蛋白質(zhì)-香氣化合物結(jié)合作用的研究方法及影響因素研究進(jìn)展

陳 臣，周琪琪，于海燕，婁新曼，李 永，田懷香*

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418）

香氣是食品風(fēng)味的重要組成部分，是食品特征風(fēng)味的來源之一。香氣化合物的分子質(zhì)量相對較小（＜400 Da），主要包括醛類、酮類、醇類、酯類、羧酸、含硫化合物、呋喃和吡嗪等[1]。蛋白質(zhì)被公認(rèn)為食品中的營養(yǎng)和功能成分，它不僅為人體提供必需的氨基酸，而且具有發(fā)泡、乳化、膠凝和風(fēng)味結(jié)合等功能特性。除了作為食品的風(fēng)味前體物質(zhì)外，蛋白質(zhì)可以通過物理截留方式抑制香氣化合物的動(dòng)態(tài)變化，或通過各種相互作用力影響食品中香氣化合物的保留與釋放[2]。

蛋白質(zhì)與香氣化合物之間的結(jié)合作用主要包括非共價(jià)鍵合、共價(jià)鍵合和傳質(zhì)效應(yīng)，但由于食品組織結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性以及蛋白質(zhì)和香氣化合物的自身特性和結(jié)構(gòu)差異，兩者結(jié)合作用的本質(zhì)與規(guī)律性研究仍是一個(gè)系統(tǒng)且復(fù)雜的過程。蛋白質(zhì)對揮發(fā)性香氣成分的結(jié)合作用主要取決于香氣化合物和蛋白質(zhì)自身的性質(zhì)，但食品基質(zhì)中調(diào)味用糖、油脂和鹽等配料也會(huì)通過改變蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)和構(gòu)象等特性，從而影響蛋白質(zhì)-香氣化合物的結(jié)合作用程度[3]。此外，香氣化合物在食品熱加工過程中容易與蛋白質(zhì)發(fā)生解離，損失較快，從而導(dǎo)致風(fēng)味強(qiáng)度減弱；食品中某些成分氧化產(chǎn)生異味物質(zhì)與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合，這些反應(yīng)均會(huì)縮短產(chǎn)品的保質(zhì)期[4]。由此可見，如何使蛋白質(zhì)以最佳的形式結(jié)合和釋放揮發(fā)性成分并保持產(chǎn)品理想的風(fēng)味顯得尤為重要。因此，了解蛋白基質(zhì)與香氣化合物的結(jié)合作用，開發(fā)新的方法或模型來穩(wěn)定香氣化合物的結(jié)合并控制釋放，對保持食品的感官品質(zhì)具有重要意義，同時(shí)也能為食品工業(yè)快速適應(yīng)市場對營養(yǎng)、美味食品的需求提供技術(shù)基礎(chǔ)。

基于此，本文綜述了蛋白質(zhì)與香氣化合物的結(jié)合機(jī)制、測定方法和常用理論模型的研究進(jìn)展，并探討了影響蛋白質(zhì)-香氣化合物結(jié)合作用的主要因素。在此基礎(chǔ)上，提出了改善風(fēng)味與蛋白質(zhì)結(jié)合能力的對策，以期為利用新工藝生產(chǎn)風(fēng)味優(yōu)良的健康食品提供思路。

1 蛋白質(zhì)與香氣化合物的結(jié)合作用機(jī)制

根據(jù)結(jié)合方式的不同，蛋白質(zhì)主要通過非共價(jià)鍵合、共價(jià)鍵合和傳質(zhì)效應(yīng)3 種方式實(shí)現(xiàn)對揮發(fā)性成分的吸附[5]（圖1），進(jìn)而改變頂空中香氣化合物的濃度。其中，蛋白質(zhì)與香氣化合物的非共價(jià)鍵合作用主要由疏水相互作用、范德華力、氫鍵和靜電相互作用力來提供，這些作用方式均是可逆結(jié)合，常應(yīng)用于減少加工過程的風(fēng)味損失，并使風(fēng)味成分在食用過程中重新釋放[6]。Bi Shuang等[7]對3 種特定香氣化合物與豌豆蛋白的結(jié)合類型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)豌豆蛋白與正己醛的非共價(jià)鍵合作用主要是由氫鍵提供的結(jié)合作用力，而其與(E)-2-辛烯醛和(Z)-2-戊烯-1-醇的作用方式主要是疏水相互作用。對食品蛋白基質(zhì)和關(guān)鍵香氣貢獻(xiàn)組分結(jié)合作用特性進(jìn)行解析，可為富含蛋白食品風(fēng)味的調(diào)控以及感官品質(zhì)的提高奠定研究基礎(chǔ)。

圖1 蛋白質(zhì)與香氣化合物結(jié)合作用機(jī)制Fig.1 Binding mechanism between proteins and aroma compounds

