傳統(tǒng)食醋發(fā)酵區(qū)系中微生物群落及相互作用關系研究進展

劉稼鑫，葉曉婷，余永建*，王 柯，朱圓圓，于 振，韓 冬，劉 鵬，王玉芹

（江蘇科技大學糧食學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212100）

食醋具有悠久的歷史，目前已發(fā)展成為世界各國人民餐桌上必不可少的調味品。食醋的釀造主要依賴于微生物的發(fā)酵作用，微生物經(jīng)過特殊的生化活動將富含糖分的原料轉化為乙酸、乳酸等有機酸，并伴隨多種風味物質和功能性成分的生成，這造就了食醋獨特的風味[1]。

中國傳統(tǒng)食醋的發(fā)酵是一個多菌種參與下的復雜化學變化過程，發(fā)酵體系（醋醅）中的微生物可能來自原料、曲、種子以及自然環(huán)境，多種微生物共同形成穩(wěn)定的群落結構是保證食醋品質的基礎[2]。然而，自然接種、開放式的發(fā)酵工藝不利于得到品質穩(wěn)定的食醋產(chǎn)品，為實現(xiàn)食醋產(chǎn)業(yè)的轉型與升級，需要對傳統(tǒng)發(fā)酵模式進行改良。醋醅中豐富的微生物群落是形成食醋獨特風味品質最關鍵的影響因素，研究其群落結構、功能及群落成員間的互作關系對明晰發(fā)酵機理和有效調控發(fā)酵進程具有重要意義。

近年來，學者們針對食醋中微生物群落的結構和演替規(guī)律、主要釀造微生物的功能等方面開展了大量的研究工作，有助于初步認識發(fā)酵過程中微生物所扮演的角色，但是推動如此復雜的生物群體向特定方向演替的動力以及群體成員間的聯(lián)系對發(fā)酵結果產(chǎn)生的影響仍不明確[3]。為此，有關食醋中微生物相互作用關系的研究逐漸成為熱點。筆者認為，發(fā)酵體系內微生物的代謝作用及一系列基于代謝產(chǎn)物的種間互作關系是形成食醋優(yōu)良風味的關鍵，利用微生物的相互作用關系對食醋品質進行定向調控是食醋產(chǎn)業(yè)轉型升級的重要發(fā)展方向。本文以傳統(tǒng)食醋發(fā)酵體系中的關鍵微生物為研究對象，總結了傳統(tǒng)發(fā)酵食醋中微生物群落演替規(guī)律以及核心微生物間相互作用關系的研究進展（圖1），并為該領域未來的研究方向提出一些建議。以期從新的角度更為全面地揭示微生物對發(fā)酵過程的影響，同時希望能夠對微生物群落定向調控技術、合成微生物群落技術等手段的發(fā)展和產(chǎn)業(yè)化應用提供參考。

圖1 傳統(tǒng)食醋發(fā)酵體系中微生物群落及相互作用關系Fig.1 Microbial communities and their interaction in traditional vinegar fermentation process

1 傳統(tǒng)發(fā)酵食醋中微生物多樣性及演替規(guī)律

對傳統(tǒng)發(fā)酵食醋中微生物群落結構的研究有助于了解微生物間相互作用關系，明確微生物在發(fā)酵過程中所發(fā)揮的作用，對于改進生產(chǎn)工藝。提高生產(chǎn)效率以及新技術的研發(fā)和應用具有重要意義。近年來，對傳統(tǒng)食醋發(fā)酵過程中微生物群落結構的研究隨時間的推移愈發(fā)深入。

1.1 傳統(tǒng)發(fā)酵食醋中微生物群落的基本結構

食醋的釀造是由多種微生物共同參與的生物轉化過程。隨著發(fā)酵的進行，微生物不斷生長、繁殖，伴隨著微生物與環(huán)境、微生物與微生物之間復雜的相互作用，最終自發(fā)形成穩(wěn)定的群落結構，同時產(chǎn)生大量的風味物質和功能因子[4]。傳統(tǒng)發(fā)酵食醋粗放式多菌種混合發(fā)酵的工藝特點使得發(fā)酵過程中微生物的種類更加多樣，要探究微生物的相互作用關系對發(fā)酵的影響，首先要從解析微生物群落結構開始，這有助于有效定位參與食醋發(fā)酵過程的主要功能微生物。

近年來，隨著分子生物學、分子生態(tài)學等先進技術的發(fā)展，有關食醋中微生物群落的研究愈發(fā)豐富。為從整體上把握相關文獻的數(shù)量變化及時序規(guī)律，本文在Web of Science核心數(shù)據(jù)庫中按照TS＝（（（“*vinegar*”）NOT（“wood-vinegar”）AND（“*bacteria*”））OR（（“*vinegar*”）NOT（“woodvinegar”）AND（“*bacterial*”））OR（（“*vinegar*”）NOT（“wood-vinegar”）AND（“*microbe*”））OR（（“*vinegar*”）NOT（“wood-vinegar”）AND（“*microbiota*”）））進行高級檢索，時間跨度選擇“2011—2021”，最終共得到591 篇有關食醋中微生物群落的出版文獻，分別通過Origin和CiteSpace V軟件對檢索結果進行時序數(shù)量統(tǒng)計和關鍵詞共現(xiàn)分析（圖2）。

