界面蛋白對(duì)水酶法提取植物油脂過(guò)程中乳狀液穩(wěn)定性影響的研究進(jìn)展

李天賜，陳毅保，劉昆侖，陳復(fù)生，楊趁仙*，段曉杰，朱婷偉

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

水酶法以水作為萃取和分離的介質(zhì)，通過(guò)酶水解植物細(xì)胞壁和油體界面膜結(jié)構(gòu)從而破壞植物細(xì)胞，根據(jù)非油成分對(duì)油、水的親和力差異以及油、水的比重不同，實(shí)現(xiàn)同時(shí)分離油脂和蛋白質(zhì)。與傳統(tǒng)的油脂提取方法（壓榨法和溶劑萃取法）相比，其反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)品安全、能耗低、所得油脂質(zhì)量高且可以最大程度保留蛋白質(zhì)，避免植物蛋白資源浪費(fèi)[1-5]。近年來(lái)，水酶法作為一種高效、安全、環(huán)保的提取植物油脂的方法，已經(jīng)得到了大量的研究[6-10]。然而，水酶法提取植物油脂過(guò)程中，經(jīng)酶水解作用后，部分油體被破壞釋放出油脂，油滴進(jìn)入水相，油料蛋白質(zhì)吸附至油脂表面，在攪拌作用下形成穩(wěn)定的乳狀液，大部分油以乳狀液的形式存在，少部分留存在水相和渣相中[11-13]。乳狀液中含有少量的蛋白質(zhì)、磷脂、碳水化合物等成分，其中蛋白質(zhì)和磷脂以表面活性劑的形式存在，可以形成具有黏彈性的界面膜結(jié)構(gòu)，防止油滴聚集，從而限制了油脂的提取[14-16]。因此，對(duì)水酶法提取植物油脂形成的乳狀液進(jìn)行破乳是提高油產(chǎn)量的關(guān)鍵[17-19]。目前，對(duì)乳狀液進(jìn)行破乳的方法主要包括物理法[20]、化學(xué)法[21]、酶法[22]以及復(fù)合法[23]；關(guān)于不同植物（如以花生[24-25]、大豆[21,26]、菜籽[27-28]等為原料）油脂乳狀液破乳工藝流程的研究也相對(duì)成熟；然而，乳狀液破乳的機(jī)理亟需進(jìn)一步深入研究，這就需要對(duì)維持乳狀液穩(wěn)定的界面膜成分進(jìn)行分析。

蛋白質(zhì)作為一種天然的表面活性劑，在水酶法提取植物油的過(guò)程中，其非極性親油基團(tuán)會(huì)迅速吸附在油滴表面，形成一層或者幾層界面膜，通過(guò)降低界面張力使油滴之間相互分離，阻礙了油滴的聚集；同時(shí)，蛋白質(zhì)的極性親水基團(tuán)會(huì)與連續(xù)的水相結(jié)合，使得油滴穩(wěn)定地分布在水相之中，形成穩(wěn)定的水包油（O/W）乳狀液[29-30]。本文將介紹乳狀液的組成及其穩(wěn)定性機(jī)理，并重點(diǎn)闡述界面蛋白濃度、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響，從界面蛋白結(jié)構(gòu)的變化角度分析其破乳機(jī)理，為探明乳狀液的破乳機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 乳狀液的組成及其穩(wěn)定機(jī)理

