基于拉曼光譜的中藥升降浮沉藥性辨識(shí)方法研究

劉淑明 ，梁浩 ，程虹 ，紀(jì)徐維晟， ，王耘

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥信息工程研究中心，北京 102488；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488

升降浮沉是指藥物對(duì)人體作用的不同趨向性[1]。作為中藥藥性特征之一，升降浮沉在指導(dǎo)臨床用藥與方劑配伍過(guò)程中具有重要作用。目前，升降浮沉理論相關(guān)研究主要集中在古籍溯源研究[1-3]、方劑內(nèi)涵原理探討[4-6]、藥性考證或藥效比較[7-9]。藥理研究表明，中藥升降浮沉藥性對(duì)人體特定方向或病勢(shì)的疾病起著顯著或特殊的調(diào)節(jié)作用[10]。如藥性“升”具有催吐、發(fā)汗、升陽(yáng)、開竅、清頭目、通鼻竅、聰耳明目、生津止渴的功效，藥理作用表現(xiàn)為興奮嘔吐中樞、催吐、發(fā)汗、解熱等[11]。

升與降、浮與沉對(duì)立統(tǒng)一，對(duì)具有相同作用趨勢(shì)的中藥進(jìn)行共有特征探索與辨識(shí)研究，有望揭示升降浮沉的科學(xué)內(nèi)涵。油雨忻等[12]提出“中藥升降浮沉藥性的物質(zhì)基礎(chǔ)是中藥成分”假說(shuō)，利用紫外指紋圖譜表征中藥成分，結(jié)合支持向量機(jī)（SVM）算法初步構(gòu)建了中藥升降浮沉判別模型，為中藥藥性物質(zhì)基礎(chǔ)與升降浮沉理論研究提供了新思路。然而，中藥指紋圖譜的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在對(duì)已知化學(xué)成分的準(zhǔn)確鑒定，無(wú)法整體表征中藥這一復(fù)雜體系。樣品制備的要求也增加了研究的復(fù)雜性。中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的復(fù)雜性使草本中藥可看作由分子構(gòu)成的整體集合體系，拉曼光譜為分子散射光譜，能夠?qū)χ兴庍M(jìn)行直接檢測(cè)分析，即可以在保留中藥整體特性的情況下得到量化表征數(shù)據(jù)，進(jìn)而開展后續(xù)研究。因此，本研究基于中醫(yī)藥整體觀，以“升降浮沉”為研究對(duì)象，測(cè)定中藥拉曼圖譜，經(jīng)特征篩選獲取不同藥性拉曼光譜特征，結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)方法建立中藥升降浮沉特性辨識(shí)模型并開展評(píng)價(jià)，以期得到基于拉曼光譜的升降浮沉藥性量化表征精準(zhǔn)數(shù)據(jù)和辨識(shí)模型，揭示中藥升浮與沉降的科學(xué)內(nèi)涵，促進(jìn)升降浮沉理論的現(xiàn)代化發(fā)展。

1 儀器與試藥

SEED型近紅外拉曼光譜儀（Seabreeze Laser激光器，XS11639-B40090157光譜儀系統(tǒng)，上海如海光電公司），YP-2TS型壓片機(jī)（天津中世沃克有限公司），RS-FS1801型中藥材超微粉碎機(jī)（廣州榮事達(dá)有限公司）。

白芷、薄荷、蒼術(shù)、細(xì)辛、生姜、旋覆花、阿膠、枇杷葉、紫蘇子、大黃等藥材共239種（升浮藥101種，沉降藥138種），安國(guó)市桓榮中藥材有限公司提供（送貨號(hào)Q010246），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院王耘團(tuán)隊(duì)鑒定，所有藥材均符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[13]規(guī)定；超純水（屈臣氏有限公司，貨號(hào)hs6303）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品預(yù)處理

中藥材用超純水洗凈，去除表面灰塵等雜質(zhì)，置于真空干燥箱中，26 ℃恒溫干燥1 h。用超微粉碎機(jī)打成粉末，過(guò)3號(hào)篩，利用小型不銹鋼壓片模具壓片，即得待測(cè)樣品。

2.2 檢測(cè)條件

激光器類型為板載激光器；中心波長(zhǎng)785 nm；功率120 mW；積分時(shí)間7 000 ms；平均采集3次；平均模式為硬件平均；拉曼位移200～3 200 cm-1；基線處理?xiàng)l件為lambda 10 000，order 2；平滑濾鏡lambda 20，order 2。

