四種致瀉性大腸桿菌多重PCR檢測方法的建立及在大熊貓上的應(yīng)用

王路才，蘇小艷，張煥容，劉頌蕊，燕 霞，楊 梅，李明喜*

（1.成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室，四川 成都 610081；2.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，四川 成都 610041）

大腸桿菌（E.coli）屬革蘭氏陰性短桿菌，為條件致病菌，在自然條件下普遍存在，僅有致病性大腸桿菌具有致病性，可引起人和動物發(fā)生以腹瀉癥狀為主的疾病。根據(jù)不同的生物學特性，將致病性大腸桿菌分為5 類：腸道致病性大腸桿菌（EPEC）、腸道侵襲性大腸桿菌（EIEC）、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）、腸道集聚性大腸桿菌（EAEC）和腸道出血性大腸桿菌（EHEC）［1］。

自1983年起，陸續(xù)有大熊貓感染致瀉性大腸桿菌的報道，嚴重者甚至導(dǎo)致死亡［2-3］。多重PCR檢測在轉(zhuǎn)基因鑒定、食品檢測、病原體檢測、腫瘤診斷等領(lǐng)域已成功運用［4-8］，具有快速、靈敏、準確等優(yōu)點。本研究擬針對escV、stx1、stx2 和bfpB 毒力基因建立檢測EPEC 和EHEC 的多重PCR 體系，針對lt、sth、astA、aggR 和pic毒力基因建立檢測ETEC 和EAEC 的多重PCR 體系，為大熊貓腸道腹瀉性疾病提供及時、可靠的診斷結(jié)果，指導(dǎo)臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 菌株 ETEC（CICC10667）、EAEC（CICC24186）、EHEC（CICC24187）、EPEC（CICC24189）均為標準菌株，購自CICC 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司和中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922、肺炎克雷伯菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌、綠膿桿菌、糞腸球菌、鮑曼不動桿菌、盲腸腸球菌、巴氏鏈球菌、摩氏摩根菌，均由四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室保存。

1.2 主要試劑和儀器 細菌基因組DNA 提取試劑盒，2×Taq PCR MasterMix，核酸染料；PCR 儀，核酸電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 引物的設(shè)計與合成 按食品安全國家標準（大腸桿菌GB 4789.6-2016）中EPEC 和EHEC 的escV、stx1、stx2、bfpB 基因序列設(shè)計引物，根據(jù)ETEC 和EAEC 的lt、sth、astA、aggR、pic基因序列設(shè)計引物，引物序列送至生工生物（上海）股份有限公司合成。

1.4 細菌DNA的提取 將保存的EPEC、EHEC、ETEC、EAEC 標準菌株分別接種于LB 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜后，取菌懸液1 mL，按照DNA 提取試劑盒說明書提取DNA。根據(jù)公式計算相應(yīng)拷貝數(shù)。

1.5 單一PCR擴增及反應(yīng)條件優(yōu)化 單一PCR反應(yīng)體系為25 μL，對單一PCR的引物添加量和退火溫度進行優(yōu)化，引物濃度設(shè)為10 μmol/L，引物添加量優(yōu)化范圍為0.1～2.0 μL，退火溫度優(yōu)化范圍為54～64 ℃。優(yōu)化結(jié)束后，選取最優(yōu)反應(yīng)條件進行單一PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，并將其余產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定。

1.6 多重PCR 擴增及反應(yīng)條件優(yōu)化 在單一PCR的基礎(chǔ)上，對多重PCR方法進行引物和退火溫度優(yōu)化。EPEC 和EHEC 多重PCR 反應(yīng)中，引物添加量優(yōu)化為0.1～2.0 μL，退火溫度優(yōu)化為57～65 ℃。ETEC 和EAEC 多重PCR 反應(yīng)中，引物添加量優(yōu)化為0.1～2.0 μL，退火溫度優(yōu)化為55～63 ℃。

1.7 多重PCR 特異性試驗 分別以EPEC 標準菌株、EHEC 標準菌株、ETEC 標準菌株、EAEC 標準菌株、金黃色葡萄球菌標準菌株、大熊貓源肺炎克雷伯菌、大熊貓源多殺性巴氏桿菌、大熊貓源奇異變形桿菌、大熊貓源綠膿桿菌、大熊貓源糞腸球菌、大熊貓源鮑曼不動桿菌、大熊貓源盲腸腸球菌、大熊貓源巴氏鏈球菌、大熊貓源摩氏摩根菌的DNA為模板進行多重PCR擴增，評估所建立的多重PCR方法的特異性。

