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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和細(xì)胞驗(yàn)證探討甘草抗肺癌機(jī)制

    2023-10-17 03:45:56張尚龍閆瀟楊秀娟楊志軍連小龍張楠葉禮巧楊必乾殷亭湄付曉艷馬趣環(huán)鄧毅
    中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志 2023年10期
    關(guān)鍵詞:存活率甘草靶點(diǎn)

    張尚龍 ,閆瀟 ,楊秀娟 ,楊志軍 ,連小龍 ,張楠 ,葉禮巧 ,楊必乾 ,殷亭湄 ,付曉艷 ,馬趣環(huán) ,鄧毅,

    1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000; 2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730000

    肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,治療方法主要有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、分子靶向治療等。由于肺癌早期癥狀不明顯,惡性程度較高,很多患者在確診時(shí)已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散,無(wú)法接受手術(shù)治療,故化療的作用不可替代。然而大劑量或重復(fù)低劑量化療藥物會(huì)引起較強(qiáng)的不良反應(yīng),且導(dǎo)致患者產(chǎn)生耐藥性。甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效[1]。藥理研究表明,甘草具有抗腫瘤、抗炎殺菌、抗病毒、保肝、抗心力衰竭、調(diào)節(jié)免疫及抗纖維化等作用[2]。近年來(lái),甘草有效成分如甘草次酸、甘草苷、異甘草素等在抗肝癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等腫瘤的研究取得了一定進(jìn)展[3-7]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,對(duì)甘草抗肺癌作用進(jìn)行靶點(diǎn)與通路篩選,并進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,為后續(xù)深入研究及新藥開(kāi)發(fā)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

    1.1.1 甘草活性成分及靶點(diǎn)收集

    通過(guò)TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php),以口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18為條件篩選甘草的活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn);通過(guò)R語(yǔ)言軟件獲得靶點(diǎn)的縮寫(xiě)名稱,構(gòu)建中藥-化合物-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

    1.1.2 肺癌靶點(diǎn)收集

    以“l(fā)ung cancer”為關(guān)鍵詞,通過(guò)GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(http://https://omim.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索疾病靶點(diǎn),檢索結(jié)果合并后去重,得到肺癌相關(guān)靶點(diǎn)。

    1.1.3 甘草治療肺癌靶點(diǎn)收集

    將甘草靶點(diǎn)與肺癌相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)微生信在線平臺(tái)(https://www.bioinformatics.com.cn/)可視化得到甘草-肺癌共有靶點(diǎn),即為甘草治療肺癌的靶點(diǎn)。

    1.1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

    將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù),在“organism”中選擇“Homo Sapiens”進(jìn)行搜索,獲得蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò),導(dǎo)出TSV格式文件,將其導(dǎo)入Cytoscape3.8.0(http://www.cytoscape.org/)軟件篩選關(guān)鍵靶點(diǎn),繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。

    1.1.5 GO和KEGG通路富集分析

    通過(guò)Metascape(http://metascape.org/)在線軟件對(duì)獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。GO富集分析包括生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)。將分析結(jié)果前10條進(jìn)行可視化。

    1.1.6 共有靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

    將共有靶點(diǎn)及化合物通過(guò)Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行可視化,構(gòu)建共有靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)圖。

    1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

    1.2.1 藥物與細(xì)胞

    甘草采自甘肅省金塔縣,經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖。甘草提取物制備方法:稱取甘草粉末100 g,加50%乙醇(1∶10,W/V)浸提30 min,超聲提?。üβ?00 W,頻率60 kHz)30 min,真空抽濾后,減壓回收溶劑至50 mL,水浴加熱至干浸膏,快速研磨成細(xì)粉[8],4 ℃冰箱保存,實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM高糖培養(yǎng)基配制成50 mg/mL母液。

    人肺腺癌A549細(xì)胞,甘肅省腫瘤醫(yī)院惠贈(zèng)。

    1.2.2 試劑與儀器

    DMEM高糖培養(yǎng)基(Cytiva公司,批號(hào)AH29027412),胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司,批號(hào)21030707),噻唑藍(lán)(MTT,北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)917Q051),胰蛋白酶、青鏈霉素(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號(hào)GP2211017、GA22020011094),二甲基亞砜(DMSO,北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)1121E0331),兔抗β-actin、羊抗兔二抗(Abbkine公司,批號(hào)分別為ATVMA0302、ATVE16011),兔抗Bax、兔抗Bcl-2、兔抗HIF-1α及兔抗GLUT1(Abmart公司,批號(hào)分別為T40051、T40056、TA1009、T55360),BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)20211213)。