圖2 傳統(tǒng)發(fā)酵食醋中微生物群落相關研究發(fā)文數(shù)量趨勢圖（A）及關鍵詞共現(xiàn)圖（B）Fig.2 Annual trend in the number of research papers (A) about and keywords co-occurrence map (B) of microbial communities in traditional fermented vinegar

某一研究領域在特定時間段內研究熱度的變化可以通過發(fā)文數(shù)量的變化直觀地體現(xiàn)。由圖2A可以看出，相關研究數(shù)量在整體上呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢，近2 年發(fā)文量保持著較高水平，說明對于該領域的研究仍存在較大發(fā)展空間；在關鍵詞共現(xiàn)圖中，結點越大則該關鍵詞的詞頻越高，由圖2B可知，該領域近年來的研究熱點主要包括食醋中微生物的鑒定與定量、微生物群落的多樣性及演替規(guī)律以及發(fā)酵微生物對發(fā)酵過程的影響等。在對前人研究成果進行充分學習和整理的基礎上，本文對幾種代表性食醋中的主要微生物進行了總結（表1）。

表1 傳統(tǒng)發(fā)酵食醋中的主要微生物Table 1 Major microbes in traditional fermented vinegar

如表1 所示，在傳統(tǒng)發(fā)酵食醋中占主導地位的細菌為醋酸桿菌屬（A c e t o b a c t e r）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus），發(fā)酵初期醋酸桿菌的豐度一般較低（5%～8%），而由于乳酸桿菌多來自于酒醪，在發(fā)酵初期大多保持著較高的豐度（30%～90%），隨發(fā)酵的進行，醋酸桿菌的種群數(shù)量快速上升并最終保持較高水平，乳酸桿菌種群數(shù)量的變化趨勢則在不同種類食醋中呈現(xiàn)出一定的差異性，醋酸桿菌和乳酸桿菌在達到最大豐度時的占比范圍分別為30%～85%和50%～90%[7,9-10,15]。而在傳統(tǒng)發(fā)酵食醋中主要的真菌種類則存在較大差異，例如，山西老陳醋和鎮(zhèn)江香醋釀造過程中優(yōu)勢真菌屬為酵母菌屬（Saccharomyces），四川麩醋和天津獨流陳醋中曲霉屬（Aspergillus）居于主導地位，而涼州熏醋釀造過程中的優(yōu)勢真菌屬則為鏈格孢屬（Alternaria），這可能是地理氣候、釀造原料和工藝等因素的差異所導致[16]。

深入了解發(fā)酵過程中微生物群落結構的變化規(guī)律有助于明晰核心微生物在發(fā)酵體系中所扮演的角色，對于定向調控食醋風味和保障食醋品質都具有重要意義。而山西老陳醋、鎮(zhèn)江香醋作為中國傳統(tǒng)醋的杰出代表，在該方面的研究較為豐富。

1.2 山西老陳醋中微生物多樣性及演替規(guī)律

山西老陳醋作為傳統(tǒng)發(fā)酵食醋的代表之一，其釀制過程一般涉及制曲、淀粉糖化、乙醇發(fā)酵、醋酸發(fā)酵4 個主要階段，在對山西老陳醋微生物群落的研究過程中，最先建立的是對大曲中微生物群落結構的認識。Mucor、Absidia是大曲中的優(yōu)勢霉菌，主要負責釀制過程中淀粉、蛋白質等生物大分子的水解；Candida、Hansenula、Saccharomyces等酵母菌則與大曲產(chǎn)酯類和醇類的功能有關；醋酸桿菌、乳酸桿菌和芽孢桿菌是大曲中的主要細菌，能夠產(chǎn)生大量的有機酸、氨基酸和酯類物質，具有增強食醋風味和調節(jié)食醋口感等作用[17]。

