薏苡仁生物肽對高糖損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用

尹艷燕，趙 藝，褚輝程，梁勁杰，韓曉佳，陳祖君*，王靈芝,*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102400；2.中國航天科工集團(tuán)七三一醫(yī)院，北京 100074；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院，北京 100030）

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，嚴(yán)重危害人類健康。2021年糖尿病導(dǎo)致670萬人死亡，截至2021年，全球成年人糖尿病患病率高達(dá)10.5%，造成至少9 660億 美元的衛(wèi)生支出。中國糖尿病患者數(shù)量位居全球第一，該病的預(yù)防和治療形勢嚴(yán)峻[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是位于血管最內(nèi)層的扁平鱗狀細(xì)胞，不僅是血液與組織之間的屏障，同時(shí)在控制血管張力、保持血液正常流動(dòng)和凝血、免疫等方面發(fā)揮著重要作用[2]。糖尿病患者常伴有心臟、腦、腎、視網(wǎng)膜等血管并發(fā)癥，引發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙[3]。

糖尿病引發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙表現(xiàn)為細(xì)胞增殖失調(diào)、屏障功能改變、內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變、細(xì)胞黏附、炎癥、氧化應(yīng)激和對凋亡的敏感性改變等。高糖促使內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體產(chǎn)生過量活性氧（reactive oxygen species，ROS），從而激活下游多元醇/山梨醇/醛糖還原酶途徑、二酰甘油/磷脂肌醇途徑等進(jìn)而引發(fā)各種血管并發(fā)癥[4]。高糖環(huán)境下，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)下調(diào)與腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡加劇[5]。長期高血糖可導(dǎo)致機(jī)體器官內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）表達(dá)量升高，同時(shí)增加內(nèi)皮細(xì)胞對缺血和缺氧的易感性，進(jìn)而促進(jìn)ICAM-1的表達(dá)[6]，形成惡性循環(huán)。此外，高血糖影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)代謝，使未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積累，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，影響線粒體的功能并最終導(dǎo)致內(nèi)皮損傷[7]。

薏苡仁（Coix lacryma-jobiL.var.ma-yuen(Roman.)Stapf）為臨床常用利水滲濕類藥物，具有抗腫瘤、降血壓、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗炎、抗菌、降血脂等活性[8]，可藥食兩用[9]。Zhou Qilyu等[10]發(fā)現(xiàn)長期飼喂薏苡仁可減少結(jié)腸炎小鼠炎癥因子的分泌，減輕氧化應(yīng)激水平。Wang Qingyu等[11]研究發(fā)現(xiàn)薏苡仁多酚提取物可降低大鼠膽固醇水平，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。以薏苡仁油為主要成分的康萊特注射液是臨床抗癌藥物，常用來治療中晚期非小細(xì)胞肺癌[12]及原發(fā)性肝癌[13]，或聯(lián)合化療治療胃癌，對放療、化療有增效減毒的作用[14]。薏苡仁多糖能顯著抑制免疫功能低下小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)及淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，提高血清半數(shù)溶血值，具有較好的免疫功能恢復(fù)作用[15]。薏苡仁糖蛋白能有效抑制Fe2＋誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，具有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力[16]。

本課題組前期研究表明，薏苡仁生物肽具有顯著降壓效果[17]，同時(shí)對血管緊張素II（angiotensin II，AngII）損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用[18]。薏苡仁生物肽對高糖損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞是否具有保護(hù)作用鮮見報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)針對高糖逆境下薏苡仁生物肽對血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用及作用機(jī)制進(jìn)行研究，以期為利用薏苡仁生物肽開發(fā)具有高糖損傷HUVEC保護(hù)作用類藥物提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏苡仁生物肽[19]由本課題組制備與保存。

D-葡萄糖、I型膠原酶、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、β-內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（betaendothelial cell growth factor，β-ECGF） 美國Sigma Aldrich公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國Hyclone公司；雙抗、M199培養(yǎng)基 美國Gibco公司；VIII因子抗體 美國Santacruz公司；3,3’-二氨基聯(lián)苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）試劑盒、四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、ROS檢測試劑盒、Annexin V-熒光素異硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 北京蘭博利德商貿(mào)有限公司；鈣黃綠素AM（calcium green-1 acetoxymethyl ester，CG-1 AM） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；NO測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒 上海近岸科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FLC-3超凈工作臺 北京東聯(lián)哈儀器制造有限公司；MCO-18AIC CO2培養(yǎng)箱 日本SANYO公司；TDL-50B低速臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；TE2000-S倒置顯微鏡 日本Nikon公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀 美國Beckman Coulter公司；Epoch酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司；QuantStudio6 Flex實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀美國Life Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離與培養(yǎng)