水酶法提取植物油脂過(guò)程中形成的乳狀液的主要成分是油和水，此外還含有少量的表面活性劑——蛋白質(zhì)和磷脂等其他成分。其中，蛋白質(zhì)是組成乳狀液界面膜最主要的大分子物質(zhì)，在水酶法提取植物油脂的過(guò)程中，具有兩親性的蛋白質(zhì)作為表面活性劑吸附至油-水界面（圖1A），在界面上展開(kāi)重排，暴露出內(nèi)部的疏水性氨基酸，再通過(guò)共價(jià)交聯(lián)和非共價(jià)相互作用形成具有擴(kuò)張性、抗壓縮性和高黏彈性的界面膜（圖1B），在靜電相互作用（圖1C）和空間位阻作用（圖1D）下可以有效地防止油滴聚并，維持乳狀液的穩(wěn)定性[31-33]。乳狀液油-水界面膜上的蛋白質(zhì)由油體內(nèi)源蛋白、貯藏蛋白和一些小分子質(zhì)量蛋白組成[14,34-35]；其中，油體內(nèi)源蛋白對(duì)維持油體乳液穩(wěn)定性起到關(guān)鍵性作用，主要包括油體蛋白（15～26 kDa）、油體鈣蛋白（27 kDa）和油體甾醇蛋白（39～41 kDa）[36-38]。激光掃描共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）是觀察乳狀液中蛋白質(zhì)和油脂分布最常用的方法。Niu Ruihao等[16]利用CLSM觀察到在花生乳狀液中蛋白質(zhì)分散在油脂體的表面，而油脂體的內(nèi)部則被油脂填充，這表明蛋白質(zhì)形成了一層界面膜包裹著油脂，阻礙了油脂的釋放，維持了乳狀液的穩(wěn)定性，圖2為油體的立體結(jié)構(gòu)和3 種蛋白質(zhì)的鑲嵌模型。Li Pengfei等[39]采用CLSM觀察了花生乳狀液在破乳過(guò)程中的變化，原始乳狀液中油滴被緊密地包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，油滴的粒徑逐漸增大，包裹油滴的蛋白膜被破壞。Miriani等[40]利用熒光法研究了大豆乳狀液中和油-水界面上β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)在油-水界面膜上都發(fā)生了變化。這些結(jié)果表明蛋白質(zhì)對(duì)維持乳狀液的穩(wěn)定性起著關(guān)鍵性的作用。

圖1 乳狀液的穩(wěn)定機(jī)理[31]Fig.1 Stability mechanism of emulsion[31]

圖2 油體立體結(jié)構(gòu)以及油體蛋白鑲嵌模型[41-44]Fig.2 Stereoscopic structure of oil body and mosaic model of oil body protein[41-44]

2 界面蛋白對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響

乳狀液的穩(wěn)定性很大程度上取決于吸附在油-水界面膜上的表面活性劑的濃度、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。在乳狀液形成的過(guò)程中，具有兩親性的蛋白質(zhì)吸附在油-水界面上，形成一層或者多層界面膜，同時(shí)，界面蛋白分子的相互重疊及其雙電層的重疊產(chǎn)生了空間相互作用和靜電相互作用，這兩種排斥力可以有效地防止油滴的絮凝和聚集，從而維持乳狀液的穩(wěn)定性[45-46]。

2.1 界面蛋白濃度對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響

界面蛋白濃度是決定乳狀液穩(wěn)定的重要參數(shù)之一。界面蛋白濃度越高，油滴表面覆蓋程度越高，越有利于降低兩相界面張力，從而使蛋白質(zhì)乳化性更強(qiáng)，乳狀液更穩(wěn)定[47]。Tcholakova等[48]認(rèn)為由單層蛋白膜穩(wěn)定的乳狀液所需的最低界面蛋白濃度為1～2 mg/m2。Chabrand等[21]測(cè)定得到水酶法提取大豆油過(guò)程中形成的乳狀液中界面蛋白濃度為14.64 mg/m2，明顯高于1～2 mg/m2，這一結(jié)果表明水酶法提取過(guò)程中可以形成多層膜、穩(wěn)定性強(qiáng)的乳狀液。同樣地，Zhang Shaobing等[49]利用水酶法提取花生油時(shí)，所得乳狀液的界面蛋白濃度為7.92 mg/m2，也明顯高于穩(wěn)定乳狀液所需的最低蛋白濃度，說(shuō)明花生油的表面可能覆蓋多層蛋白質(zhì)，可以有效防止油滴之間的聚集，從而形成穩(wěn)定的乳狀液。Liu Chen等[47]對(duì)花生原料分別進(jìn)行干法粉碎和濕法粉碎，研究這兩種預(yù)處理對(duì)水酶法提取花生油過(guò)程中乳狀液的影響，兩種方法得到的乳狀液界面蛋白濃度分別為（7.02±0.21）mg/m2和（10.71±0.19）mg/m2，兩種預(yù)處理方法得到的乳狀液油滴表面均形成了多層蛋白膜，且濕法粉碎得到的乳狀液穩(wěn)定性更強(qiáng)。

