山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌細(xì)胞膜屏障影響的機(jī)理

孫 月，曾朝懿，李梓鈺，熊海波，林籽汐，車(chē)振明，唐 潔*

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039）

白假絲酵母菌（Candida albicans）作為一種條件致病菌，常見(jiàn)于宿主的胃、腸道、口腔、皮膚和泌尿系統(tǒng)，其具有表型可塑性，以不同形態(tài)在營(yíng)養(yǎng)菌絲和芽殖酵母間切換，使其能夠定植并感染宿主從而引起疾病[1]。白假絲酵母菌雖被長(zhǎng)期認(rèn)為是通過(guò)臨床感染，但在抗生素廣泛應(yīng)用的背景下，白假絲酵母菌抗藥性增加，導(dǎo)致其感染發(fā)生轉(zhuǎn)移。近年來(lái)已有研究發(fā)現(xiàn)，白假絲酵母菌能夠引起傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜及奶制品腐敗[2-3]，從而引起食品安全風(fēng)險(xiǎn)。目前，抗白假絲酵母菌的藥物主要包括多烯類(lèi)和唑類(lèi)等[4]。然而，這類(lèi)常見(jiàn)的抗真菌藥物會(huì)產(chǎn)生肝毒性、腎毒性等副作用[5]，因此，亟待尋找一種天然、安全的替代藥物。

植物精油含有豐富的天然生物堿、黃酮類(lèi)化合、單萜類(lèi)、倍半萜類(lèi)等物質(zhì)，具有良好的廣譜殺菌性和不易造成耐藥性等特點(diǎn)。但不同精油由于化學(xué)組分和含量不同，其作用機(jī)制不同[6-8]。Azeredo等[9]研究發(fā)現(xiàn)不同生化成分組成的精油組合可顯著提高抗菌效力。Lü Fei等[10]評(píng)估比較了4 種化學(xué)成分差異很大的精油，通過(guò)協(xié)同作用測(cè)試，證實(shí)4 種精油組合可以在低濃度下有效抑制食品中的相關(guān)微生物。此外，Santiesteban-López等[11]研究了精油組合抑菌協(xié)同作用機(jī)制，結(jié)果表明，協(xié)同作用機(jī)制包括共同生化途徑的連續(xù)抑制以及保護(hù)性酶的抑制等。但不同抗菌特性的精油對(duì)不同微生物的具體抑菌機(jī)制還需明確。

山蒼子精油是一種高附加值產(chǎn)品，主要從山蒼子的新鮮果實(shí)中提取[12-13]，具有廣泛的生物和藥理活性，包括抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗氧化作用等[14]。GB/T 2760——2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中提到山蒼子精油還可作為食品調(diào)味劑使用，與食品基質(zhì)作用，從而改善食物感官品質(zhì)。有研究表明，山蒼子精油及其活性化合物具有良好的抑菌活性，可廣泛抑制食源性病源菌，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期[15]。戴錦銘[16]發(fā)現(xiàn)山蒼子精油的主要成分檸檬醛可以破壞大腸桿菌DNA結(jié)構(gòu)，減少胞內(nèi)DNA含量；此外，將山蒼子精油應(yīng)用于4 種不同果蔬汁中均能夠抑制大腸桿菌繁殖。李欣越等[17]的研究表明山蒼子精油能夠有效抑制沙門(mén)菌生物被膜的形成；王軼楠[18]發(fā)現(xiàn)山蒼子精油會(huì)抑制辣椒疫霉菌菌絲生長(zhǎng)、孢子囊形成、孢子囊萌發(fā)和孢子萌發(fā)。雖然山蒼子精油的抗菌活性已在很多研究中得到證實(shí)，但山蒼子精油應(yīng)用于白假絲酵母菌的研究還鮮有報(bào)道，限制了山蒼子精油在食品工業(yè)中的進(jìn)一步應(yīng)用。

本研究選用山蒼子精油作為天然抗菌劑，分析其主要活性成分，通過(guò)不同質(zhì)量濃度的山蒼子精油處理篩自“生花”泡菜中的白假絲酵母菌，觀察處理前后白假絲酵母菌細(xì)胞形態(tài)、表面疏水性、表面電荷、胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)泄漏變化情況，探究山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌抗菌活性及其對(duì)細(xì)胞膜屏障影響的機(jī)理，以期為山蒼子精油及其生物活性化合物在食品工業(yè)中應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

白假絲酵母菌由中國(guó)（成都）西華大學(xué)四川食品微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；山蒼子精油（純度≥85%）上海源葉生物科技有限公司；YPD培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司；吐溫20、戊二醛（體積分?jǐn)?shù)25%）成都市科隆化學(xué)品有限公司；正十六烷 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BPH-9082恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；ZWY-2102C雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；GI54DWS全自動(dòng)高壓滅菌鍋 廈門(mén)致微儀器有限公司；FDU-1100真空冷凍干燥機(jī) 東京理化器械株式會(huì)社；5 8 0 4 R 冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；GCMS-QP2020 NX氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀日本島津公司；AR8011電導(dǎo)率測(cè)試儀 蘇州羅伯克測(cè)控技術(shù)有限公司；Zetasizer Nano ZS激光粒度儀 英國(guó)馬爾文帕納科公司；CSUOP0600熒光倒置顯微鏡 重慶重光實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山蒼子精油成分測(cè)定