隨著研究的深入，山西老陳醋釀制過程中微生物群落的結構和演替規(guī)律得以揭示。有研究者采用變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）研究山西老陳醋大曲及其他發(fā)酵階段微生物群落的多樣性和動態(tài)演替規(guī)律，發(fā)現(xiàn)大曲中部分真菌如Streptomyces、Eurotium、Monascus、Pichia和Bacillus、Staphylococcus等在乙醇發(fā)酵階段消失，Weissella、Lactobacillus、Streptococcus、Saccharomyces在乙醇發(fā)酵后期居于主導地位。隨著發(fā)酵的進行，Weissella等微生物轉向消亡，而Acetobacter、Lactobacillus、Saccharomycopsis、Alternaria在醋酸發(fā)酵階段保持了較高豐度[6]。隨著高通量測序技術和組學技術在發(fā)酵領域的應用，山西老陳醋中微生物群落的演替規(guī)律及其與風味物質的關系愈發(fā)明確。山西老陳醋醋酸發(fā)酵過程可分為3 個階段（早期：第0～4天；中期：第5～21天；后期：第22～26天）。在早期，Pantoea、Pediococcus、Lactococcus、Rhizobium的數(shù)量顯著增加，且主要與發(fā)酵過程中體系內的醇、醛、酮、酯等揮發(fā)性物質的含量有關；在中期，Lactobacillus成為優(yōu)勢菌，乳酸桿菌的存在導致體系內乳酸含量迅速上升；當發(fā)酵進行至后期時，乳酸桿菌數(shù)量顯著減少，Acetobacter、Komagataeibacter、Kroppenstedtia居于主導地位，促進了食醋中有機酸特別是乙酸的積累以及醛類、酯類、乙偶姻等風味物質的生成。值得關注的是，相較于采用DGGE方法所得到的檢測結果，研究者通過第2代測序技術首次在醋酸發(fā)酵階段發(fā)現(xiàn)Lactococcus和Komagataeibacter[7]，說明采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術探索發(fā)酵過程中菌群結構仍存在一定局限性，隨著第2代測序技術的發(fā)展，傳統(tǒng)發(fā)酵食醋中微生物群落的結構和演替規(guī)律將被更為全面地揭示。山西老陳醋不同發(fā)酵階段微生物群落的演替規(guī)律及主要微生物所占比例如圖3所示。

圖3 山西老陳醋不同發(fā)酵階段微生物群落的演替規(guī)律（A、C）及主要微生物所占比例（B、D）[8]Fig.3 Succession of microbial community in different fermentation stages of Shanxi aged vinegar (A and C) and proportion of major microorganisms (B and D)[8]

1.3 鎮(zhèn)江香醋中微生物多樣性及演替規(guī)律

鎮(zhèn)江香醋是我國最具代表性的四大名醋之一，其釀制過程主要采用固態(tài)分層發(fā)酵工藝，成品經(jīng)陳釀后具有香氣濃郁、酸而不澀的特點[18]。早期對香醋中微生物群落的研究依賴于純培養(yǎng)技術，但由于受到培養(yǎng)條件、種群豐度等因素的限制，目前在實驗室中僅能夠得到少部分與產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、致渾濁、致腐敗等因素相關的微生物，主要為醋酸桿菌、乳酸桿菌和芽孢桿菌等[19-20]。

傳統(tǒng)研究方法的局限性導致了人們對香醋中微生物群落結構的認識不足，近年來，隨著免培養(yǎng)技術在食品發(fā)酵領域的應用范圍不斷拓寬，香醋中微生物群落結構也變得更加清晰。通過免培養(yǎng)法對鎮(zhèn)江香醋中微生物群落結構進行分析，發(fā)現(xiàn)醋醅中除含有豐富的醋酸桿菌和乳酸桿菌外，還存在Sinorhizobium、Enterobacter、Gluconacetobacter等此前采用純培養(yǎng)方法未能檢測到的物種[21]。但免培養(yǎng)的DGGE法由于檢測通量較小，能夠得到的操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）仍十分有限。

隨著第2代測序技術的出現(xiàn)，食醋中的微生物群落信息得以被深入挖掘，從而有效揭示了醋酸發(fā)酵過程中微生物群落的演替規(guī)律。通過對醋酸發(fā)酵過程中微生物群落的動態(tài)變化進行檢測，研究者發(fā)現(xiàn)Acetobacter和Lactobacillus是發(fā)酵過程中的主要細菌，其中Lactobacillus主要來源于酒醪，其相對豐度在發(fā)酵初期呈上升趨勢，并在發(fā)酵第8天達到最大，而后逐漸降低。Acetobacter則主要來源于醋醅，其相對豐度在發(fā)酵前期較低，但始終呈上升趨勢，在發(fā)酵第8天左右超過乳酸桿菌，在發(fā)酵后期占據(jù)主導地位；真菌群落則主要以Aspergillus和Alternaria為主，Aspergillus的相對豐度隨著發(fā)酵開始逐漸上升，并在發(fā)酵第7天后趨于穩(wěn)定。Alternaria在發(fā)酵前3 d迅速生長，并在第4～7天始終保持著高豐度，之后其相對豐度開始迅速下降并維持在較低水平，直至發(fā)酵結束[9]。組學技術的發(fā)展為進一步揭示發(fā)酵過程中菌群的功能及演替規(guī)律提供了新的工具，有研究者利用宏基因組學技術分析了鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵階段微生物群落的結構和功能，不僅明確了醋酸階段的優(yōu)勢細菌和優(yōu)勢真菌，Acetobacter、Lactobacillus等7 個核心微生物與香醋中揮發(fā)性風味物質的關系也被揭示[10]（圖4）。測序技術的發(fā)展使得醋醅中微生物群落顯示出了比以往更豐富的多樣性和更高的物種豐度，證實了醋酸發(fā)酵過程是一個由多種微生物共同參與的復雜進程[22]。在發(fā)酵過程中微生物群落的演替規(guī)律與風味物質變化規(guī)律展現(xiàn)出了驚人的一致性，發(fā)酵體系中微生物間存在的復雜互作關系可能是促成這種變化規(guī)律的動力之一，對此需要更進一步的研究和探索。