1.8 多重PCR 敏感性試驗 提取EPEC 標準菌株、EHEC 標準菌株、ETEC 標準菌株、EAEC 標準菌株的DNA后，將DNA濃度調(diào)整為200 ng/mL，再用滅菌ddH2O 進行10 倍系列稀釋成6 個梯度濃度，將每組各個稀釋度等比例混合，按照1.6建立的多重PCR方法擴增，檢測多重PCR方法的敏感性。將4 種致瀉性大腸桿菌菌液進行10 倍系列稀釋成6 個梯度濃度，將每組各個稀釋度等比例混合，檢測多重PCR方法對菌液的敏感性。

1.9 多重PCR重復(fù)性試驗 利用優(yōu)化后的多重PCR 方法以相同的條件進行重復(fù)性試驗，重復(fù)8次，每次間隔一周。以此驗證本次建立的多重PCR方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.10 多重PCR 對人工模擬糞便污染樣品的檢測 EPEC標準菌株、EHEC標準菌株、ETEC標準菌株、EAEC 標準菌株過夜培養(yǎng)后調(diào)整濃度為2.0×101CFU/mL，取1 mL 混合菌液加入0.1 g 健康大熊貓糞便中進行糞便污染樣本模擬，并設(shè)為試驗組，設(shè)置生理鹽水（替換菌液）為陰性對照組。提取糞便樣本DNA，用所建立的多重PCR方法和單一PCR 方法對10 份人工模擬糞便污染樣品進行檢測，比較兩種方法的檢測結(jié)果，并計算兩者的符合率。

1.11 多重PCR對臨床腹瀉糞便樣本的檢測 采集大熊貓的腹瀉糞便樣本，增菌培養(yǎng)后提取DNA，進行大腸桿菌通用毒力基因phoA 檢測，再將檢測為陽性的DNA 模板作為多重PCR 的模板進行致病型鑒定檢測。采用本試驗建立的多重PCR方法和標準單一PCR方法對110份臨床大熊貓糞便樣品進行檢測，比較兩種方法的檢測結(jié)果，并計算兩者的符合率。

2 結(jié)果

2.1 單一PCR 方法的建立 經(jīng)過引物濃度、退火溫度等條件摸索，ETEC、EAEC、EHEC 和EPEC四種菌單一PCR 的最佳擴增體系和反應(yīng)條件見表1。

表1 單一PCR最佳反應(yīng)體系及條件

2.2 多重PCR擴增及反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果 經(jīng)過引物濃度、退火溫度等條件摸索，結(jié)果得出EPEC和EHEC 多重PCR 反應(yīng)的最佳體系為：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板量均為2.0 μL，escV、stx1、stx2 引物（10 μmol/L）量各0.2 μL，bfpB為0.4 μL，滅菌ddH2O 為8.5 μL；最佳退火溫度為61 ℃45 s（表2 和圖1A）。ETEC 和EAEC 多重PCR 反應(yīng)的最佳體系為：2×Taq PCR MasterMix12.5 μL，escV、stx1、stx2 引物（10 μmol/L）量各0.2 μL，bfpB為0.4 μL，DNA模板量均為2.0 μL，滅菌ddH2O 為8.5 μL；最佳退火溫度為59 ℃ 30 s（表3和圖1B）。

表2 EPEC和EHEC多重PCR反應(yīng)條件

表3 ETEC和EAEC多重PCR反應(yīng)條件

2.3 特異性試驗結(jié)果 多重PCR 方法特異性檢測結(jié)果顯示，EPEC 和EHEC 多重PCR 僅在escV（544bp）、stx1（244bp）、stx2（324bp）和bfpB（910bp）基因擴增為陽性；ETEC和EAEC多重PCR僅在astA（102 bp）、sth（171 bp）、lt（655 bp）、aggR（400 bp）和pic（1 111 bp）基因擴增為陽性。兩組多重PCR對肺炎克雷伯菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌、綠膿桿菌、糞腸球菌、鮑曼不動桿菌、盲腸腸球菌、巴氏鏈球菌、摩氏摩根菌均未觀察到擴增條帶，表明該方法的特異性較強。