2.2 界面蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響

2.2.1 界面蛋白分子質(zhì)量分布對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響

乳狀液的穩(wěn)定性與其油-水界面膜上蛋白質(zhì)的類型和結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系。Chabrand等[21]對(duì)大豆乳狀液采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，發(fā)現(xiàn)乳狀液中含有兩種大豆蛋白：一種是含有α-、α’-和β-亞基的β-伴大豆球蛋白（分子質(zhì)量120～200 kDa）；另一種是含有酸性和堿性亞基的大豆球蛋白（300～380 kDa）。另外，還發(fā)現(xiàn)了幾條由兩親性N-末端、C-末端和疏水中心組成的油球蛋白（分子質(zhì)量18～24 kDa）。在水酶法提取大豆油的過(guò)程中，高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)和油球蛋白形成多層界面膜共同維持乳狀液的穩(wěn)定。胡淼等[50]通過(guò)比較大豆分離蛋白和乳狀液界面蛋白的亞基分布，發(fā)現(xiàn)在水酶法提取植物油脂過(guò)程中，由于蛋白酶的作用，與大豆分離蛋白相比，乳狀液界面蛋白亞基分布條帶變窄，48～63 kDa范圍內(nèi)的條帶全部消失，17～20 kDa條帶顏色變淺，乳狀液的多肽譜圖顯示留存的最主要條帶分子質(zhì)量為11～17 kDa。Dias等[51]通過(guò)SDS-PAGE分析了杏仁原始乳狀液及對(duì)其進(jìn)行化學(xué)破乳和酶法破乳后界面蛋白的低分子質(zhì)量多肽譜，發(fā)現(xiàn)原始乳狀液和化學(xué)破乳乳狀液都含有高分子質(zhì)量的杏仁蛋白（含α-亞基和β-亞基）和較小的油球蛋白，由分子質(zhì)量分別為38～40 kDa和20 kDa的兩條主帶組成，這兩條主帶約占泳道面積的52%，而經(jīng)過(guò)酶法破乳后，杏仁蛋白的堿性亞基完全降解，酸性亞基的含量也顯著減少，且大部分多肽分子質(zhì)量都小于10 kDa。酶處理可以通過(guò)水解界面蛋白降低蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，有效地破壞界面蛋白的結(jié)構(gòu)，破壞界面膜的完整性，從而促進(jìn)油滴的聚集[52-53]。Schroder等[54]比較了小分子肽（＜5 kDa）和大分子肽（＞5 kDa）對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)大分子肽比小分子肽更容易吸附至界面膜上，相對(duì)分子質(zhì)量較大的界面吸附肽具有較長(zhǎng)的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，能夠在油滴表面形成保護(hù)層，表現(xiàn)出較好的抗絮凝和抗聚集作用，從而易于形成穩(wěn)定的乳狀液[20]。