圖4 鎮(zhèn)江香醋中微生物群落結構（A）及核心功能微生物分析（B）[9-10]Fig.4 Distribution of microbiota (A) and analysis of core microbiota (B)in Zhenjiang aromatic vinegar[9-10]

2 傳統(tǒng)發(fā)酵食醋中微生物間相互作用

在微生物主導下的發(fā)酵體系中，微生物之間存在的復雜相互作用關系是群落保持穩(wěn)定以及產(chǎn)生風味物質的重要基礎[23]。在食醋釀造過程中，醋醅中的微生物與環(huán)境、微生物與微生物之間的相互作用共同構成了一個不斷演替變化且相對穩(wěn)定的內環(huán)境[24]，然而，體系內微生物組成過于復雜也為探究其中某幾種微生物間的相互影響帶來了困難。目前，國內外研究者大都基于純培養(yǎng)微生物在異位以及模擬原位條件下的共培養(yǎng)結果對固態(tài)發(fā)酵食醋中微生物的相互作用關系及其內在機制進行解析，所涉及的微生物主要包括酵母菌與醋酸桿菌、酵母菌與乳酸桿菌、乳酸桿菌與醋酸桿菌、芽孢桿菌與醋酸桿菌和乳酸桿菌等。其中，酵母菌作為酒曲中的主要微生物，在制酒階段發(fā)揮了重要作用，酵母菌與其他微生物之間的互作關系大多在發(fā)酵前期對食醋品質產(chǎn)生影響[25-28]。隨著釀造進行至醋酸發(fā)酵階段，乳酸桿菌和醋酸桿菌成為優(yōu)勢微生物，二者間的互作關系在整個互作體系中居于主導地位。此外，芽孢桿菌等低豐度微生物在整個發(fā)酵過程中始終存在，芽孢桿菌與醋醅中優(yōu)勢微生物之間的互作關系及其對食醋品質的影響同樣值得探究[29-30]。

2.1 酵母菌與其他微生物之間的相互作用關系

傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵食醋在引入醋酸桿菌進行醋酸發(fā)酵之前，往往需要先向糯米、高粱等原料中加入大曲、酒藥等發(fā)酵劑進行乙醇發(fā)酵，大曲和酒藥作為乙醇發(fā)酵階段重要的糖化劑和發(fā)酵劑，其中含有豐富的微生物群落，主要包括霉菌、酵母菌和細菌3 類，對于上述微生物各自在乙醇發(fā)酵中的作用則可表述為霉菌的糖化作用、酵母菌的發(fā)酵作用和細菌的生香作用[31]。酵母菌作為乙醇發(fā)酵階段不可或缺的一種微生物，能夠通過厭氧發(fā)酵將原料中的糖轉化為乙醇和二氧化碳，是推動發(fā)酵進程的重要動力[27]。

2.1.1 酵母菌的發(fā)酵作用為醋酸桿菌提供充足底物

酵母菌在乙醇發(fā)酵階段將糖轉化為乙醇，醋酸桿菌再利用乙醇代謝產(chǎn)生乙酸，該過程基于代謝產(chǎn)物呈遞的簡單相互作用模型如圖5所示。Chakraborty等[32]發(fā)現(xiàn)，Saccharomyces cerevisisae與Acetobacter aceti混合培養(yǎng)能夠顯著提高食醋生產(chǎn)過程中的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。Wang Zhi等[33]發(fā)現(xiàn)Saccharomyces cerevisiae和Acetobacter pasteurianus在發(fā)酵罐中混合培養(yǎng)具有高產(chǎn)乙酸特性，并探索了二者在發(fā)酵罐中共培養(yǎng)的最佳發(fā)酵條件。這主要是由于釀酒酵母是一種發(fā)酵型酵母，能夠通過自身發(fā)酵作用分解糖并產(chǎn)生乙醇，所產(chǎn)生的乙醇作為醋酸桿菌發(fā)酵的底物促進了醋酸桿菌的生長發(fā)育，進而促進了乙酸等有機酸在食醋中的積累。

圖5 傳統(tǒng)發(fā)酵食醋中酵母菌與醋酸桿菌間營養(yǎng)級聯(lián)示意圖Fig.5 Schematic diagram of trophic cascade between yeast and acetic acid bacteria in traditional vinegar fermentation process