蛋白質(zhì)-香氣化合物結(jié)合過程中存在可逆的非共價(jià)鍵合作用和不可逆的共價(jià)鍵合作用。共價(jià)鍵合作用主要包括醛基（—CHO）、羰基（C＝O）與氨基酸殘基（—NH2和—SH）的共價(jià)交聯(lián)[8]。研究表明，隨著胰蛋白酶含量的增加，肌球蛋白對醛、酮類化合物的吸附能力增強(qiáng)，主要是由于氨基活性、巰基含量的增加等導(dǎo)致蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)展開，從而增強(qiáng)了蛋白與揮發(fā)性成分的結(jié)合行為[9]。含硫氨基酸中的巰基既可以參與維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的二硫鍵的形成，也可以與香氣化合物發(fā)生共價(jià)結(jié)合[8]。另外，賴氨酸殘基側(cè)鏈的ε-氨基也會(huì)與醛類化合物通過形成席夫堿發(fā)生結(jié)合。Anantharamkrishnan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，乳蛋白與醛類物質(zhì)、硫醇和呋喃之間可通過席夫堿、二硫鍵的生成和邁克爾加成反應(yīng)發(fā)生共價(jià)鍵合。此外，一些胺類揮發(fā)物與天冬氨酸、谷氨酸的末端羧基之間形成酰胺鍵，也屬于共價(jià)鍵合[11]。這些結(jié)合作用的形成速度或慢或快，均能夠?qū)е率称凤L(fēng)味特征的變化。

香氣化合物在不同相之間的傳質(zhì)阻力會(huì)受到基質(zhì)質(zhì)地與微觀結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)而導(dǎo)致分配系數(shù)和分子遷移率有所不同。蛋白基質(zhì)黏度的增加或形成的凝膠結(jié)構(gòu)均會(huì)產(chǎn)生傳質(zhì)效應(yīng)，從而減緩香氣物質(zhì)在食用過程中的釋放[12]。其中，增加黏度不僅會(huì)阻礙食品組分的混合，而且會(huì)阻礙香氣化合物在口腔中的流動(dòng)，從而降低揮發(fā)性物質(zhì)釋放到口腔的表面濃度[13]。此外，蛋白質(zhì)發(fā)生凝膠化也會(huì)減少風(fēng)味物質(zhì)的釋放，從而導(dǎo)致香氣強(qiáng)度降低。不同種類的食品球狀蛋白（如乳清蛋白和大豆球蛋白等）加熱后發(fā)生變性，結(jié)構(gòu)展開，通過暴露的活性位點(diǎn)相互作用，形成具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠，進(jìn)而對香氣化合物產(chǎn)生物理截留[14]。因此，通過改變揮發(fā)性成分的傳質(zhì)阻力可在一定程度上改變風(fēng)味的整體平衡，最終對風(fēng)味的釋放產(chǎn)生有利影響。

2 蛋白質(zhì)與香氣化合物結(jié)合作用的研究方法與常用理論模型

依據(jù)分析原理，可將蛋白質(zhì)-香氣化合物結(jié)合作用的研究方法大致分為基于香氣化合物頂空濃度、基于蛋白質(zhì)構(gòu)象變化以及基于蛋白分子與香氣配體間結(jié)合位置的測定方法。其中，通過監(jiān)測體系中香氣化合物頂空濃度和蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的測定方法往往需要理論模型加以輔助分析，進(jìn)而反映蛋白質(zhì)-香氣化合物的結(jié)合作用程度。此外，新興的分子對接模擬技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)-香氣化合物結(jié)合作用位點(diǎn)和作用方式的可視化，從而直觀地展現(xiàn)蛋白質(zhì)與香氣配體間的結(jié)合作用。因此，上述4 種研究方法與理論模型是定性和定量分析某種蛋白質(zhì)和特定香氣物質(zhì)結(jié)合作用的方法基礎(chǔ)。

2.1 基于香氣化合物濃度的測定方法

香氣化合物在頂空中的濃度可以預(yù)估人在進(jìn)食過程中的風(fēng)味感知程度，頂空分析法基于氣-液分配系數(shù)，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析被廣泛應(yīng)用于去香食品基質(zhì)對香氣化合物結(jié)合能力的研究。常用方法主要包括靜態(tài)頂空（static headspace，SH）分析法和頂空-固相微萃?。╤eadspace solid-phase micro-extraction，SPME）法[15]。

采用SH法對蛋白質(zhì)-香氣物質(zhì)結(jié)合進(jìn)行分析，基于香氣化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力（K1）以及氣相與水相之間的風(fēng)味分配系數(shù)（K2）。Xu Jiao等[16]通過SH法研究發(fā)現(xiàn)葉醇、檸檬烯以及丁二酮的保留率隨大豆分離蛋白體系中所添加黃原膠濃度的增加而顯著改變。Guo Jun等[17]利用SH法聯(lián)合氣相色譜測定香氣化合物濃度，發(fā)現(xiàn)香茅醛、丙酸香茅酯、乙酸香茅酯和香茅醇濃度較高時(shí)（0.4～1.6 mmol/L）與大豆分離蛋白作用結(jié)合能較高，并產(chǎn)生新的結(jié)合位點(diǎn)，且兩者為非線性結(jié)合。

SPME-GC/MS法能夠測定食品中揮發(fā)性風(fēng)味成分的濃度，并通過分析模型擬合，以計(jì)算出蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)合位點(diǎn)個(gè)數(shù)（n）和結(jié)合常數(shù)（K）值，被廣泛應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)與香氣化合物的結(jié)合作用。當(dāng)香氣物質(zhì)與水溶液中的蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)（圖2），頂空中揮發(fā)物質(zhì)的濃度發(fā)生變化，這可以通過色譜圖中峰面積的變化來監(jiān)測。Wang Haitang等[18]基于SPME-GC/MS方法研究了乙酯類物質(zhì)（乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯）與肌原纖維蛋白的結(jié)合作用。結(jié)果顯示，隨著肌原纖維蛋白濃度的增加，二者的結(jié)合能力顯著增強(qiáng)，并且這4 種酯類物質(zhì)與肌原纖維蛋白的結(jié)合能力依次為辛酸乙酯＞己酸乙酯＞丁酸乙酯＞乙酸乙酯。Han Zhong等[19]借助該方法發(fā)現(xiàn)，肌原纖維蛋白與2-辛酮的結(jié)合能力顯著高于2-庚酮和2-戊酮，這可能是由于香氣化合物的碳鏈越長、結(jié)合位點(diǎn)越多，其與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力就越高。