2.2.2 界面蛋白的二硫鍵含量對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響

在水酶法提取植物油脂形成乳狀液的過(guò)程中，界面膜上的蛋白質(zhì)通過(guò)巰基-二硫化物的交換作用與連續(xù)相中蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，因此二硫鍵含量的升高有助于形成穩(wěn)定性強(qiáng)的黏彈性膜。Zhang Shaobing等[49]分別比較了花生蛋白和花生乳狀液中界面蛋白、乳狀液中未吸附蛋白、破乳后乳狀液中肽和水相中肽的二硫鍵含量，發(fā)現(xiàn)乳狀液中界面蛋白的二硫鍵含量顯著高于其他來(lái)源的蛋白質(zhì)，經(jīng)酶解破乳后乳脂層中肽的二硫鍵含量高于水相中二硫鍵含量。遲延娜[55]通過(guò)比較界面蛋白亞基在還原態(tài)和非還原態(tài)下的差異發(fā)現(xiàn)，花生乳狀液中的大分子界面蛋白在酶解后降解為小分子的亞基，這些亞基在二硫鍵的作用下形成了肽段聚集體（分子質(zhì)量10～50 kDa），然后吸附在油滴表面，形成了具有黏彈性的界面膜，從而維持乳狀液的穩(wěn)定性。這些結(jié)果表明二硫鍵在維持乳狀液穩(wěn)定上發(fā)揮重要的作用。二硫鍵是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的共價(jià)鍵，存在于蛋白質(zhì)和多肽中，可以通過(guò)氧化還原反應(yīng)與巰基相互轉(zhuǎn)化影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其功能性質(zhì)，從而影響乳狀液的穩(wěn)定[56-57]。Wu Mangang等[58]研究發(fā)現(xiàn)油脂體界面蛋白與周圍蛋白質(zhì)之間形成的二硫鍵有助于維持乳狀液的穩(wěn)定，并且可以增強(qiáng)其流變性和機(jī)械性。劉向軍[59]研究花生乳狀液中二硫鍵以及巰基含量的變化，發(fā)現(xiàn)花生乳狀液界面吸附蛋白巰基含量低于花生分離蛋白的巰基含量，但二硫鍵含量顯著高于花生分離蛋白。通過(guò)對(duì)花生乳狀液界面吸附蛋白的分子質(zhì)量分布研究發(fā)現(xiàn)，油體蛋白與分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子在二硫鍵的作用下結(jié)合，使更多的蛋白質(zhì)吸附至油滴表面，同時(shí)，蛋白質(zhì)中氨基酸疏水殘基圍繞著二硫鍵形成了局部疏水區(qū)域，這都有利于提高乳狀液油-水界面穩(wěn)定性。

2.2.3 界面蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響

界面蛋白的結(jié)構(gòu)與功能有著密切的聯(lián)系。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括大量的折疊片狀結(jié)構(gòu)以及少量的α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲，其中折疊片狀結(jié)構(gòu)包括β-折疊和β-轉(zhuǎn)角。Li Pengfei等[60]發(fā)現(xiàn)與原始花生乳狀液界面蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相比，經(jīng)蛋白酶酶解后乳狀液中界面蛋白的α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量均出現(xiàn)降低的現(xiàn)象，而無(wú)規(guī)卷曲含量明顯上升。同樣地，胡淼等[50]研究發(fā)現(xiàn)，大豆乳狀液界面蛋白的α-螺旋和β-折疊的含量較高，而β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量較少。Dias等[52]比較了水劑法和水酶法兩種方法對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)水酶法處理組蛋白質(zhì)的無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量顯著高于水劑法處理組，而α-螺旋結(jié)構(gòu)含量低于水劑法處理組，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量不存在顯著性差異。乳狀液界面吸附蛋白有序結(jié)構(gòu)以α-螺旋和β-折疊為主，而β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲為無(wú)序結(jié)構(gòu)，由于酶的作用，乳狀液中蛋白質(zhì)無(wú)序結(jié)構(gòu)含量增加，形成的分子結(jié)構(gòu)則更為疏松，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降，乳狀液穩(wěn)定性也隨之降低[61-63]。