2.1.2 酵母菌與乳酸桿菌之間的相互作用促進風味物質的形成

為探究乙醇發(fā)酵階段酵母菌與乳酸桿菌間相互作用關系對食醋品質的影響，蔣忠等[28]以大米為原料，進行了乳酸桿菌和酵母菌的共生發(fā)酵實驗，結果表明，酵母菌和乳酸桿菌在一定條件下共培養(yǎng)有利于提高發(fā)酵體系中乙醇和乳酸的含量。Chen Yang等[34]比較了由S.cerevisiae和Lactobacillus plantarum混合發(fā)酵與S.cerevisiae單菌發(fā)酵（對照）所得橘子果醋品質的差異，發(fā)現(xiàn)S.cerevisiae和L.plantarum混合發(fā)酵所得果醋中甲酸、乳酸等有機酸和酯類、醇類、醛類等風味物質的含量均高于對照。同時，相較于單菌發(fā)酵，混合發(fā)酵還能夠顯著提高果醋的抗氧化活性和氨基酸等滋味物質的含量。李雅茹[27]經(jīng)篩選得到山西老陳醋發(fā)酵過程中性能優(yōu)良的酵母菌S.cerevisiaeJL421和乳酸桿菌L.plantarumJL7并將二者進行共培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)與純培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)條件下體系中總酸含量明顯升高，有機酸、乙酸乙酯、異戊醇等風味物質的種類和濃度明顯增加，乙偶姻等特征性功能成分的含量較純培養(yǎng)也有了明顯提升。由此推斷，乳酸桿菌的加入不僅可能會對酵母菌的發(fā)酵活動具有一定促進作用，同時也有利于乳酸桿菌自身生產(chǎn)有機酸和揮發(fā)性風味物質。

值得注意的是，酵母菌和乳酸桿菌同樣是中國傳統(tǒng)酒飲料釀造過程中主要的功能性微生物，對傳統(tǒng)酒飲料中二者相互作用關系的研究有助于進一步了解其對發(fā)酵進程的影響。熊君燕等[35]研究清香型白酒固態(tài)發(fā)酵過程中主要酵母菌和乳酸桿菌的相互作用時發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌和酵母菌共培養(yǎng)會對乙醇產(chǎn)量和代謝產(chǎn)物的組成產(chǎn)生影響，并且這種影響會因菌種選擇的不同而表現(xiàn)為促進或抑制兩種不同形式。這可能是由于共培養(yǎng)過程中乳酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)酸抑制了某些不耐酸酵母菌的生長[36]，而另一些酵母菌如畢赤酵母可以產(chǎn)生大量酯類物質，因此對低pH值、高滲環(huán)境適應力較強[37]。另外，由于共培養(yǎng)還存在營養(yǎng)物質的競爭和代謝產(chǎn)物的交換，這可能是導致不同培養(yǎng)組合中微生物生長狀態(tài)和風味物質組成不同的另一原因。與上述研究結果類似，洪家麗等[38]研究乳酸桿菌對黃酒釀造過程中酵母菌的生長及風味物質的影響，發(fā)現(xiàn)除干酪乳桿菌外，實驗所選用的多種乳酸桿菌對酵母菌的生長均有促進作用，同時對黃酒中特征風味物質的含量及感官品質的提升具有積極影響。

基于以上分析，乙醇發(fā)酵過程中乳酸桿菌和酵母菌間的相互作用可能會促使乳酸、乙酸乙酯等風味物質以及乙偶姻等功能性因子在成熟酒醪中積累，并隨著酒醪一起參與醋酸發(fā)酵過程，在乙醇發(fā)酵階段選擇合適的菌種進行微生物強化將會對食醋品質的提升產(chǎn)生積極影響。

2.2 乳酸桿菌與醋酸桿菌之間的相互作用關系

2.2.1 乳酸桿菌與醋酸桿菌間相互作用的多樣性乳酸桿菌和醋酸桿菌均為醋酸發(fā)酵過程中重要的功能微生物。前期研究表明，乳酸桿菌和醋酸桿菌不僅在數(shù)量上占據(jù)著絕對的優(yōu)勢，也是乙酸、乳酸等有機酸以及乙酸乙酯、2,3-丁二酮等多種風味物質的重要生物來源[39]，二者間的相互作用關系會對發(fā)酵結果產(chǎn)生一定影響。