2.3 數(shù)據(jù)采集

將待測(cè)藥材粉末壓片或器皿放置于樣品臺(tái)上，隨機(jī)選取10個(gè)不同的部分依次進(jìn)行檢測(cè)，采用連續(xù)掃描收集、激光自動(dòng)模式，共采集10次，以10次檢測(cè)的平均拉曼譜圖作為該藥材最終表征譜圖。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察

以枸杞子、山藥、茯苓、刺五加、冰片5味藥進(jìn)行專屬性考察，按上述條件進(jìn)行檢測(cè)。功率調(diào)至0 mW，采集特征拉曼位移（cm-1）及其所對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)（I），得到空白譜圖。結(jié)果見圖1。表明不同中藥因性質(zhì)的差異表現(xiàn)出各異的拉曼譜圖，峰形良好，無(wú)明顯熒光干擾。

圖1 中藥材拉曼譜圖專屬性考察

2.4.2 精密度考察

以柏子仁、西洋參、蘇合香、土木香、天花粉5味藥進(jìn)行儀器精密度考察。經(jīng)樣品預(yù)處理后，每味藥分別制備6份待測(cè)樣品，先后放置于樣品臺(tái)上進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，記錄中藥拉曼譜圖的特征拉曼位移及其所對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)，并計(jì)算RSD。同時(shí)，對(duì)拉曼譜圖進(jìn)行逆峰位匹配檢索，計(jì)算譜圖相似度。結(jié)果RSD均小于4.12%，相似度均大于86.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性考察

以取自不同產(chǎn)地（山東、河北、寧夏、江蘇、湖南）的當(dāng)歸、黃柏、山藥3味藥進(jìn)行重復(fù)性考察。經(jīng)樣品預(yù)處理后，每味中藥待測(cè)樣品先后進(jìn)行5次拉曼光譜檢測(cè)，記錄中藥拉曼譜圖的特征拉曼位移及其所對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)，并計(jì)算RSD。同時(shí)進(jìn)行逆峰位匹配檢索，計(jì)算譜圖相似度。結(jié)果RSD均小于3.62%，相似度均大于85.7%，表明重復(fù)性良好，且不同產(chǎn)地的同種中藥拉曼譜圖整體上基本一致。

2.5 數(shù)據(jù)處理及特征篩選

按“2.3”項(xiàng)下方法得到101味升浮藥與138味沉降藥的拉曼譜圖數(shù)據(jù)，以1 cm-1為單位進(jìn)行量化處理，每味藥得到3 000個(gè)拉曼指標(biāo)，建立239味中藥的拉曼數(shù)據(jù)集。“升降浮沉”數(shù)據(jù)依據(jù)2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》[13]和《中藥大辭典（第二版）》[14]的中藥功效作用趨向結(jié)合判定標(biāo)準(zhǔn)分析：具有解表、透疹、祛風(fēng)（濕）、升陽(yáng)舉陷、開竅、醒神、溫陽(yáng)補(bǔ)火、行氣、解郁、涌吐等功效的中藥，作用趨向?yàn)椤吧　?，如薄荷、柴胡、升麻、蒼術(shù)等；具有清熱、瀉下、利濕、安（養(yǎng)）神、止嘔、抑肝陽(yáng)、息風(fēng)止痙、止咳、平喘、收斂固澀、止血等功效的中藥，作用趨向?yàn)椤俺两怠?，如白芍、葶藶子、苦杏仁、牡蠣等[2，15-16]。

本研究采用帶有交叉驗(yàn)證的遞歸特征消除（RFECV）對(duì)拉曼譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行特征篩選。該方法分為兩部分：遞歸特征消除（recursive feature elimination，RFE）[17]通過(guò)一個(gè)基模型進(jìn)行模型訓(xùn)練，對(duì)3 000個(gè)拉曼波段進(jìn)行特征重要性排序，刪除重要性最低的特征，利用新特征集進(jìn)行下一輪訓(xùn)練，循環(huán)往復(fù)直至達(dá)到所需的特征數(shù)量；再通過(guò)交叉驗(yàn)證（cross validation，CV）篩選出最優(yōu)特征子集。本研究使用輕量級(jí)梯度提升機(jī)（LGBM）集成算法[18]作為RFE的基模型。以LGBM_RFE作為特征篩選算法篩選出與升降浮沉顯著相關(guān)的拉曼波段，交叉驗(yàn)證次數(shù)為5，每次刪除的特征個(gè)數(shù)為1，最終保留126個(gè)最優(yōu)拉曼波段進(jìn)行中藥升降浮沉特性辨識(shí)模型的訓(xùn)練。

2.6 模型構(gòu)建及評(píng)價(jià)