圖2 基于頂空中香氣化合物濃度測定蛋白質(zhì)-香氣化合物結(jié)合作用示意圖[20]Fig.2 Schematic diagram of protein-aroma binding effect in the determination of aroma compound concentrations in headspace[20]

2.2 基于蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的測定方法

當(dāng)香氣化合物分子帶有極性基團(tuán)時(shí)，在與蛋白結(jié)合時(shí)會(huì)引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。蛋白質(zhì)與香氣物質(zhì)的結(jié)合作用通常采用結(jié)合位點(diǎn)n、結(jié)合常數(shù)K以及分配系數(shù)Ka、熵變ΔS、焓變ΔH和吉布斯自由能ΔG等熱力學(xué)參數(shù)來表征。因此，可以使用多光譜技術(shù)來闡明活性結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合作用類型，常用技術(shù)主要包括紫外-可見吸收光譜、熒光猝滅光譜、同步熒光光譜、圓二色光譜、傅里葉變換紅外光譜和拉曼光譜等技術(shù)（表1）。

表1 基于蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的蛋白質(zhì)-香氣化合物結(jié)合作用的測定方法比較Table 1 Comparison of methods for determination of protein-aroma compound binding based on protein conformational changes

蛋白分子結(jié)合香氣化合物前后的紫外-可見吸收光譜變化能夠反映蛋白質(zhì)的色氨酸和酪氨酸殘基周圍微環(huán)境的變化情況，從而可判斷蛋白分子與香氣化合物是否發(fā)生了結(jié)合作用。Yu Xia等[21]發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白使得茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯（theaflavin-3,3’-digallate，TFDG）的紫外吸收光譜增寬，可能是由于其與氨基酸殘基存在特異性的非共價(jià)結(jié)合。Xiao Zuobing等[22]利用此法研究發(fā)現(xiàn)隨著體系中百香果汁關(guān)鍵芳香化合物（二氫-β-紫羅蘭酮和香葉醇）濃度的增加，索馬甜蛋白在280 nm波長附近的吸收峰增強(qiáng)。這表明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，暴露了蛋白分子內(nèi)封閉的色氨酸和酪氨酸殘基的芳香雜環(huán)疏水基團(tuán)，并且疏水相互作用得到增強(qiáng)，π-π*躍遷能量增加，證明它們都與索馬甜蛋白發(fā)生了結(jié)合作用。

熒光猝滅光譜法常用于進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)與香氣化合物的結(jié)合模式，其中熒光強(qiáng)度能夠反映蛋白質(zhì)內(nèi)部微環(huán)境親水-疏水平衡的變化，進(jìn)而結(jié)合Stern-Volmer方程對熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以計(jì)算得到結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合常數(shù)。其次，同步熒光光譜法可以反映特定氨基酸所處的微環(huán)境極性，也常用以分析蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[23]。根據(jù)前人的研究，熒光猝滅光譜法和同步熒光光譜法往往需要熱力學(xué)方法輔助從而判斷兩者作用過程的主要驅(qū)動(dòng)力，進(jìn)一步探究蛋白質(zhì)和香氣化合物的結(jié)合機(jī)理。Li Hao等[28]通過熒光猝滅光譜法計(jì)算熒光猝滅速率常數(shù)（Ksv），以進(jìn)一步了解肌原纖維蛋白與香氣化合物（丁醛、辛醛、2-戊酮和2-辛酮）的結(jié)合作用，發(fā)現(xiàn)除丁醛外，其余Ksv均大于生物大分子與猝滅劑的最大散射碰撞猝滅常數(shù)。這表明丁醛對肌原纖維蛋白的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅，而其他化合物則同時(shí)發(fā)生動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。Yu Xia等[21]通過聯(lián)合熒光猝滅和同步熒光光譜法發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白與TFDG的結(jié)合使蛋白質(zhì)的色氨酸和酪氨酸殘基周圍的微環(huán)境更具疏水性，且TFDG能夠靜態(tài)猝滅牛血清白蛋白的熒光，并誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，該結(jié)論與傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果一致。

不同于熒光光譜法，圓二色光譜法可以得到蛋白質(zhì)中各二級結(jié)構(gòu)的相對含量，進(jìn)而推測出蛋白質(zhì)構(gòu)象的伸展與折疊，以及蛋白質(zhì)內(nèi)部氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的變化情況[23]。Huang Pimiao等[29]通過圓二色光譜法探討了3 種酚類化合物與鰱魚肌原纖維蛋白的相互作用促進(jìn)魚腥味釋放的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)α-螺旋和β-折疊含量顯著降低，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量顯著增加，其變化程度與酚類化合物的濃度呈正相關(guān)。Ers?z等[30]借助該技術(shù)對不同pH值下β-乳球蛋白與異硫氰酸烯丙酯的結(jié)合機(jī)制進(jìn)行研究，當(dāng)pH值為3.0和6.5時(shí)，游離β-乳球蛋白的遠(yuǎn)紫外光譜顯示典型的α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)占主導(dǎo)地位，并且隨著pH值的升高，游離β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)疏松，無序結(jié)構(gòu)所占比例增加。