2.3 界面蛋白的性質(zhì)對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響

2.3.1 界面蛋白的水解度與乳狀液穩(wěn)定性的關(guān)系

界面蛋白的理化性質(zhì)對(duì)乳狀液的穩(wěn)定性起著關(guān)鍵的作用，界面蛋白的水解度可影響其表面疏水性從而影響乳狀液的穩(wěn)定性。Zhang Shaobing等[64]選用了多種蛋白酶對(duì)水相萃取技術(shù)提取花生油過(guò)程形成的乳狀液進(jìn)行破乳研究，測(cè)定了不同酶處理?xiàng)l件下乳狀液中游離油含量和水解度。結(jié)果表明，這些蛋白酶都不同程度地降低了乳狀液的穩(wěn)定性，并且游離油得率隨著界面蛋白水解度的增加而升高，說(shuō)明油脂提取率與蛋白質(zhì)的水解度呈正相關(guān)。界面蛋白經(jīng)蛋白酶酶解后，分子質(zhì)量減小并從界面膜上脫落，乳狀液界面膜結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞，從而引起油滴聚集導(dǎo)致破乳發(fā)生。Zhang Shaobing等[28]利用水酶法同時(shí)提取菜籽中油脂和蛋白質(zhì)，研究了水酶法提取過(guò)程中乳狀液的穩(wěn)定性與水解度的關(guān)系。結(jié)果表明，在較低水解度（degree of hydrolysis，DH）（≤10%）條件下并未得到游離油，但與對(duì)照（未添加Alcalase 2.4L）相比，乳狀液的油回收率略有提升，且有限水解可以提高乳狀液的乳化能力；當(dāng)DH≥10%（尤其是10%～12%的范圍內(nèi)），游離油的含量顯著增高。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被充分水解后，乳狀液穩(wěn)定性下降，乳狀液中的油脂得以釋放。Li Pengfei等[60]分別利用3 種堿性蛋白酶（Alcalase 2.4L、Preotex 6L、Protex 7L）及木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶（Protex 50FP）對(duì)花生乳狀液進(jìn)行酶法破乳，并且對(duì)破乳過(guò)程中乳狀液中蛋白質(zhì)的水解度和分子質(zhì)量分布進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，各種酶處理的蛋白質(zhì)水解度均增加，在120 min時(shí)，風(fēng)味蛋白酶（Protex 50FP）的水解度和油回收率最高；然而，對(duì)分子質(zhì)量分布的研究發(fā)現(xiàn)，低分子質(zhì)量（＜1 000 kDa）占比最高的是木瓜蛋白酶，而風(fēng)味蛋白酶（Protex 50FP）的占比最低，且在高分子質(zhì)量（＞3 000 kDa）和中分子質(zhì)量（1 000～3 000 kDa）中，風(fēng)味蛋白酶的占比均最高，該結(jié)果表明風(fēng)味蛋白酶（Protex 50FP）的水解效率低于木瓜蛋白酶（Papain），這一結(jié)果與水解度的結(jié)果相矛盾。作者認(rèn)為產(chǎn)生這一差異有兩個(gè)原因：一是風(fēng)味蛋白酶在pH 4.5條件下易形成聚集體從而降低了水解效率；二是由于風(fēng)味蛋白酶（Protex 50FP）是一種內(nèi)肽酶-外肽酶復(fù)合體，相較于其他內(nèi)肽酶更易于將蛋白質(zhì)水解成游離的氨基酸，而水解度是根據(jù)游離氨基酸含量測(cè)定的，因此經(jīng)風(fēng)味蛋白酶處理的蛋白質(zhì)的水解度更高。值得注意的是，研究界面蛋白對(duì)乳狀液穩(wěn)定性影響時(shí)，需要同時(shí)測(cè)定蛋白質(zhì)的水解度和分子質(zhì)量分布，以便更好地理解乳狀液的穩(wěn)定機(jī)制[65-67]。

2.3.2 界面蛋白的表面疏水性與乳狀液穩(wěn)定性的關(guān)系

表面疏水性與蛋白質(zhì)的水解度有著緊密的關(guān)聯(lián)，酶水解作用對(duì)蛋白質(zhì)的表面疏水性有著雙重影響。一方面，在酶水解作用條件下，埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)在水解作用下暴露，增加了其表面疏水性；另一方面，蛋白質(zhì)埋藏的疏水基團(tuán)暴露，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間在疏水相互作下發(fā)生聚集，疏水基團(tuán)重新埋藏，這可能會(huì)導(dǎo)致表面疏水性的降低[68]。Zhang Shaobing等[49]研究了不同來(lái)源蛋白質(zhì)的表面疏水性，發(fā)現(xiàn)乳狀液中界面蛋白的表面疏水性最高，這是界面蛋白中的主要成分油球蛋白所致，因?yàn)橛颓虻鞍缀幸粋€(gè)由72 個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的中心疏水區(qū)，而非油球蛋白在界面上發(fā)生變形，暴露其埋藏的疏水性氨基酸，從而增強(qiáng)了其表面疏水性。Li Pengfei等[39]分別使用木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶（Protex 50FP）對(duì)花生乳狀液進(jìn)行處理，木瓜蛋白酶處理組乳狀液的表面疏水性顯著低于風(fēng)味蛋白酶處理組，然而，兩組界面蛋白的表面疏水性都隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，說(shuō)明在酶水解的作用下，蛋白質(zhì)間相互作用增強(qiáng)，導(dǎo)致了分子重排，將大部分的疏水鍵限制在聚集體的內(nèi)部。該研究同時(shí)表明，風(fēng)味蛋白酶處理組界面蛋白的疏水性之所以更高，是由于在pH 4.5時(shí)發(fā)生了蛋白質(zhì)的聚集，阻礙了蛋白酶的水解效率，使得堿性花生蛋白（分子質(zhì)量18～24 kDa）具有更多的疏水基團(tuán)，表現(xiàn)出更高的表面疏水性。