為探究這種影響，牟俊[40]利用微生物培養(yǎng)的方法研究了山西老陳醋中主要乳酸桿菌Lactobacillus helveticus與醋酸桿菌A.pasteurianus間的相互作用。在共培養(yǎng)過程中，A.pasteurianus和L.helveticus呈現(xiàn)出一種一方對另一方存在有害影響從而促進自身生長代謝的偏害共生關系；與之相反，Zhang Meng等[41]發(fā)現(xiàn)在共培養(yǎng)過程中，L.plantarum對A.pasteurianus的正常生長活動影響很小，推測L.plantarum和A.pasteurianus對碳源的需求不同，L.plantarum以葡萄糖為主要的能量來源，而A.pasteurianus則主要通過代謝體系中的乙醇維持自身的生長發(fā)育。上述研究者在進行乳酸桿菌與醋酸桿菌共培養(yǎng)實驗時均以某單一菌株為實驗對象，而實驗菌株選擇的不同可能是導致實驗結果存在較大差異的原因。同樣以乳酸桿菌和醋酸桿菌為研究對象，孫紅等[42]在研究由鎮(zhèn)江香醋醋醅中分離得到的醋酸桿菌和乳酸桿菌間相互作用關系時發(fā)現(xiàn)，不同種乳酸桿菌和醋酸桿菌在共培養(yǎng)過程中所表現(xiàn)出的相互作用關系有所差異。同時，該研究者還通過比較相同的兩種菌株在異位和模擬原位條件下共培養(yǎng)對代謝產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)Acetobacter pomorumG15-6和L.helveticusM3-1、L.plantarumM10-1等菌株共培養(yǎng)在異位和模擬原位條件下表現(xiàn)出了不同的代謝情況。因此，該研究者推斷，乳酸桿菌和醋酸桿菌間的相互作用存在種間特異性和環(huán)境特異性，即同一發(fā)酵環(huán)境下，不同種醋酸桿菌和乳酸桿菌之間存在多種相互作用關系，相同菌種之間的相互作用關系也可能因為發(fā)酵環(huán)境的變化而發(fā)生改變。該結論與此前的猜測一致，即乳酸桿菌與醋酸桿菌之間存在多種相互作用關系，這種差異形成的原因可能是菌種組合的多樣性，同時也說明在發(fā)酵過程中可以通過對發(fā)酵菌株進行篩選，定向引導發(fā)酵向有益于提高食醋品質的方向進行。

2.2.2 乳酸桿菌與醋酸桿菌之間的相互作用關系對食醋品質的影響

食醋發(fā)酵過程中乳酸桿菌與醋酸桿菌間的相互作用大多產(chǎn)生積極、正向的結果，因此，乳酸桿菌和醋酸桿菌的菌種組合作為一種有效的微生物強化劑受到廣泛關注。Zhang Qiang等[43]通過分析天津獨流陳醋釀造過程中細菌與發(fā)酵的關系，提出醋酸桿菌、乳酸桿菌和片球菌是獨流陳醋發(fā)酵過程中的主要功能菌，并在后續(xù)實驗中將Pediococcus acidilacticiAAF1-5作為微生物強化劑添加至發(fā)酵醋醅中，結果發(fā)現(xiàn)P.acidilacticiAAF1-5的加入能夠促進醋醅中醋酸桿菌和乳酸桿菌的生長及風味物質的積累，與對照組相比，食醋中不揮發(fā)性酸、乳酸和氨基酸含量分別提高了53%、14%、32%，有效提高了食醋品質。Lu Zhenming等[44]通過應用宏基因組測序技術和克隆文庫分析，在物種水平上揭示了醋醅中丁二酮/乙偶姻代謝途徑的微生物分布差異，從代謝物交流的角度解析了該代謝途徑中微生物的互作模式，發(fā)現(xiàn)巴氏醋桿菌和乳酸桿菌可能是產(chǎn)生乙偶姻的主要功能菌。在后續(xù)共培養(yǎng)實驗中，研究者發(fā)現(xiàn)A.pasteurianusG3-2與Lactobacillus brevis4-22及A.pasteurianusG3-2與Lactobacillus fermentumM10-3的共培養(yǎng)組合能夠顯著提高體系內乙偶姻的含量，將A.pasteurianusG3-2、L.brevis4-22等菌株添加至原位狀態(tài)下的發(fā)酵醋醅中，可使醋醅中乙偶姻的含量得到顯著提高。其中，相較于對照組（（6.8±0.1）mg/g），添加A.pasteurianusG3-2與L.f e r m e n t u mM 1 0-3 的醋醅中乙偶姻含量高達（12.5±1.2）mg/g，證明醋酸桿菌和乳酸桿菌間的互作關系對食醋品質具有積極影響。與之類似，Chai Lijuan等[45]探討了傳統(tǒng)谷物醋醋酸發(fā)酵過程中醋酸桿菌和乳酸桿菌用作生物強化劑的發(fā)酵潛力，研究者將從醋醅中分離出的5 株乳酸桿菌和1 株醋酸桿菌分別進行純培養(yǎng)和共培養(yǎng)，以比較不同培養(yǎng)方式下其代謝產(chǎn)物的差異，發(fā)現(xiàn)實驗所選用的L.plantarumM1-6和A.pasteurianusG3-2在共培養(yǎng)條件下能夠通過協(xié)同作用高產(chǎn)乙偶姻。將兩種菌株應用于原位條件下的生物強化實驗中，發(fā)現(xiàn)向醋醅中接種L.plantarumM1-6和A.pasteurianusG3-2后，食醋中乙酸、乳酸、乙偶姻、乙酸乙酯、乳酸乙酯、川芎嗪等特征風味物質和功能因子的含量明顯提高，進一步證實了乳酸桿菌和醋酸桿菌作為微生物強化劑應用于食醋釀造的潛力。