區(qū)別于上述光譜方法，傅里葉變換紅外光譜法通常根據(jù)酰胺I（1 600～1 700 cm-1）、酰胺II（1 550 cm-1附近）和酰胺III（1 200～1 350 cm-1）譜帶來表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，并且可用于分析不同的狀態(tài)、濃度等環(huán)境下蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部氫鍵變化的情況[27]。He Yujia等[24]通過傅里葉變換紅外光譜法觀測到醛類化合物和溫度對肌球蛋白的酰胺III帶均有顯著影響，通過特定波長下吸收峰的移動(dòng)能夠判斷出肌球蛋白與己醛、辛醛和3-甲基丁醛相互作用均改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象。Zhu Lin等[25]利用傅里葉變換紅外光譜發(fā)現(xiàn)高粱醇溶蛋白與阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）和四甲基吡嗪（tetramethyl pyrazine，TMP）結(jié)合能夠促使高粱醇溶蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，α-螺旋含量略有下降。

此外，拉曼光譜法能夠獲取蛋白質(zhì)的主鏈構(gòu)象，特別是酰胺I帶、酰胺III帶和C-N等的伸縮振動(dòng)信息；也可以得到側(cè)鏈基團(tuán)微環(huán)境的變化情況以及計(jì)算蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)含量[26]。Xu Yongxia等[31]利用拉曼光譜法研究熱處理時(shí)間對魚肌球蛋白與(E)-2-庚烯醛、1-辛烯-3-醇等香氣化合物結(jié)合作用的影響，發(fā)現(xiàn)酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）是主要的拉曼光譜帶，主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲4 種二級結(jié)構(gòu)。肌球蛋白的α-螺旋含量在熱處理前5 min顯著下降，繼續(xù)加熱5～30 min后顯著升高，這可能是肌球蛋白的熱變性和展開，導(dǎo)致疏水基團(tuán)和巰基的暴露；進(jìn)一步延長熱處理時(shí)間將導(dǎo)致疏水基團(tuán)的嵌入并形成二硫鍵，從而能夠穩(wěn)定α-螺旋結(jié)構(gòu)。Zhao Xiaocao等[32]通過拉曼光譜法檢測出結(jié)合呋喃類香氣化合物的肌原纖維蛋白中α-螺旋含量隨著超聲功率水平的增加先減小后增大，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量先增大后減小，且在500 W時(shí)變化最顯著。此外，Cao Jinxuan等[34]根據(jù)擬合條帶的積分來計(jì)算相應(yīng)譜帶的面積，由酰胺I帶譜圖確定蛋白質(zhì)不同二級結(jié)構(gòu)的相對含量，發(fā)現(xiàn)低濃度氧化劑（0～5 mmol/L H2O2）增加了羰基含量和表面疏水性，使巰基數(shù)量有所減少，并誘導(dǎo)G-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生從β-折疊到α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的部分轉(zhuǎn)變。

2.3 描述蛋白質(zhì)與香氣化合物結(jié)合作用的理論模型

香氣化合物的頂空濃度、熒光強(qiáng)度以及猝滅速率常數(shù)并不能充分反映蛋白質(zhì)-香氣化合物的結(jié)合作用程度，因此，在研究二者結(jié)合能力時(shí)需要熱力學(xué)理論模型加以輔助計(jì)算出結(jié)合常數(shù)K值和結(jié)合位點(diǎn)n值。描述蛋白質(zhì)-香氣化合物結(jié)合作用的理論模型對于定性和定量分析蛋白質(zhì)與香氣化合物的結(jié)合作用類型、作用位點(diǎn)個(gè)數(shù)和結(jié)合力大小是必不可少的。目前，分析蛋白質(zhì)與香氣化合物結(jié)合作用的模型通常分為3 種：1）Klotz方程，常用于分析結(jié)合位點(diǎn)固定、較低濃度的香氣化合物與蛋白質(zhì)的線性結(jié)合[35]；2）Hill方程，適用于分析結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生變化、濃度較高香氣化合物與蛋白質(zhì)的非線性結(jié)合[36]；3）Stern-Volmer、Van’t Hoff或Kirchhoff方程，用來分析蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，通過結(jié)合參數(shù)來表征蛋白-香氣的結(jié)合作用[37]。

Klotz雙倒數(shù)方程和Hill方程分別如公式（1）、（2）所示。

式中：m為每摩爾蛋白質(zhì)結(jié)合的香氣化合物的量；[L]為水溶液中自由香氣化合物的濃度/（mol/L）；K為結(jié)合常數(shù)/（L/mol）；n為結(jié)合位點(diǎn)的個(gè)數(shù)；h為希爾系數(shù)，反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的程度。

一般，m和[L]根據(jù)GC峰面積分別通過公式（3）、（4）計(jì)算可得。

式中：O為香氣化合物總濃度/（mol/L）；Cp為蛋白質(zhì)濃度/（mol/L）；[HS]p為含蛋白質(zhì)樣品的頂空香氣化合物GC峰面積；[HS]c為不含蛋白質(zhì)樣品頂空香氣化合物GC峰面積。