2.3.3 界面蛋白的乳化性質(zhì)與乳狀液穩(wěn)定性的關(guān)系

蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)是指蛋白質(zhì)能夠作為乳化劑促進(jìn)油與水形成穩(wěn)定的乳狀液，包括乳化活性和乳化穩(wěn)定性。在促進(jìn)油、水混合的過(guò)程中，單位質(zhì)量蛋白質(zhì)能夠穩(wěn)定油-水界面的面積稱為蛋白質(zhì)的乳化活性，而乳化穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)維持油、水不分離的乳化特性[69]。胡存書(shū)等[29]比較了花生乳狀液中界面吸附蛋白與3 種分離蛋白（花生分離蛋白、菜籽分離蛋白和大豆分離蛋白）的乳化性質(zhì)，其中，界面吸附蛋白的乳化活性顯著高于其他3 種分離蛋白，其乳化穩(wěn)定性與花生分離蛋白沒(méi)有顯著性差異，卻顯著高于菜籽分離蛋白和大豆分離蛋白，表現(xiàn)出較好的乳化性質(zhì)。劉向軍[59]分別提取花生乳狀液中的界面蛋白、水相中的非吸附蛋白和分離蛋白，以不同蛋白質(zhì)作為乳化劑，構(gòu)建了水與花生油模擬體系，考察不同種類蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)的差異，發(fā)現(xiàn)界面吸附蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性顯著高于水相中非吸附蛋白和花生分離蛋白，表明界面吸附蛋白具有更好的乳化活性，在油-水界面更易形成單層或者多層的表面膜，將油滴緊密地包裹在內(nèi)部，并且可以使油滴穩(wěn)定地分布在水相之中，形成穩(wěn)定的水包油型乳狀液。

3 水酶法提取植物油脂乳狀液破乳機(jī)理研究進(jìn)展

3.1 物理方法破乳

物理破乳主要采用加熱、微波、冷凍-解凍、高壓CO2和高壓蒸汽等方法對(duì)乳狀液進(jìn)行破乳。王文睿等[70]對(duì)水酶法提取的大豆乳狀液進(jìn)行微波處理，在微波電磁場(chǎng)的作用下，乳狀液的油-水界面膜發(fā)生薄化，油滴在電場(chǎng)作用下逐漸聚集，從而發(fā)生破乳。李麗紅等[71]對(duì)核桃油乳狀液進(jìn)行加熱處理，隨著溫度的升高，乳狀液的破乳率也增加，這是由于溫度升高，乳狀液分子的熱運(yùn)動(dòng)加劇，同時(shí)，界面上的蛋白質(zhì)發(fā)生變性，促進(jìn)了油滴的聚集和蛋白質(zhì)的沉淀，導(dǎo)致界面膜的黏度下降，乳狀液的破乳率也隨之增加。王瑛瑤等[20]分別利用微波、加熱和冷凍-解凍方法對(duì)花生乳狀液進(jìn)行破乳研究，發(fā)現(xiàn)冷凍-解凍的破乳效果最好，破乳率高達(dá)91.6%，這可能是由于在冷凍時(shí)乳狀液中的油滴發(fā)生結(jié)晶現(xiàn)象，相鄰兩油滴的脂肪結(jié)晶體會(huì)穿透水相，進(jìn)而刺破界面膜，導(dǎo)致油滴的聚集[72]。高壓CO2是一種新興的物理破乳方法，主要通過(guò)使界面蛋白發(fā)生沉淀而實(shí)現(xiàn)破乳。韓宗元等[73]通過(guò)透射電子顯微鏡觀察經(jīng)過(guò)高壓CO2處理后的乳狀液，發(fā)現(xiàn)界面蛋白膜發(fā)生破裂，蛋白質(zhì)之間發(fā)生聚集沉淀，被界面蛋白包裹的油脂得以釋放，并且逐漸聚集，從而發(fā)生破乳。高壓蒸汽破乳法主要是作用于界面蛋白，一方面通過(guò)蒸汽放熱使界面蛋白變性；另一方面通過(guò)施加壓力使界面蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，以此來(lái)破壞界面膜的穩(wěn)定性，達(dá)到破乳的目的[74]。