參考Medina-Leyte等[20]的方法分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）。新生兒臍帶由中國航天科工集團(tuán)七三一醫(yī)院提供，無菌條件下取健康新生兒臍帶20～30 cm，將1 g/L I型膠原酶注入臍靜脈使血管充盈，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃消化15 min，然后將消化液轉(zhuǎn)移至相同體積的M199完全培養(yǎng)基（含10%（體積分?jǐn)?shù)）FBS、1%（體積分?jǐn)?shù)）雙抗和1 μg/Lβ-ECGF，下同）的無菌離心管內(nèi)。利用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.4）沖洗殘余的臍靜脈，一并收集沖洗液和消化液，室溫下1 000 r/min離心5 min，棄上清液，M199完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到包被鼠尾膠原細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24 h后換液同時(shí)除去未貼壁細(xì)胞，觀察并拍照培養(yǎng)24 h及48 h的細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 HUVEC免疫組化鑒定

利用免疫組化方法進(jìn)行HUVEC細(xì)胞Ⅷ因子表面抗原的鑒定[20]。將第2代HUVEC以5×104個(gè)/孔密度接種于24 孔板，貼壁后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定，體積分?jǐn)?shù)3% H2O2溶液室溫孵育以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.3% Triton X-100通透細(xì)胞膜，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液37 ℃封閉30 min；正常組加入VIII因子一抗工作液（1∶100），陰性對照組加入5% BSA于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜；次日，吸棄一抗工作液或5% BSA，PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗工作液（1∶100），室溫下孵育2 h，PBS沖洗；加入DAB顯色液，顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.3 細(xì)胞處理及分組

取第3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為5 組：1）正常對照組（NG組）：5 mmol/L葡萄糖；2）高糖損傷模型組（HG組）：30 mmol/L葡萄糖；3）薏苡仁生物肽（coix peptide，CP）高、中、低劑量給藥組：30 mmol/L葡萄糖＋1×10-5mol/L CP（CP-H組）、30 mmol/L葡萄糖＋1×10-6mol/L CP（CP-M組）、30 mmol/L葡萄糖＋1×10-7mol/L CP（CP-L組）。

1.3.4 HUVECNO分泌量的測定

取對數(shù)生長期HUVEC細(xì)胞，經(jīng)0.5 g/L胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，接種于6 孔板，每孔1 mL，待細(xì)胞貼壁后分組及加藥干預(yù)。分別培養(yǎng)7 、14 d后吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，4 ℃、1 000×g離心15 min，采用硝酸還原酶法，利用NO測定試劑盒檢測NO分泌量。

1.3.5 HUVEC ROS含量的測定

采用流式細(xì)胞術(shù)測定HUVEC中ROS含量[21]。取對數(shù)生長期HUVEC，以1×104個(gè)/mL密度接種于6 孔板，每孔1 mL，待細(xì)胞貼壁后分組及加藥干預(yù)，培養(yǎng)7 d后棄舊培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞2 次，每孔加入1 mL H2DCFHDA（2 μmol/L）探針，37 ℃孵育30 min，PBS洗去未結(jié)合的探針。0.5 g/L胰酶消化HUVEC為單細(xì)胞狀態(tài)，轉(zhuǎn)移細(xì)胞于流式管中，利用流式細(xì)胞儀檢測488 nm激發(fā)波長下的樣品熒光強(qiáng)度，以此表征ROS含量。

1.3.6 HUVEC細(xì)胞凋亡的檢測

采用Annexin V-FITC/PI雙染法（細(xì)胞凋亡檢測試劑盒）測定薏苡仁生物肽對高糖損傷HUVEC細(xì)胞凋亡的影響[3]。調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，接種于6 孔板，每孔1 mL，分組加藥處理7 d和14 d后，收集舊培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，加入600 μL不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的0.5 g/L胰酶消化細(xì)胞，待多數(shù)細(xì)胞變圓時(shí)加入舊培養(yǎng)基終止消化，室溫下1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌2 次，加入1 mL Binding buffer重懸細(xì)胞。取500 μL細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至流式管，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育10 min。加入10 μL PI溶液混勻，室溫避光孵育5 min，上機(jī)（流式細(xì)胞儀）檢測。