傳統(tǒng)食品發(fā)酵體系中生物強化戰(zhàn)略的關鍵在于通過利用微生物的互作關系對釀造微生物群落實現(xiàn)有效調控，具體可以表述為：分析微生物群落的結構和功能，分離關鍵核心微生物；解析發(fā)酵體系中功能性微生物群落的互作關系；在此基礎上，預測并驗證這些關鍵核心微生物的代謝特征，在實際生產(chǎn)中對其生產(chǎn)效率進行進一步評估；最終目標是構建具有良好發(fā)酵性能的多細胞功能體系，以實現(xiàn)縮短發(fā)酵時間、提高發(fā)酵速度、提升產(chǎn)品品質等目標。

2.2.3 乳酸桿菌與醋酸桿菌共發(fā)酵提升食醋品質的作用機制

乳酸桿菌與醋酸桿菌之間的相互作用關系多通過代謝產(chǎn)物實現(xiàn)，隨著組學技術的發(fā)展和風味物質檢測手段的完善，二者通過代謝相互作用影響食醋品質的作用機制愈發(fā)明確。酶是一種具有催化活性的代謝產(chǎn)物，其催化作用在微生物代謝活動中扮演了重要角色。酶參與相互作用的案例之一為對谷物醋中乳酸含量的調節(jié)，Chai Lijuan等[46]探究了傳統(tǒng)谷物醋發(fā)酵過程中L-/D-型乳酸積累的微生物強化和調控，在此過程中，研究者發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌為醋酸發(fā)酵過程中乳酸的主要生產(chǎn)者，然而隨著發(fā)酵的進行和乳酸的積累，醋醅中的醋酸桿菌能夠通過分泌乳酸脫氫酶催化乳酸逆轉化為丙酮酸，從而調節(jié)成品醋中L-/D-型乳酸含量（圖6）。該結論在另一項研究中得到驗證，并判斷醋酸桿菌所分泌的乳酸脫氫酶為膜結合酶[47]。此外，乳酸桿菌與醋酸桿菌共培養(yǎng)過程中體系2,3-丁二酮水平的提高也被認為與酶有關，在二者共培養(yǎng)過程中，隨著體系內乙酸、乳酸及檸檬酸等代謝產(chǎn)物的積累，丙酮酸/2,3-丁二酮這一代謝通路中編碼多種相關酶基因的表達得到促進，進而提高了終產(chǎn)物2,3-丁二酮的含量[42,44]。2,3-丁二酮是生成乙偶姻的重要前體物質，因此推測該代謝通路可能是乳酸桿菌與醋酸桿菌共培養(yǎng)能夠高產(chǎn)乙偶姻的主要原因。另有研究者發(fā)現(xiàn)在共培養(yǎng)過程中，乳酸桿菌胞外代謝產(chǎn)物中的某種蛋白可能具有氨肽酶的功能特性，能夠在發(fā)酵過程中通過水解蛋白產(chǎn)生游離氨基酸作為醋酸桿菌生長代謝所需的營養(yǎng)物質，從而促進醋酸桿菌的發(fā)酵作用[48]。有機酸是食醋發(fā)酵過程中另一種特征代謝產(chǎn)物，乳酸桿菌、醋酸桿菌能夠產(chǎn)生豐富的有機酸，發(fā)酵體系內有機酸的積累又可能反過來影響微生物的代謝活動，最終影響食醋中氨基酸、乙偶姻等風味物質的含量。例如，在山西老陳醋醋酸發(fā)酵過程中醋酸桿菌能夠高產(chǎn)乙酸，體系中乙酸的積累能夠促進醋醅中乳酸桿菌和醋酸桿菌的磷酸戊糖途徑以及氨基酸、核酸和能量的代謝，產(chǎn)生大量氨態(tài)氮，從而有助于微生物抵御高酸性的外部環(huán)境，多余的氨類物質則會因濃度梯度向胞外遷移，最終促進多種氨基酸在食醋中的積累[49]。

圖6 醋酸發(fā)酵階段的乳酸和乙醇代謝途徑[46]Fig.6 Metabolic pathways of lactic acid and ethanol in acetic acid fermentation stage[46]

綜上所述，首先，乳酸桿菌與醋酸桿菌之間的相互作用關系有利于促進體系中乙酸、乳酸等有機酸的快速積累和對其定向調控；其次，共培養(yǎng)條件下某些酶活力的增強和相關基因的強表達有利于促進特定代謝通路的表達，從而提高體系內功能性成分的含量；由微生物產(chǎn)酸引起的脅迫作用和代謝產(chǎn)生的生物酶能夠提高食醋中氨基酸類風味物質的含量，從而使食醋具有更加豐富的滋味。綜上，乳酸桿菌與醋酸桿菌間的相互作用關系是形成食醋優(yōu)良品質的重要因素，二者聯(lián)合應用于食醋釀造將具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2.3 芽孢桿菌與醋酸桿菌、乳酸桿菌之間的相互作用關系