為得到良好的辨識(shí)模型，本研究基于特征篩選后的中藥拉曼譜圖數(shù)據(jù)結(jié)合SVM、隨機(jī)森林（RF）、極度梯度提升（XGBoost）和自適應(yīng)提升（AdaBoost）分類器建立中藥升浮沉降辨識(shí)模型，將數(shù)據(jù)集按7∶3比例隨機(jī)劃分為訓(xùn)練集和測(cè)試集，使用不同模型進(jìn)行訓(xùn)練與預(yù)測(cè)，并用曲線下面積（AUC）、準(zhǔn)確率、精確度、召回率及F1值作為模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)。以上4種分類器均通過(guò)隨機(jī)網(wǎng)格搜索十折交叉驗(yàn)證進(jìn)行參數(shù)調(diào)試和優(yōu)化，最優(yōu)超參數(shù)設(shè)置見表1，模型比較見表2。

表1 4種分類器的最優(yōu)超參數(shù)設(shè)置

表2 4種辨識(shí)模型評(píng)價(jià)指標(biāo)比較（%）

4種辨識(shí)模型的AUC均達(dá)到80%以上，其中XGBoost模型AUC達(dá)90%以上，說(shuō)明該模型的分類效果極佳。相較于其他模型，XGBoost模型的準(zhǔn)確率更高，整體效果更好；精確度和召回率更高，說(shuō)明對(duì)升浮中藥和沉降中藥的區(qū)分能力更強(qiáng)；F1值更高說(shuō)明模型更加穩(wěn)健。明顯優(yōu)于已報(bào)道模型（AUC為0.831 6，準(zhǔn)確率為80.00%）[12]。綜上，XGBoost模型表現(xiàn)最優(yōu)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)升浮中藥和沉降中藥的準(zhǔn)確辨識(shí)。

為深入了解126個(gè)最優(yōu)拉曼波段與升降浮沉中藥辨識(shí)結(jié)果之間的關(guān)系，選用SHAP（SHapley Additive exPlanations）方法[19]對(duì)基于XGBoost構(gòu)建的升浮沉降辨識(shí)模型的識(shí)別結(jié)果進(jìn)行解釋，以此反映最優(yōu)拉曼波段對(duì)藥性識(shí)別結(jié)果的影響及其正負(fù)性，可視化部分結(jié)果見圖2。模型中最重要的前10個(gè)拉曼波段分別位于I2289、I2105、I1066、I2343、I2415、I2425、I1140、I2591、I458、I2291。圖中每個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)樣本，點(diǎn)的顏色代表拉曼波段強(qiáng)度。如波段I2105，紅色點(diǎn)主要集中于橫坐標(biāo)正值，藍(lán)色點(diǎn)主要集中于橫坐標(biāo)負(fù)值，表明此波段拉曼強(qiáng)度越高其藥性辨識(shí)結(jié)果越趨于升浮，拉曼強(qiáng)度越低其藥性辨識(shí)結(jié)果越趨于沉降；波段I1140，紅色點(diǎn)主要集中于橫坐標(biāo)負(fù)值區(qū)域，表明此波段拉曼強(qiáng)度越高其藥性辨識(shí)結(jié)果越趨于沉降。

圖2 最優(yōu)拉曼波段對(duì)模型預(yù)測(cè)的影響正負(fù)性

3 討論

歷代醫(yī)書、歷年版《中華人民共和國(guó)藥典》及各版《中藥學(xué)》教材對(duì)中藥性、味、歸經(jīng)大多有明確記載，但均未從升降浮沉角度對(duì)單味中藥性能進(jìn)行明確論述。其原因之一是升降浮沉概念較為抽象，會(huì)根據(jù)醫(yī)家個(gè)人經(jīng)驗(yàn)發(fā)生改動(dòng)。另一重要原因在于，中藥的升降浮沉特性受性、味、歸經(jīng)、用藥部位、藥材質(zhì)地、炮制、配伍等因素影響。從性味來(lái)看，性熱、溫，味甘、辛、淡屬陽(yáng)，多為升浮之性；性寒、涼，味酸、苦、咸屬陰，多為沉降之性。若藥物的性味陰陽(yáng)屬性不同，該藥便具有升浮沉降雙重特性。氣味厚薄升降浮沉理論同樣闡述了這一原理，氣屬陽(yáng)、味屬陰，中藥氣味陰陽(yáng)共存，使一味中藥存在升中有降、降中有升的可能。如從四氣五味、氣味厚薄、主治功效、方劑配伍四方面對(duì)桔梗藥性進(jìn)行考證，發(fā)現(xiàn)其不僅具有顯著的升浮之性，亦有苦泄沉降之功[20]。大黃峻下，酒制后具備清上焦血分熱毒功效。牛膝引血下行，配伍柴胡、桔梗后具有上升之力。一般來(lái)說(shuō)，方劑的升降趨勢(shì)取決于方劑中具有相同趨勢(shì)的大部分藥味[21]。因此，中藥的升降浮沉特性受多種因素的影響并存在轉(zhuǎn)化關(guān)系，這在一定程度上導(dǎo)致該理論發(fā)展緩慢。