1.3.7 qPCR檢測炎癥基因相對表達(dá)量

藥物處理細(xì)胞7 d后使用Trizol試劑分離總RNA，紫外光譜法進(jìn)行核酸定量。使用promega GoScript RT System試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR反應(yīng)體系為10 μL：2×NovoScript?Plus 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 5 μL、上下游引物各0.2 μmol/L、cDNA 5 ng，加ddH2O補(bǔ)足10 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性20 s，60 ℃延伸1 min，共43 個(gè)循環(huán)。各基因引物序列見表1。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行基因相對表達(dá)量的計(jì)算[3]。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異具有顯著性。采用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HUVEC形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

H U V E C 貼壁生長，細(xì)胞密度低時(shí)呈長梭形（圖1A），隨著細(xì)胞密度的增加，細(xì)胞呈鋪路石狀鑲嵌排列，邊界清晰，胞漿豐富（圖1B）。采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行細(xì)胞表面VIII因子相關(guān)抗原鑒定，顯微鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒，呈陽性反應(yīng)（圖1D）。

圖1 HUVEC細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定（×100）Fig.1 Morphological observation and identification of HUVECs (× 100)

2.2 薏苡仁生物肽對高糖損傷HUVEC NO分泌的影響

由表2 可知，與N G 組相比，高糖處理7 d 后，HUVEC NO分泌量顯著降低28.72%；與HG處理組相比，薏苡仁生物肽顯著增加了細(xì)胞NO的分泌量，CP-H、CP-M、CP-L給藥組NO分泌量分別為（8.60±0.22）、（10.25±0.22）μmol/L和（11.51±0.22）μmol/L；高糖作用細(xì)胞14 d后，HG組NO分泌量下降，薏苡仁生物肽給藥組NO分泌量相比HG組顯著增加（P＜0.05）。

表2 薏苡仁生物肽對高糖損傷HUVEC NO分泌量的影響Table 2 Effect of coix seed biopeptide on NO secretion in high glucoseinjured HUVECs

2.3 薏苡仁生物肽對高糖損傷HUVEC ROS產(chǎn)生量的影響

HG培養(yǎng)7 d，HUVEC細(xì)胞ROS分泌量顯著升高，相比NG組升高96.19%。薏苡仁生物肽處理顯著降低了細(xì)胞ROS的分泌量（P＜0.05），CP-H、CP-M、CP-L組的ROS分泌量分別為HG組的72.89%、68.05%、74.36%（圖2）。

圖2 薏苡仁生物肽對高糖損傷HUVEC ROS產(chǎn)生量的影響Fig.2 Effect of coix seed biopeptide on ROS production in high glucose-injured HUVECs

2.4 薏苡仁生物肽對高糖損傷HUVEC凋亡的影響

高糖作用HUVEC 7 d后，細(xì)胞凋亡率與NG組無顯著差異（圖3A～C），隨著高糖作用時(shí)間的延長，作用14 d后HG組凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增多，為NG組的1.61 倍（圖3D～F）（P＜0.05），表明長時(shí)間高糖損傷可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，因此在后續(xù)凋亡給藥研究中，將藥物作用時(shí)間調(diào)整至14 d，進(jìn)行長期高糖損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)研究。

圖3 長期高糖損傷對HUVEC細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of long-term high glucose injury on cell apoptosis in HUVECs

高糖作用HUVEC 14 d后顯著降低了正常細(xì)胞的比例，細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）；與HG組相比，CP-H、CP-M、CP-L顯著降低了細(xì)胞的凋亡率（圖4）。

圖4 薏苡仁生物肽對長期高糖損傷HUVEC凋亡的影響Fig.4 Effect of coix seed biopeptide on cell apoptosis in HUVECs with long-term high glucose injury

2.5 薏苡仁生物肽對長期高糖損傷HUVEC炎癥基因表達(dá)的影響

與NG組相比，高糖處理HUVEC 7 d后，ICAM-1、IL-6、MCP-1和VCAM基因表達(dá)量顯著增加，分別為NG組的2.17、4.41、6.08 倍和2.08 倍（P＜0.05）。與HG組相比，CP-H、CP-M、CP-L組HUVECIL-6和MCP-1基因表達(dá)量顯著降低，CP-L組VCAM基因表達(dá)量顯著降低，為HG組的23.76%（P＜0.05），ICAM-1基因表達(dá)量也明顯下降（圖5）。