    CO2恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)HF151,力康發(fā)展有限公司),酶標(biāo)儀(型號(hào)RT-6100,深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司),電泳儀(型號(hào)DYY-6D,北京六一生物科技有限公司),超凈工作臺(tái)(型號(hào)B2HFsafe,上海力申科學(xué)有限公司),低溫冷凍離心機(jī)(型號(hào)H1650R,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司),熒光倒置顯微鏡(型號(hào)MoticamPro2058,上海捷辰儀器有限公司)。

    1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

    將凍存的A549細(xì)胞迅速解凍,加入完全培養(yǎng)基,1 000 r/min離心5 min,棄上清液,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶,加入5 mL配制好的完全培養(yǎng)液(10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液、89%高糖DEME培養(yǎng)基),輕輕吹打使細(xì)胞懸浮,轉(zhuǎn)移懸浮液至細(xì)胞培養(yǎng)瓶,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合至80%~90%時(shí),用胰酶消化并轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中。

    1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

    將細(xì)胞消化懸浮后以5×104個(gè)/mL接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后,分為調(diào)零組(不加細(xì)胞和藥物)、對(duì)照組(不加藥物)及給藥組,每組3個(gè)復(fù)孔,給藥組用不同濃度(1、2、3、4、5 mg/mL)甘草提取物處理24 h,加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL),4 h后加入150 μL DMSO,混勻,于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)吸光度(OD值),計(jì)算細(xì)胞存活率。存活率(%)=(OD給藥組-OD調(diào)零組)÷(OD對(duì)照組-OD調(diào)零組)×100%。

    1.2.5 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2、HIF-1α、GLUT1蛋白表達(dá)

    將A549細(xì)胞分為對(duì)照組和甘草低、中、高劑量組,以1×105個(gè)/mL接種于6孔板中,待其貼壁后,甘草低、中、高劑量組加入不同濃度(3、4、5 mg/mL)甘草提取物處理24 h,對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基,收集細(xì)胞,于冰上加入細(xì)胞裂解液,分別提取總蛋白,加入上樣緩沖液,100 ℃金屬浴變性。根據(jù)分子量不同進(jìn)行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,加入Bax、Bcl-2、HIF-1α、GLUT1一抗(均為1∶2 000),4 ℃孵育過(guò)夜,1×TBST清洗3次,每次10 min,加二抗(1∶5 000),室溫孵育2 h,1×TBST清洗3次,每次10 min,曝光顯影,用Image J軟件計(jì)算灰度值。

    1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 甘草活性成分及靶點(diǎn)

    通過(guò)TCMSP得到甘草化合物及靶點(diǎn),刪去無(wú)靶點(diǎn)的化合物,最終得到甘草活性成分88個(gè),靶點(diǎn)213個(gè)。

    2.2 肺癌靶點(diǎn)

    將GeneCards、OMIM、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)收集到的肺癌靶點(diǎn)進(jìn)行合并,刪除重復(fù)靶點(diǎn),最終得到肺癌靶點(diǎn)23 458個(gè)。

    2.3 甘草抗肺癌靶點(diǎn)

    將檢索到的213個(gè)甘草活性成分的靶點(diǎn)與23 458個(gè)肺癌靶點(diǎn)比較分析后取重復(fù)值,得到共同作用靶點(diǎn)209個(gè),作為甘草治療肺癌的潛在靶點(diǎn)。

    2.4 核心靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

    將209個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),獲得的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行分析,根據(jù)Degree值與中介中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality)高于平均值篩選出排名靠前的核心靶點(diǎn)43個(gè)。Degree值排序居前列的靶點(diǎn)有MAPK1、MAPK3、MMP2、MMP9、AKT1、VEGFA及HIF1A等。這些靶點(diǎn)主要參與細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞增殖、分化、侵襲、遷移、凋亡、細(xì)胞血管生成等過(guò)程。因此,蛋白質(zhì)分子之間的相關(guān)性表明這些靶點(diǎn)可能是甘草對(duì)肺癌起到核心調(diào)控作用的靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

    圖1 甘草抗肺癌核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

    2.5 GO和KEGG通路富集分析結(jié)果

    對(duì)甘草抗肺癌209個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析,共得到1 312條結(jié)果。其中BP 1 202條,主要涉及凋亡信號(hào)通路、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、蛋白磷酸化的正調(diào)控等;CC 46條,主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、過(guò)氧化物酶體、囊泡腔、細(xì)胞器外膜等;MF 64條,主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合、一氧化氮合酶的調(diào)節(jié)活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等。各前10條結(jié)果見(jiàn)圖2。