3.2 化學(xué)方法破乳

化學(xué)法破乳是利用無(wú)機(jī)鹽、酸堿或者乙醇對(duì)乳狀液進(jìn)行處理，通過(guò)影響乳狀液的黏度、Zeta-電位、平均粒徑及其分布等性質(zhì)，破壞界面膜組成的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)，從而影響乳狀液的穩(wěn)定性。無(wú)機(jī)鹽的種類和濃度可以顯著影響乳狀液的穩(wěn)定性。吳海波等[75]研究CaCl2、CaSO4、MgCl2和NaCl對(duì)大豆乳狀液的破乳效果，并分析了CaCl2對(duì)乳狀液黏度、Zeta-電位和粒徑的影響，發(fā)現(xiàn)CaCl2的破乳率最高，且乳狀液的黏度、Zeta-電位和粒徑都受到Ca2＋濃度的影響。由于界面蛋白可以在油-水界面發(fā)生解離，因此乳狀液油滴表面存在電位差和雙電層[31]，Ca2＋與界面蛋白解離形成的負(fù)電荷結(jié)合發(fā)生離子反應(yīng)，使乳狀液的負(fù)電荷量下降；乳狀液的黏度隨Ca2＋濃度的升高而下降，促進(jìn)了油滴間的聚集，油滴的粒徑逐漸增大，乳狀液的穩(wěn)定性下降。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處易發(fā)生沉淀，包裹油滴的蛋白膜完整性被破壞，因此，通過(guò)調(diào)節(jié)pH值可以有效提高破乳率。Gao Yuhang等[76]研究發(fā)現(xiàn)，在堿性條件下，花生乳狀液油-水界面的外源性蛋白質(zhì)被洗脫，界面蛋白含量下降，相鄰的油滴之間發(fā)生聚集，花生乳狀液的穩(wěn)定性下降。Liu Chen等[30]分別考察了pH值和NaCl濃度對(duì)乳狀液的Zeta-電位影響，隨著pH值的升高，乳狀液的正電荷數(shù)量逐漸減少，并且在等電點(diǎn)時(shí)正負(fù)電荷數(shù)量相同，之后隨著pH值增加，負(fù)電荷的數(shù)量逐漸提升；NaCl濃度對(duì)乳狀液的Zeta-電位有重要影響，Na＋的加入抵消了界面蛋白的負(fù)電荷，降低了靜電排斥力，從而可以降低乳狀液的穩(wěn)定性，并且Na＋離子還可以通過(guò)改變界面蛋白的結(jié)構(gòu)和氨基酸的含量來(lái)影響乳狀液的穩(wěn)定性。乙醇法破乳利用乙醇通過(guò)以下兩方面的作用破壞界面膜的穩(wěn)定性來(lái)提高破乳率：一方面通過(guò)乙醇親水端對(duì)界面蛋白親水端的吸附作用；另一方面利用乙醇使界面膜上的蛋白質(zhì)發(fā)生變性[77]。李楊等[78]分別比較了常溫乙醇、乙醇冷浴和冷凍解凍破乳，發(fā)現(xiàn)乙醇冷浴破乳率可以達(dá)到93.64%，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察乙醇浴破乳后乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，界面蛋白發(fā)生變性沉淀，油滴粒徑顯著增加，油脂得到最大程度的釋放。綜上所述，化學(xué)法破乳是通過(guò)酸堿度或者有機(jī)溶劑破壞油-水界面的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)從界面膜上脫離；或者通過(guò)添加帶正電荷的離子，中和油-水界面的負(fù)電荷，減弱油滴之間的靜電排斥作用，促進(jìn)油滴之間的聚集。