另外，基于蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化時(shí)，常使用的Stern-Volmer方程及其修正后可用于計(jì)算結(jié)合位點(diǎn)n值和靜態(tài)猝滅平衡常數(shù)Ka的方程分別公式（5）、（6）所示。

式中：F0和F分別為不存在和存在猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度；Ksv為熒光猝滅常數(shù)/（L/mol）；[Q]為猝滅劑的濃度/（mol/L）；Ksv可以通過對F0/F與[Q]的線性回歸關(guān)系曲線來確定。

采用的分析模型、香氣化合物濃度、研究體系等不同，所獲得的研究結(jié)果也不盡相同。劉璘等[38]基于熱力學(xué)模型（Scatchard方程）的研究表明，肌球蛋白與白鰱魚特征腥味物質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)均是自發(fā)的（ΔG＜0）。與直鏈醛（庚醛、辛醛、壬醛）相比，1-辛烯-3-醇和肌球蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）更多及結(jié)合常數(shù)（K）較大，且肌球蛋白對直鏈醛的結(jié)合能力隨著鏈長的增加而有所降低。有研究表明，基于Klotz模型，香茅醛、丙酸香茅酯、乙酸香茅酯和香茅醇在低濃度時(shí)（0.04～0.16 mmol/L）與大豆分離蛋白的結(jié)合較小，兩者為線性結(jié)合，而Hill模型分析結(jié)果則與之相反[33]。另外，基于構(gòu)象變化，采用Kirchhoff方程能夠計(jì)算熵變ΔS、焓變ΔH和吉布斯自由能ΔG，進(jìn)而推導(dǎo)出結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點(diǎn)n[39]。此外，利用Stern-Volmer方程，并根據(jù)猝滅速率常數(shù)也可以計(jì)算得到結(jié)合常數(shù)K值和結(jié)合位點(diǎn)n值[40]。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)-香氣物質(zhì)的作用都是可逆的非共價(jià)結(jié)合，研究者傾向于使用Klotz（或Scatchard）方程和Hill方程兩種經(jīng)典理論模型，在平衡條件下來描述香氣化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力。

2.4 基于蛋白分子與香氣配體間結(jié)合位置的測定方法

分子對接是研究分子間（配體和受體）相互作用并預(yù)測其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法。分子動(dòng)力學(xué)模擬能夠克服對接分析中嚴(yán)格的采樣限制，利用計(jì)算機(jī)以原子水平的分子模型來模擬分子結(jié)構(gòu)和行為，進(jìn)而模擬分子體系的各種物理、化學(xué)性質(zhì)。近年來，分子對接和分子模擬越來越多地被用于食品領(lǐng)域，為蛋白分子與香氣化合物間的結(jié)合作用研究提供了一種新思路和新工具。Zhang Bin等[41]通過分子對接研究不同含氧官能團(tuán)（羰基、醇羥基和醛基）與大豆分離蛋白的結(jié)合作用，發(fā)現(xiàn)辛醛與大豆分離蛋白的結(jié)合親和力最高，其次是1-辛烯-3-醇和2-辛酮，這是因?yàn)槿╊惢衔锱c大豆分離蛋白之間形成了更強(qiáng)的氫鍵作用。根據(jù)Bi Shuang等[7]的研究，豌豆蛋白中的Leu-12和Lys-39殘基有助于疏水相互作用的形成，其與己醛分子的距離分別為3.59 ?和3.29 ?，(E)-2-辛烯醛中的氧原子與Asn-336、Lys-482、Phe-483和Leu-484殘基中的氫原子則通過長度分別為3.52、3.56、3.45 ?和3.20 ?的氫鍵相互作用。Wang Haitang等[18,40,42]基于分子對接和動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證了多光譜方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果表明氫鍵和范德華力是肌原纖維蛋白與辛酸乙酯、1-庚醇可逆結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力，而疏水相互作用是維持肌球蛋白-庚醛體系的穩(wěn)定性的主要作用力。Liu Chengzhi等[43]利用分子動(dòng)力學(xué)模擬探索玉米醇溶蛋白與表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）的結(jié)合作用機(jī)理（圖3）。圖中殘基的能量貢獻(xiàn)小于-8.37 kJ/mol顯示為橙色，能量貢獻(xiàn)大于-8.37 kJ/mol顯示為黃色，而左側(cè)紫色虛線則代表氫鍵。分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明，EGCG與Y171、Q174、L176和L205殘基生成的玉米醇溶蛋白活性口袋結(jié)合。其中，靜電相互作用和范德華力在EGCG與玉米醇溶蛋白的結(jié)合中起主導(dǎo)作用，這與傅里葉變換紅外光譜和熱力學(xué)分析的結(jié)果一致。此外，Han Ping等[44]綜合利用分子動(dòng)力學(xué)模擬和分子對接法測得肌球蛋白-芝麻酚復(fù)合物的均方根偏差值低于單個(gè)肌球蛋白，這說明肌球蛋白與芝麻酚結(jié)合后的結(jié)構(gòu)變得更加穩(wěn)定，且分子構(gòu)象變化程度較小。

圖3 玉米醇溶蛋白與EGCG的結(jié)合機(jī)制[43]Fig.3 Binding mechanism between zein and epigallocatechin-3-gallate(EGCG)[43]