    圖2 甘草抗肺癌潛在靶點(diǎn)GO富集分析

    對(duì)甘草抗肺癌209個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,共得到226條通路,主要涉及癌癥相關(guān)通路、動(dòng)脈粥樣硬化、HIF-1信號(hào)通路、非酒精性脂肪肝、小細(xì)胞肺癌、幽門螺桿菌感染的上皮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等,前10條通路見(jiàn)圖3。Bcl-2家族是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的一類蛋白,包括Bcl-2等凋亡抑制因子和Bax等促凋亡因子。甘草主要活性成分甘草查爾酮A[9]、甘草次酸[10]、異甘草素[11]等通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。HIF-1信號(hào)通路是缺氧微環(huán)境的關(guān)鍵通路,HIF-1α作為調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)的核轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)70多個(gè)基因,如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等,調(diào)控惡性腫瘤的細(xì)胞增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。因此,推測(cè)甘草可能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的凋亡通路及HIF-1α信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

    圖3 甘草抗肺癌潛在靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

    2.6 共有靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)

    甘草與肺癌共有靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖4。該網(wǎng)絡(luò)包含297個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 495條邊。

    圖4 甘草抗肺癌共有靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)

    2.7 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

    2.7.1 不同濃度甘草提取物對(duì)細(xì)胞存活率的影響

    與對(duì)照組比較,1、2、3、4、5 mg/mL甘草提取物對(duì)A549細(xì)胞增殖均有抑制作用(P<0.01),表明甘草對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響有劑量依賴性。見(jiàn)表1。

    表1 各組A549細(xì)胞存活率比較(,n=3)

    表1 各組A549細(xì)胞存活率比較(,n=3)

    注:與對(duì)照組比較,**P<0.01

    存活率/%100.00±1.55 72.21±1.61**66.73±0.22**58.89±0.44**44.62±7.02**22.11±0.30**組別對(duì)照組給藥組濃度/(mg/mL)1 2 3 4 5

    2.7.2 甘草對(duì)A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、HIF-1α、GLUT1蛋白表達(dá)的影響

    與對(duì)照組比較,甘草各劑量組Bcl-2、HIF-1α、GLUT1表達(dá)下調(diào),Bax表達(dá)上調(diào)(P<0.01),表明甘草對(duì)HIF-1α信號(hào)通路有抑制作用。見(jiàn)表2、圖5。

    表2 各組A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、HIF-1α和GLUT1蛋白表達(dá)比較(,/β-actin,n=3)

    表2 各組A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、HIF-1α和GLUT1蛋白表達(dá)比較(,/β-actin,n=3)

    注:與對(duì)照組比較,**P<0.01

    組別對(duì)照組甘草低劑量組甘草中劑量組甘草高劑量組GLUT1 1.39±0.05 0.96±0.02**0.57±0.06**0.30±0.06**濃度/(mg/mL)3 4 5 Bax 0.17±0.02 0.41±0.11**0.52±0.13**1.17±0.23**Bcl-2 1.44±0.07 0.69±0.04**0.52±0.08**0.23±0.07**HIF-1α 0.95±0.08 0.59±0.01**0.54±0.03**0.41±0.03**

    圖5 各組A549細(xì)胞Bax、Bcl-2、HIF-1α和GLUT1蛋白免疫印跡

    3 討論

    目前肺癌治療以化療為主,而化療藥物的不良反應(yīng)限制其臨床應(yīng)用。甘草作為臨床常用藥物,可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、干擾細(xì)胞周期、誘導(dǎo)自噬、抑制糖酵解、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)控miRNA和多種信號(hào)通路等作用機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用[2]。但甘草抗肺癌的作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)甘草抗肺癌的機(jī)制進(jìn)行研究,獲得88個(gè)藥物活性成分、209個(gè)潛在作用靶點(diǎn),通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析獲得MAPK1、MAPK3、MMP2、MMP9及HIF1A等43個(gè)核心靶點(diǎn)。此外,通過(guò)對(duì)209個(gè)關(guān)鍵靶蛋白進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析,推測(cè)甘草活性成分靶點(diǎn)通過(guò)癌癥相關(guān)通路、HIF-1信號(hào)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及凋亡。

    本研究篩選出甘草提取物3、4、5 mg/mL 3種給藥濃度作用于人肺癌A549細(xì)胞,并選擇富集程度較高的HIF-1α信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證。與對(duì)照組比較,不同濃度甘草提取物均可抑制A549細(xì)胞增殖且具有濃度依賴性,甘草各劑量組能上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá),下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、HIF-1α及GLUT1表達(dá)。

    綜上所述,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法,對(duì)甘草抗肺癌機(jī)制進(jìn)行研究,驗(yàn)證了甘草抗肺癌多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn),提示甘草抗肺癌的作用機(jī)制可能與抑制肺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及調(diào)控HIF-1α信號(hào)通路有關(guān),相關(guān)機(jī)制仍需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究可為甘草的臨床應(yīng)用及抗腫瘤新藥的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。今后課題組將利用代謝組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)等多種手段結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)甘草抗肺癌的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

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