現(xiàn)有研究表明，部分在體系中微量存在的微生物種群同樣對提高食醋品質具有重要意義。芽孢桿菌作為重要的發(fā)酵微生物，能夠通過自身代謝作用產(chǎn)生大量的乙偶姻，最終提高體系中川芎嗪等功能性物質的含量[50]（圖7）。

圖7 芽孢桿菌代謝產(chǎn)生乙偶姻以及川芎嗪的機制[50]Fig.7 Mechanisms of acetoin and tetramethylpyrazine production in Bacillus sp.[50]

賈瑞娟等[51]將篩選自山西老陳醋中的優(yōu)良芽孢桿菌與醋酸桿菌和乳酸桿菌共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)多株菌株共培養(yǎng)條件下，體系中揮發(fā)性香氣成分含量和種類最為豐富，具有水果香氣的乙酸乙酯、香蕉香氣的異戊酸乙酯等山西老陳醋特征揮發(fā)性風味物質含量明顯優(yōu)于各菌株純培養(yǎng)，二者在食醋中的含量分別提高了78.65%和49.26%，證明優(yōu)良芽孢桿菌與醋酸桿菌、乳酸桿菌協(xié)同發(fā)酵有利于山西老陳醋風味的形成。Zhang Liqiang等[52]在研究Bacillus amyloliquefaciens對四川麩醋品質的影響時發(fā)現(xiàn)，當B.amyloliquefaciens被用作生物強化劑添加至四川麩醋發(fā)酵大曲中后，大曲中有機酸和風味物質含量有所提高；值得關注的是，改良后大曲中乙偶姻和川芎嗪含量明顯高于對照組，說明B.amyloliquefaciens參與發(fā)酵能夠有效提高食醋中乙偶姻及川芎嗪等功能性物質的含量。在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，這種改變可能源自菌種自身的代謝特性，芽孢桿菌屬中多個菌種已被證明可以通過EMP代謝產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合產(chǎn)生α-乙酰乳酸[29]，α-乙酰乳酸是2,3-丁二醇-2,3-丁二酮-3-羥基-2-丁酮生物合成途徑的重要前體物質[39]，芽孢桿菌能夠通過該代謝途徑大量合成乙偶姻；另一種假設認為醋醅中的乳酸桿菌等微生物能夠將生物大分子分解為小分子物質，該生命活動為芽孢桿菌提供了高濃度的代謝底物，促使芽孢桿菌產(chǎn)生大量2,3-丁二酮[53]；另外，有研究者認為醋酸發(fā)酵過程中乳酸桿菌和醋酸桿菌代謝產(chǎn)生的乳酸、乙酸、檸檬酸等有機酸的積累也可能有利于促進丙酮酸/2,3-丁二酮代謝通路的表達，最終提高體系中雙乙酰和乙偶姻的含量[54]。

芽孢桿菌作為一種高產(chǎn)風味物質和功能因子的微生物，其在食醋釀造過程中有較好的應用前景，且其微生物強化作用對發(fā)酵食品品質的積極影響已經(jīng)在白酒釀造中得到了充分驗證[55-56]。但同樣需要認識到，食醋醋醅和白酒大曲在外部環(huán)境、所含成分、微生物結構上都存在較大差異，所篩選的芽孢桿菌能否與醋醅中原始菌群和諧共生、能否適應醋醅所提供的高酸性環(huán)境以及對終產(chǎn)物品質的影響等都是衡量其能否被用于生物強化所需考慮的因素。

3 結 語

微生物群落及其相互作用關系是形成傳統(tǒng)發(fā)酵食醋風味品質的關鍵，近年來，研究者們對此開展了豐富的研究。本文綜述了傳統(tǒng)發(fā)酵食醋中微生物群落的結構及核心功能微生物間存在的多種相互作用，同時對微生物互作關系對食醋品質的影響進行了總結。

微生物廣泛存在于食醋釀造過程中，微生物群落之間復雜的相互作用關系是維持其結構穩(wěn)定的基礎[57]，但是要完全解析食醋中各種微生物間復雜的相互作用關系還比較困難，合成微生物群落的產(chǎn)業(yè)化應用條件還不夠完備，目前研究還存在以下幾方面欠缺：1）對于醋醅環(huán)境中微量存在或不可培養(yǎng)的微生物對發(fā)酵所做貢獻的研究較少；2）缺少對發(fā)酵區(qū)系中整個微生物群落內部互作機制的系統(tǒng)性研究；3）對合成微生物群落在實際生產(chǎn)中應用條件的探索不夠全面。當前對于微生物強化的實驗步驟已經(jīng)較為明確，可以總結為：預測核心功能微生物、基因組引導核心功能微生物分離、實際生產(chǎn)驗證3 個步驟，但對于生物強化過程中的強化時間、強化接種量等條件因素仍缺乏深入探討。相信隨著微生物培養(yǎng)技術和組學技術的不斷發(fā)展，微生物群落間復雜的互作關系將得到進一步完善，相關發(fā)酵技術也將隨著研究的深入不斷進步。