3 蛋白質(zhì)與香氣化合物結(jié)合作用的影響因素

蛋白質(zhì)-香氣化合物的結(jié)合作用受到多種因素的影響，除了溫度、pH值、離子強(qiáng)度和氧化條件等環(huán)境因素能夠通過改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來影響蛋白質(zhì)與香氣物質(zhì)的結(jié)合作用，食品中的蛋白質(zhì)、香氣化合物及其他配料組分差異也會(huì)使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和聚集狀態(tài)發(fā)生變化，從而影響蛋白質(zhì)的結(jié)合能力。目前，關(guān)于溫度、pH值和蛋白質(zhì)氧化等加工條件如何影響蛋白質(zhì)-香氣化合物結(jié)合能力的總結(jié)已較為系統(tǒng)全面，因此，本文主要圍繞食品基質(zhì)中蛋白質(zhì)的種類與結(jié)構(gòu)、香氣化合物的濃度、種類與官能團(tuán)以及食品中的配料成分差異對蛋白質(zhì)-香氣化合物結(jié)合作用的影響進(jìn)行闡述，以深入解析二者結(jié)合作用機(jī)制。

3.1 蛋白質(zhì)種類

目前對蛋白質(zhì)與香氣化合物結(jié)合作用的研究主要集中在動(dòng)物蛋白，包括乳蛋白（β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和酪蛋白）、牛血清白蛋白和肌原纖維蛋白。表2總結(jié)了近幾年來發(fā)表的文獻(xiàn)中所選擇的香氣化合物與不同蛋白質(zhì)的結(jié)合作用。蛋白質(zhì)種類的不同，特別是氨基酸殘基、二級結(jié)構(gòu)等均有所差異，能夠影響其與香氣化合物作用時(shí)所表現(xiàn)的結(jié)合能力強(qiáng)弱。

表2 食品中蛋白質(zhì)與香氣化合物的結(jié)合作用Table 2 Binding effect between proteins and flavor compounds in foods

乳蛋白主要包括酪蛋白和乳清蛋白，其中乳清蛋白主要由β-乳球蛋白（約80%）和α-乳白蛋白組成。由于β-乳球蛋白體積小、水溶性好、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)明確，因此廣泛作為模型用于研究香氣化合物-蛋白質(zhì)的結(jié)合作用。Tavel等[53]利用傅里葉變換紅外光譜和2D核磁共振法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)酮類、醛類、酯類和酚類香氣物質(zhì)與β-乳球蛋白既可以結(jié)合在同一位點(diǎn)，也可以結(jié)合在不同位點(diǎn)。酪蛋白由于自身結(jié)構(gòu)的特殊性，有關(guān)其與香氣化合物結(jié)合作用的研究較少，且一般都是在模擬體系中完成。Viry等[48]通過構(gòu)建新的預(yù)測模型研究酪蛋白酸鈉在5 ℃平衡24 h后與香氣化合物的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)酪蛋白酸鈉與乙酸乙酯、苯甲醛和丙酮的結(jié)合是弱相互作用力。Yin Zhucheng等[54]認(rèn)為酪蛋白比其水解物與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）的結(jié)合能力更強(qiáng)，且酪蛋白與C3G的結(jié)合方式經(jīng)酶作用后由范德華力或氫鍵轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷嗷プ饔谩?/p>

肌肉蛋白是一種復(fù)合體系的蛋白質(zhì)，研究較多的主要是肌球蛋白和G-肌動(dòng)蛋白等肌原纖維蛋白。根據(jù)Cao Jinxuan等[34]的研究，0～1 mmol/L H2O2能夠?qū)е翯-肌動(dòng)蛋白在與醛類化合物結(jié)合時(shí)巰基位點(diǎn)數(shù)量減少，有利于香氣化合物的釋放；而1～20 mmol/L H2O2能夠促進(jìn)醛類物質(zhì)的保留，這是由于G-肌動(dòng)蛋白重建和聚集增加了疏水位點(diǎn)數(shù)量，進(jìn)而易于形成蛋白質(zhì)-芳香化合物復(fù)合物。Liu Huan等[55]認(rèn)為肌球蛋白流變行為與肌球蛋白-醛分子結(jié)合作用之間的協(xié)同作用能夠促進(jìn)醛類化合物的保留，并采用分子對接模擬結(jié)合多光譜技術(shù)預(yù)測出Thr-125、Pro-128、Trp-131和Val-187是肌球蛋白和戊醛之間結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。除此之外，當(dāng)添加酮類化合物后，肌原纖維蛋白的構(gòu)象發(fā)生了改變，α-螺旋含量相應(yīng)減少，Tyr和Trp殘基周圍微環(huán)境的極性增強(qiáng)[56]，這與Yang Qiuli等[57]的研究結(jié)果一致。

與動(dòng)物蛋白不同的是，大豆蛋白因不良“草味”或“豆腥味”限制了其應(yīng)用和消費(fèi)。因此，許多研究都集中在了解大豆蛋白異味的釋放和結(jié)合上。研究表明，醇類（如1-己醇）和醛類（如己醛）與干大豆蛋白的結(jié)合能力高于烴類（如己烷），這可能是由于大豆蛋白與醇、醛類化合物形成了氫鍵相互作用[58]。然而，除大豆蛋白外，對其他植物蛋白及其風(fēng)味結(jié)合能力的系統(tǒng)研究還比較缺乏。Zhu Lin等[25]基于多重光譜和分子模擬研究了高粱醇溶蛋白（Kafirin）與FA和TMP的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)疏水作用和氫鍵分別在Kafirin-FA和Kafirin-TMP復(fù)合物的形成中發(fā)揮了主要作用，且復(fù)合物的形成使Kafirin的結(jié)構(gòu)更加緊湊。