2.4 敏感性試驗結(jié)果 在本試驗建立的多重PCR 方法中，EHEC 和EPEC 的最低DNA 檢測限為2.71×104拷貝/μL（圖2A），EAEC 的最低DNA檢測限為3.23×104拷貝/μL，ETEC 的最低檢測限為3.23×103拷貝/μL（圖2B）。菌液檢測中，EPEC和EHEC的最低檢測限為1.85×104CFU/mL，ETEC的最低檢測限為2.9×103CFU/mL，EAEC 的最低檢測限為2.62×104CFU/mL。以上結(jié)果表明該方法具有較高的敏感性。

2.5 重復(fù)性試驗結(jié)果 將提取的細菌基因組DNA利用建立好的EHEC和EPEC多重PCR方法與ETEC 和EAEC 多重PCR 方法在不同時間進行8次重復(fù)擴增。結(jié)果表明每次多重PCR結(jié)果都能擴增出相應(yīng)的目的片段，說明該方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性好。

2.6 人工模擬糞便污染樣品的檢測結(jié)果 采用本試驗建立的兩組多重PCR分別檢測，結(jié)果都能擴增出相應(yīng)的目的條帶，說明該方法對人工模擬糞便污染樣品的檢測結(jié)果較為準確。

2.7 臨床腹瀉糞便樣品的檢測結(jié)果 臨床樣品檢測結(jié)果顯示，均檢出phoA 陽性（圖3），將phoA陽性菌株分別用EHEC 和EPEC 多重PCR 方法、ETEC 和EAEC 多重PCR 方法進行4 種致 瀉性 大腸桿菌的檢測，結(jié)果檢出2 個樣品的escV 基因呈陽性，目的條帶為544 bp，其余擴增結(jié)果均為陰性（圖4A）。通過標準單一PCR 進行驗證，確證escV 基因在544 bp 處擴增出條帶（圖4B），且通過測序再次驗證了結(jié)果。本試驗建立的多重PCR 與標準單一PCR 的陽性符合率為100%，表明兩組多重PCR 方法均可用于臨床樣品的檢測。

圖3 部分臨床糞便樣本phoA基因擴增結(jié)果

圖4 臨床糞便樣品的多重PCR（A）和單一PCR（B）擴增結(jié)果

3 討論

大腸桿菌作為一種常見的條件致病菌，在大熊貓臨床糞便樣本中普遍存在。EPEC、EHEC、ETEC 和EAEC 可引起大熊貓以腹瀉癥狀為主的腸道疾?。?］。本研究建立了這4種不同致病性病原的多重PCR檢測體系，結(jié)果證明該檢測體系具有操作簡單、快速、靈敏、準確等優(yōu)點。

多重PCR 在擴增中的特異性和敏感性受到多方面因素的影響，本研究選用9 對毒力基因分別建立了2 組多重PCR，這9 對毒力靶標基因的分子質(zhì)量大小范圍不等，可以使目的片段分布在Marker 不同標尺大小的區(qū)域，不易造成對目的片段的誤判。對于多重PCR 反應(yīng)結(jié)果影響最大的因素是反應(yīng)體系的退火溫度和引物量。通過引物添加量的優(yōu)化，可以避免引物問題導(dǎo)致錯配和非特異性擴增［10］。Taq酶的添加量過低會造成產(chǎn)量降低，過高會導(dǎo)致非特異性擴增［11］。退火溫度的優(yōu)化可以提高PCR 擴增效率，在合適的范圍內(nèi)，較高的退火溫度的特異性較強［12］。延伸時間在多重PCR里與酶的含量有一定的關(guān)系，在合適范圍內(nèi)增加延伸時間可以增加產(chǎn)物的量。故本試驗對退火溫度、引物添加量、酶添加量和延伸時間進行了反復(fù)多次優(yōu)化，成功建立了2 組多重PCR體系，可以有效地檢測出樣本中的病原菌。張鐵男等［13］的研究結(jié)果顯示，ETEC 的檢測下限為2.6×104CFU/mL，本試驗方法的檢測下限為2.9×103CFU/mL，相比之下用本試驗建立的方法檢測ETEC更為敏感。

4 結(jié)論

本研究建立的2組多重PCR檢測方法具有良好的特異性、靈敏性和重復(fù)性，在臨床樣本檢測中提高了檢出效率，為大熊貓種群4 種致瀉性大腸桿菌感染的快速診斷及流行病學調(diào)查提供了技術(shù)支撐。