3.3 生物酶法破乳

酶法破乳是水酶法提取植物油脂過(guò)程中最經(jīng)常使用的生物方法。兩親性的蛋白質(zhì)作為界面膜上的主要組成成分，其含量、組成和結(jié)構(gòu)對(duì)乳狀液的穩(wěn)定性起著決定性的作用，因此，蛋白酶的加入可以有效地改變界面膜的結(jié)構(gòu)，提高乳狀液的破乳率。Niu Ruihao等[79]研究了木瓜蛋白酶對(duì)水酶法提取的花生乳狀液破乳效果的影響，在最優(yōu)條件（酶解溫度55 ℃、料液比1∶3、酶活力1 400 U/g、酶解時(shí)間3 h）下，游離油得率最高可達(dá)92.39%。在木瓜蛋白酶的作用下，油滴表面的外源蛋白和固有蛋白被水解為小分子肽，油滴的外表面不再受到界面蛋白提供的靜電斥力和空間位阻的保護(hù)，油滴之間相互吸引、融合，從而使游離油的得率提高，如圖3所示。Wu等[2]分別使用風(fēng)味蛋白酶（Protex 50FP）和磷脂酶對(duì)乳狀液進(jìn)行破乳研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白酶的破乳效果更好，蛋白酶可以將界面蛋白進(jìn)一步水解為短肽，破壞了界面膜的完整性，界面膜的強(qiáng)度不足以防止油滴的絮凝而發(fā)生破乳。

圖3 油體乳狀液酶法破乳機(jī)理Fig.3 Instability mechanism of oil body emulsion

3.4 復(fù)合破乳法

復(fù)合破乳法是將物理、化學(xué)和酶法破乳技術(shù)兩兩聯(lián)合或者多種結(jié)合在一起處理乳狀液。胡麗麗等[27]將離心法和無(wú)水乙醇法聯(lián)用對(duì)菜籽油乳狀液進(jìn)行破乳，經(jīng)正交試驗(yàn)得到最優(yōu)提取條件：無(wú)水乙醚添加量為70%，調(diào)節(jié)pH 4.0，9 000 r/min下離心30 min。最優(yōu)條件下游離油的提取率為98.05%。張根生等[80]對(duì)南瓜籽乳狀液首先進(jìn)行了酶法破乳，經(jīng)酶法破乳后，蛋白膜被水解，小油滴被釋放聚集成更大的油滴，破乳率達(dá)到了88.39%；然后對(duì)經(jīng)酶法破乳的乳狀液進(jìn)行酸化處理，將pH值調(diào)節(jié)至南瓜籽蛋白的等電點(diǎn)4.5，乳狀液的穩(wěn)定性進(jìn)一步降低，油脂得到了更充分的釋放，破乳率達(dá)到了95.47%。

4 結(jié) 語(yǔ)

破壞乳狀液的穩(wěn)定性是提高水酶法提取植物油脂含量的關(guān)鍵，因此需要對(duì)維持乳狀液穩(wěn)定性的機(jī)理進(jìn)行深入了解，基于乳狀液油-水界面膜上的成分及其結(jié)構(gòu)和特性等方面的研究，可以更好地理解乳狀液的穩(wěn)定機(jī)制。維持乳狀液的穩(wěn)定性不是單一因素起決定性作用，而是多因素共同作用的結(jié)果。界面蛋白作為一種蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)決定了功能，在破乳研究過(guò)程中，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵的變化必然引起蛋白質(zhì)性質(zhì)（水解度、表面疏水性和乳化能力）的改變，同時(shí)也是導(dǎo)致乳狀液的理化性質(zhì)和流變性質(zhì)發(fā)生變化的原因。然而，針對(duì)乳狀液界面蛋白與其他組分的交互作用對(duì)乳狀液穩(wěn)定性影響機(jī)制還需要深入研究，目前仍缺乏對(duì)油脂、界面蛋白和磷脂三者交互作用對(duì)乳狀液穩(wěn)定性影響的研究；其次，雖然已有大量關(guān)于乳狀液破乳方法（如物理法、化學(xué)法和生物酶法）的研究，但是未來(lái)仍需要尋求破乳率更高、成本更低、更適合工業(yè)化生產(chǎn)的破乳方法；此外，對(duì)水酶法提取植物油脂乳狀液破乳分子機(jī)理研究都是未來(lái)研究重點(diǎn)，這都有助于提高乳狀液的破乳率，實(shí)現(xiàn)水酶法提取植物油脂和蛋白質(zhì)的推廣應(yīng)用。