3.2 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

研究表明，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，特別是其氨基酸序列、二級、三級和四級結(jié)構(gòu)是影響其與香氣化合物結(jié)合的重要因素。黃國等[59]研究中性條件下β-伴大豆球蛋白（7S）、大豆球蛋白（11S）與EGCG的結(jié)合作用。相比于7S蛋白，11S蛋白中疏水性和不帶電荷的氨基酸含量較高，說明11S蛋白對EGCG的結(jié)合能力更強(qiáng)。α-乳白蛋白的致密結(jié)構(gòu)含有26%的α-螺旋、14%的β-折疊和60%的無序結(jié)構(gòu)，能夠抑制疏水性區(qū)域的暴露，從而降低蛋白質(zhì)與香氣物質(zhì)的結(jié)合能力[60]。甲基化、乙基化、二硫鍵斷裂、糖基化和脫酰胺基等均會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)肽鏈展開和聚集，從而引發(fā)其與香氣化合物結(jié)合作用的改變。O’Neill[61]認(rèn)為將蛋白質(zhì)羧基側(cè)鏈的乙基酯化和用亞硫酸鈉還原二硫鍵對β-乳球蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾，能夠形成大量的結(jié)合位點(diǎn)。Temthawee等[52]以香草醛-椰子蛋白為模型，研究了谷氨酰胺酶對椰子蛋白風(fēng)味結(jié)合電位的影響，發(fā)現(xiàn)脫酰胺后椰子蛋白的整體結(jié)合親和力降低，從而可以減少香草醛與蛋白質(zhì)的結(jié)合行為。Wang Juan等[62]通過丙二醛模擬體系對大豆分離蛋白進(jìn)行氧化改性，發(fā)現(xiàn)低氧濃度時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，暴露疏水基團(tuán)，從而增強(qiáng)了蛋白質(zhì)與芳香化合物的結(jié)合作用；而在高氧濃度時(shí)，蛋白質(zhì)與飽和醛類化合物結(jié)合能力將減弱。Zhao Xiaocao等[32]對肌原纖維蛋白進(jìn)行超聲處理，發(fā)現(xiàn)超聲處理促進(jìn)了蛋白結(jié)構(gòu)解聚和去折疊，使其暴露出更多的疏水和氫鍵結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)肌原纖維蛋白與呋喃類化合物間的靜電相互作用力也得到增強(qiáng)。綜上，對蛋白質(zhì)的可暴露疏水區(qū)域進(jìn)行物理和化學(xué)修飾，可以提高其結(jié)合風(fēng)味的能力。

3.3 香氣化合物的濃度、種類和官能團(tuán)

香氣化合物濃度對自身與蛋白質(zhì)作用的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合常數(shù)有很大的影響。通過Hill模型分析可得，隨著香氣化合物濃度增大，其與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力增強(qiáng)，引起蛋白質(zhì)去折疊或肽鏈展開，從而產(chǎn)生新的結(jié)合位點(diǎn)。例如，當(dāng)己醛濃度為0.1～1.0 mol/L范圍內(nèi)時(shí)，隨著己醛濃度增大，11S球蛋白和7S伴球蛋白與香氣化合物結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量增多，是熵驅(qū)反應(yīng)[36]。當(dāng)香氣化合物為低濃度時(shí)，其與蛋白質(zhì)結(jié)合能較低，一般難以真實(shí)地反映蛋白質(zhì)內(nèi)部對香氣化合物的結(jié)合情況，特別是內(nèi)部疏水區(qū)較封閉的大豆分離蛋白，蛋白質(zhì)的構(gòu)象并不會(huì)發(fā)生變化[36,63]。蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)合香氣化合物濃度通常較低，結(jié)合強(qiáng)度高，釋放量較少，因此研究者常使用SPME-GC/MS方法測定頂空中香氣化合物濃度，再通過數(shù)學(xué)模型擬合，進(jìn)而得到蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)合位點(diǎn)。

許多研究都更加關(guān)注香氣化合物對蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量和分布的影響，其中香氣化合物的種類和官能團(tuán)對二者之間的結(jié)合作用具有顯著影響?？傮w來看，研究者傾向于認(rèn)為香氣化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度大小依次為醛類＞酯類＞酮類＞醇類[20]。當(dāng)香氣化合物為同系物時(shí)，其與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力隨著脂肪鏈長度的增加而增強(qiáng)[64]。Ma Yunjiao等[65]在水溶液中研究了吡嗪與牛血清白蛋白的結(jié)合作用，發(fā)現(xiàn)吡嗪中—CH3的位置和分布受體系中風(fēng)味釋放的顯著影響，牛血清白蛋白的酪氨酸和色氨酸殘基是烷基-吡嗪通過靜電和疏水相互作用的主要結(jié)合位點(diǎn)。