圖5 薏苡仁生物肽對長期高糖損傷HUVEC炎癥基因表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of coix seed biopeptide on expression of inflammationrelated genes in HUVECs with long-term high glucose injury

3 討 論

高糖引起內(nèi)皮功能障礙的作用機(jī)制是高糖可誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生過量ROS，進(jìn)而通過多元醇、二酰甘油（diacylglycerol，DAG）/蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、己糖胺通路或者非酶糖基化產(chǎn)物形成引起內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，引發(fā)內(nèi)皮功能障礙[4]。同時(shí)，氧化應(yīng)激通過Caspase 3、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）/應(yīng)激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）、Akt激活、線粒體凋亡等通路誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[22]。高糖可促進(jìn)NADPH氧化為NADP＋，加快NAD＋還原為NADH，NADP＋、NADH可降低NO的生物利用度，增強(qiáng)氧化應(yīng)激[23]。NO是重要的舒血管因子，可激活鳥苷酸環(huán)化酶，介導(dǎo)環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）調(diào)控的血管舒張，同時(shí)激活核因子-κB（nuclear factor kappa，NF-κB）信號通路，使VCAM、MCP-1表達(dá)量降低，減少白細(xì)胞黏附從而達(dá)到抗炎效果[4,24]。高糖可干擾線粒體電子傳遞鏈，使輔酶Q氧化作用增強(qiáng)，從而促進(jìn)過氧化亞硝酸鹽的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死的發(fā)生[25]。研究表明，糖尿病患者Ang II表達(dá)量表達(dá)上調(diào)[26]；Ang II作用于內(nèi)皮細(xì)胞表面血管緊張素II 1型受體（angiotensin II type 1 receptor，AT1R）進(jìn)而產(chǎn)生NF-κB和ROS，隨后激活黏附分子（如選擇素、VCAM-1和ICAM-1）、趨化因子（如MCP-1、IL-8）、細(xì)胞因子（如TNF-α和IL-6）、血管內(nèi)皮和血小板衍生的生長因子等導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[27]。AngII主要通過黃嘌呤氧化酶、脂氧合酶、NAD(P)H氧化酶促進(jìn)ROS的產(chǎn)生[28]。目前已從天然動(dòng)植物中分離出具有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)功能的多肽類物質(zhì)。袁小燕等[29]研究發(fā)現(xiàn)胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）可改善高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡，且可能與磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）通路的表達(dá)上調(diào)相關(guān)；Guo Lixin等[30]研究發(fā)現(xiàn)GLP-1可降低高糖處理內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1和磷酸化JNK蛋白的表達(dá)，減少ROS生成和JNK-Bax信號通路激活；師巖等[31]發(fā)現(xiàn)肌肽能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡。糖尿病在中醫(yī)上一般按消渴證陰虛燥熱型論治，臨床上以脾虛濕滯為常見[32]。薏苡仁粉具有降糖、降脂功效[33]。脾虛濕滯型糖尿病患者在常規(guī)治療基礎(chǔ)上服用薏苡仁，可縮短血糖控制所需時(shí)間，改善血糖指標(biāo)，降低給藥量，避免發(fā)生低血糖等不良事件[34]；薏苡仁多糖可改善糖尿病患者空腹血糖、糖化血紅蛋白、餐后血糖[35]。薏苡仁多糖可能通過調(diào)節(jié)葡萄糖激酶活性進(jìn)而改善實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠胰島素抵抗，并明顯降低動(dòng)物血糖[36-37]。孟利娜[38]發(fā)現(xiàn)薏苡仁蛋白可通過降低小鼠PTEN和FOXO1基因的表達(dá)水平和提高PI3K、GLUT4基因的表達(dá)水平，促進(jìn)機(jī)體對葡萄糖的吸收，降低血糖濃度。

本研究結(jié)果表明，薏苡仁生物肽可抑制高糖損傷內(nèi)皮細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)NO的分泌，降低細(xì)胞凋亡比例，同時(shí)可下調(diào)IL-6、VCAM、MCP-1基因的表達(dá)，提示薏苡仁生物肽可能通過影響NF-κB信號通路發(fā)揮保護(hù)作用。本研究表明有望利用薏苡仁生物肽開發(fā)具有高糖損傷HUVEC保護(hù)作用類藥物，為降糖藥物研發(fā)提供新的候選藥物。