量，其中BBTs3的效果略優(yōu)于BBTs1和BBTs2(圖3-E)。小鼠肺組織HE染色結(jié)果(圖3-F)顯示，模型小鼠肺組織出現(xiàn)了明顯的病變，BBTs1、BBTs2、BBTs3給藥后均可減輕小鼠的病變程度，肺組織炎性評分結(jié)果(圖3-G)顯示，BBTs1和BBTs2對博來霉素引起的炎癥具有明顯的改善作用，且BBTs1效果略優(yōu)于BBTs2，BBTs3具有改善的趨勢但無顯著性差異。小鼠肺組織Masson染色結(jié)果(圖3-H)顯示，模型組小鼠肺組織膠原沉積(藍(lán)色)明顯，百部湯各給藥組小鼠肺組織中膠原組織均明顯減少，膠原積分光密度數(shù)值(圖3-I)均明顯下降，且抑制程度相似，說明不同主成分對葉百部的百部湯均具有明顯抑制小鼠肺纖維化的作用。

綜上，不同化學(xué)型對葉百部為君藥的百部湯均具有顯著的抗肺纖維化作用，但對小鼠肺組織病理學(xué)改變和炎癥的影響略有差異，需要進(jìn)一步的研究。

4 討 論

肺纖維化屬于纖維增殖性疾病的范疇，其病變主要累及肺間質(zhì)，也可累及肺泡上皮細(xì)胞及肺血管，以肺成纖維細(xì)胞的異常增生和膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積為主要表現(xiàn)，至今發(fā)病機(jī)制不明，且沒有理想的治療方法。隨著污染加劇、環(huán)境惡化等因素，肺纖維化在全球的發(fā)病率呈不斷上升的態(tài)勢，已成為嚴(yán)峻的健康問題[12]。由于肺間質(zhì)性疾病最終均發(fā)展為肺纖維化，因此對肺纖維化發(fā)生機(jī)制和有效藥物的研究具有非常重要的意義。

Figure3 Effects ofBaibuTangwithBaibu(root ofStemonatuberosa) containing different components on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice

A:Survival rate of mice (n=10);B,C:Body weight of mice (n=5-10);D:Lung index (n=5-10);E:Content of hydroxyproline (n=5-10);F,H:Representative sections of lung tissue stained by HE (F) or Masson′s trichrome (H) (n=5);G:Inflammatory score (n=5);I:Values of integrated optical density (n=5)

BBTs1:BaibuTangwithBaibumainly containing neotuberostemonine;BBTs2:BaibuTangwithBaibumainly containing tuberostemonine;BBTs3:BaibuTangwithBaibumainly containing stemoninine;nib-nintedanib

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vsthe model group

中醫(yī)藥古籍中并無“肺纖維化”一詞，根據(jù)其臨床癥狀，中醫(yī)常將其歸為“肺痹”或“肺痿”，且多認(rèn)為“肺痹”為肺纖維化的中早期階段，“肺痿”為中晚期階段[13-14]。百部湯為治療“肺痿”的古方，因此本文對百部湯的抗肺纖維化作用進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，百部湯的水煎液和醇提物均具有干預(yù)肺纖維化的作用，但醇提物效果優(yōu)于水提物。LC-MS分析結(jié)果表明，百部湯的主要活性成分為百部生物堿和薏苡仁油脂類化合物(將另文發(fā)表)，二者均為小極性化合物，為上述藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果從物質(zhì)基礎(chǔ)的角度提供了依據(jù)。

百部為始載于《名醫(yī)別錄》的常用中藥，歸肺經(jīng)，具有潤肺下氣、止咳的作用，為中醫(yī)治療肺纖維化常用的組方藥物。我們的前期表明，對葉百部總生物堿及從對葉百部中分得的單體化合物新對葉百部堿均具有明顯的抗肺纖維化作用[15-16]。百部為百部湯復(fù)方的君藥，由于對葉百部化學(xué)成分變異較大，因此本文又進(jìn)一步研究比較了3個(gè)不同化學(xué)型(分別主含新對葉百部堿、對葉百部堿和百部新堿)的對葉百部組成的百部湯對博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然不同化學(xué)型百部藥材組成的百部湯對肺纖維化小鼠不同病理指標(biāo)的影響程度略有差異，但均具有顯著的抑制羥脯氨酸、改善肺組織膠原沉積的作用，且其活性強(qiáng)度相似。這說明了只要是正品的對葉百部，不論其含有什么類型的生物堿(不同的化學(xué)型)，由其組成的百部湯均具有明顯的拮抗肺纖維化的作用。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來看，樣品S1主含的新對葉百部堿和樣品S2主含的對葉百部堿為立體異構(gòu)，而樣品3主含的百部新堿與上述兩個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)差異較大。本論文的研究結(jié)果提示，這3個(gè)化合物可能都具有抗肺纖維化的活性。新對葉百部堿的抗肺纖維化活性已被證實(shí)[17]，對葉百部堿和百部新堿的活性正在進(jìn)一步的研究中。

由于市場上難于收集到直立百部和蔓生百部藥材，因此本文未能比較不同植物來源百部對百部湯抗肺纖維化作用的影響。