3.4 食品中的配料成分

食品是包含多種成分的復(fù)雜體系，存在其他配料成分，如油脂、乳化劑、鹽和調(diào)味用糖等，這些配料或多或少地會(huì)影響蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)和構(gòu)象等特性，從而對蛋白-香氣化合物的結(jié)合作用產(chǎn)生一定的影響。一般來說，蛋白質(zhì)對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的保留率遠(yuǎn)低于脂肪。Guichard[66]報(bào)道，油脂含量的增加會(huì)降低疏水性芳香化合物的揮發(fā)性，而對親水性化合物（如雙乙?；蚨替湸迹﹨s只產(chǎn)生很小的影響。然而，在乳狀液中，蛋白質(zhì)在油-水界面的存在會(huì)對疏水性香氣化合物的釋放和感知產(chǎn)生顯著性影響[67]。Rogacheva等[68]研究香氣化合物在油-水體系與β-乳球蛋白的結(jié)合行為，認(rèn)為油-水界面上蛋白質(zhì)的存在可以提高芳香化合物的傳質(zhì)阻力，從而減緩香氣物質(zhì)釋放到氣相中的速率，以保證在食用過程中風(fēng)味的持續(xù)性。此外，Wang Kun等[69]研究鹽的種類和濃度對鹽提取豌豆蛋白提取物（salt-extracted pea protein isolates，PPIs）與酮類化合物（2-己酮、2-庚酮和2-辛酮）結(jié)合的影響。相比于二價(jià)鹽（CaCl2），較高濃度的NaCl（0.25～1.00 mol/L）能顯著促進(jìn)蛋白質(zhì)與風(fēng)味的結(jié)合，而較低濃度（0.05～0.10 mol/L）則會(huì)降低風(fēng)味的保留。在不同條件下，PPIs和2-辛酮的結(jié)合能力均大于2-庚酮和2-己酮。Xu Jiao等[16]對多糖體系中大豆分離蛋白與香氣化合物的結(jié)合作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)乙酸葉醇酯、丁二酮分別在大豆分離蛋白與羧甲基纖維素鈉、黃原膠混合溶液中的保留率更高，檸檬烯在大豆分離蛋白與刺槐豆膠體系中的保留率則顯著低于上述兩種多糖體系。

4 結(jié) 語

蛋白質(zhì)與香氣化合物的結(jié)合作用會(huì)直接或間接影響食品的風(fēng)味感知，進(jìn)而影響消費(fèi)者對食品的喜好程度。此外，食品工業(yè)中蛋白質(zhì)-香氣化合物反應(yīng)會(huì)造成風(fēng)味損失或者異味存留，從而縮短產(chǎn)品保質(zhì)期，因此，了解蛋白質(zhì)與香氣化合物的結(jié)合作用機(jī)制及影響因素，為保持食品理想的風(fēng)味和延長產(chǎn)品保質(zhì)期提供了可能。

隨著精密儀器與技術(shù)的不斷發(fā)展，研究手段與方法的不斷成熟，對蛋白質(zhì)與香氣化合物結(jié)合作用的認(rèn)識也逐漸深入。然而目前還存在一些問題，需要在目前的認(rèn)知基礎(chǔ)上進(jìn)一步強(qiáng)化。首先，目前蛋白基質(zhì)與香氣成分的結(jié)合作用研究一般都是在單一的模擬體系中完成，它們之間的結(jié)合類型與作用位點(diǎn)等作用方式尚不明確，且不存在統(tǒng)一的作用機(jī)制。因此，在研究單一基質(zhì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究復(fù)合體系和多組分食品基質(zhì)與香氣化合物的相互作用是未來研究的發(fā)展趨勢之一。其次，關(guān)于蛋白質(zhì)在加工時(shí)構(gòu)象變化、不同結(jié)構(gòu)的香氣化合物共存條件下以及添加食品配料等對蛋白質(zhì)與香氣化合物結(jié)合作用影響等方面的研究仍有所欠缺，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白食品體系中風(fēng)味平衡調(diào)控技術(shù)的缺乏。此外，隨著消費(fèi)者追求飲食中少鹽、少糖，同時(shí)對低脂食品的需求增加，應(yīng)加速探索開發(fā)植物性和“三減”食品的方法。但是“三減”食品的風(fēng)味成分持續(xù)釋放能力也會(huì)減弱，如何在這種情況下保持食品的風(fēng)味也顯得至關(guān)重要。如開發(fā)植物膠或以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的脂肪替代品，并通過添加調(diào)味料或改變香氣化合物的釋放/保留模式來保持食品的風(fēng)味特征，均是滿足健康飲食需求的可選策略。與此同時(shí)，也需要深入研究感官評價(jià)和蛋白質(zhì)-香氣化合物結(jié)合作用程度之間的關(guān)系，以期在蛋白質(zhì)與香氣化合物結(jié)合作用機(jī)理的研究基礎(chǔ)上揭示食品風(fēng)味在體內(nèi)和體外的釋放機(jī)制。食品中蛋白基質(zhì)與香氣化合物的結(jié)合能力決定了食品的風(fēng)味品質(zhì)，隨著蛋白質(zhì)與不同香氣化合物結(jié)合作用機(jī)理研究的不斷深入，蛋白質(zhì)-香氣化合物的結(jié)合方式和特有的保留/釋放模式將逐漸明晰，這對于揮發(fā)性香氣成分的可控釋放及感知并實(shí)現(xiàn)風(fēng)味品質(zhì)穩(wěn)態(tài)化調(diào)控具有重要的意義。