由于升降浮沉特性的復(fù)雜性，探尋不同藥性對(duì)應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)與科學(xué)內(nèi)涵尤為重要。中藥是典型的復(fù)雜體系，藥性中性、味、歸經(jīng)、升降浮沉、有毒無(wú)毒分別從不同維度對(duì)中藥整體特點(diǎn)進(jìn)行描述，每個(gè)維度必然對(duì)應(yīng)著各自的物質(zhì)基礎(chǔ)。在探索各藥性科學(xué)內(nèi)涵的過(guò)程中，應(yīng)秉持整體觀思想。拉曼光譜屬分子振動(dòng)散射光譜，其形成與分子極化率和能級(jí)相關(guān)。本研究中，中藥的檢測(cè)過(guò)程保持了中藥完整性，拉曼光譜從分子層面實(shí)現(xiàn)了中藥的整體表征。

拉曼光譜檢測(cè)中噪聲較大，經(jīng)常受到熒光效應(yīng)的干擾[22-25]。為抑制熒光效應(yīng)，本研究采取如下方法：①選定激發(fā)光中心波長(zhǎng)785 nm。中藥熒光檢測(cè)激發(fā)光波長(zhǎng)大多位于紫外-可見光區(qū)，如山藥330 nm、沙苑子410 nm、熟地黃470 nm等[26]，而中心波長(zhǎng)785 nm的激發(fā)光為近紅外激光（760～830 nm），可在一定程度上抑制樣品的熒光效應(yīng)；②采用屈臣氏超純水、甲醇、甲醇水輕微沖洗藥材，去除表面灰塵、沾染物等雜質(zhì)，避免雜質(zhì)熒光效應(yīng)的干擾；③儀器采取連續(xù)掃描采集模式，延長(zhǎng)照射時(shí)間，利用“光致漂白”效應(yīng)以最大程度達(dá)到抑制熒光干擾的效果[27]。

LGBM集成算法具有訓(xùn)練速度快、高準(zhǔn)確度、適用于高維度數(shù)據(jù)等優(yōu)點(diǎn)，可以高效、準(zhǔn)確的對(duì)拉曼波段進(jìn)行重要性排名。RFE算法通過(guò)迭代運(yùn)算來(lái)選擇最重要的拉曼波段子集，從而減少特征數(shù)量，提高模型的準(zhǔn)確度。兩者聯(lián)用的LGBM_RFE特征篩選算法可從3 000個(gè)拉曼波段中去除冗余數(shù)據(jù)，保留重要信息，篩選得到與升浮沉降相關(guān)性最強(qiáng)的拉曼波段子集。得到的126個(gè)最優(yōu)拉曼波段是拉曼光譜在升降浮沉維度對(duì)中藥的表征。拉曼位移主要集中在1 000～3 200 cm-1，此范圍內(nèi)升浮中藥的拉曼強(qiáng)度普遍高于沉降中藥。同時(shí)，采用SHAP方法對(duì)單味中藥升降浮沉特征拉曼波段進(jìn)行可視化，以此反映最優(yōu)拉曼波段對(duì)升降浮沉藥性識(shí)別結(jié)果的重要程度及正負(fù)向影響。拉曼譜圖反映的不單是中藥中的某一成分或某一元素，而是某一藥性在中藥本體的整體特征，是對(duì)藥性進(jìn)行科學(xué)內(nèi)涵探索的必要選擇。通過(guò)中藥拉曼光譜圖結(jié)合辨識(shí)模型，前期已經(jīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥寒熱藥性、平性、甘味的辨識(shí)[28-30]。

本研究基于大宗中藥材進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，以拉曼光譜整體表征中藥升降浮沉藥性，結(jié)合LGBM_RFE算法篩選得到126個(gè)拉曼波段，在此基礎(chǔ)上建立升降浮沉辨識(shí)模型，闡釋升降浮沉的科學(xué)內(nèi)涵，為客觀識(shí)別中藥的“升浮”和“沉降”趨勢(shì)提供一種新方法。