取3 mL的樣品于頂空萃取瓶中，蓋上瓶蓋，置于60 ℃水浴保溫30 min后，將萃取頭旋轉(zhuǎn)于2 cm處，插入頂空萃取瓶，壓入纖維頭，吸附30 min，吸附結(jié)束后，取出萃取頭重新旋轉(zhuǎn)到3 cm處，從GC-MS進(jìn)樣口進(jìn)樣解吸5 min后取出萃取頭。

色譜條件：Rtx-5MS色譜柱，載氣為高純度氦氣，柱箱溫度55 ℃，進(jìn)樣口溫度220 ℃，分流比50∶1，總流量67.4 mL/min，柱流量1.00 mL/min，壓力119.8 kPa。升溫程序：55 ℃保持4 min，隨后以10 ℃/min升至130 ℃，保持3 min，再以6 ℃/min升至240 ℃，保持15 min，檢測(cè)器溫度為240 ℃。

MS條件：離子化電子電離源，電離電壓70 eV，離子源溫度280 ℃，接口溫度240 ℃，溶劑延遲時(shí)間2 min。

1.3.2 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測(cè)定

山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MFC）的測(cè)定采用Zhang Yunbin等[19]的方法。將山蒼子精油用5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）吐溫20配制成質(zhì)量濃度為32 mg/mL的母液，以二倍稀釋法將精油依次稀釋為質(zhì)量濃度16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL。每個(gè)樣品加入2%（以體系體積計(jì)）白假絲酵母菌菌懸液（使實(shí)驗(yàn)終體系菌懸液濃度為1×107CFU/mL）30 ℃培養(yǎng)24 h，以添加5%吐溫20的YPD培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，以不接菌的不同質(zhì)量濃度山蒼子精油作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定OD600nm，其中與陽(yáng)性對(duì)照組光密度值最接近的最低處理精油質(zhì)量濃度為MIC。吸取100 μL蒼子精油濃度不低于MIC的菌懸液并涂布在YPD平板上，在30 ℃下孵育24 h后，相應(yīng)的菌落數(shù)小于5的平板所對(duì)應(yīng)最低質(zhì)量濃度被認(rèn)作山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌的MFC[20]。

1.3.3 抑菌動(dòng)力學(xué)的測(cè)定

4.4.2 個(gè)體化鎮(zhèn)痛：結(jié)合文獻(xiàn)學(xué)習(xí)及我院臨床工作經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于健康初產(chǎn)婦推薦使用椎管內(nèi)嗎啡與非甾體類(lèi)藥物和/或?qū)σ阴０被?。?duì)于全麻剖宮產(chǎn)，擴(kuò)大皮膚切口，已知有慢性疼痛病史的產(chǎn)婦，需改變常規(guī)鎮(zhèn)痛方案，或者加大用藥劑量，可采用持續(xù)傷口浸潤(rùn)阻滯鎮(zhèn)痛，持續(xù)腹橫肌平面阻滯鎮(zhèn)痛。對(duì)于二次剖宮產(chǎn)經(jīng)產(chǎn)婦推薦使用椎管內(nèi)嗎啡，圍術(shù)期低劑量舒芬太尼復(fù)合特耐(帕瑞昔布鈉)及地塞米松。對(duì)于爆發(fā)痛患者建議口服或者靜脈應(yīng)用阿片類(lèi)藥物，也可以給予“拯救性”腹橫肌平面阻滯。口服阿片類(lèi)藥物推薦：羥考酮、氫可酮、曲馬多。對(duì)于更嚴(yán)重的爆發(fā)痛或者不耐受口服時(shí)，可使用靜脈阿片類(lèi)藥物。

以二倍稀釋法配制含不同質(zhì)量濃度山蒼子精油（0、MIC、MFC）的YPD培養(yǎng)基，接種100 μL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液于5 mL無(wú)菌YPD培養(yǎng)基中（使實(shí)驗(yàn)終體系菌懸液濃度為1×107CFU/mL），分別于培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h時(shí)測(cè)定OD600nm。

1.3.4 微觀形態(tài)特征觀察

掃描電子顯微鏡可以觀察山蒼子精油在MIC和MFC下對(duì)白假絲酵母菌的影響。將處于對(duì)數(shù)期的白假絲酵母菌用冷凍離心機(jī)6 000 r/min離心10 min，用無(wú)菌生理鹽水洗滌3 次并懸重至菌懸液濃度為1×107CFU/mL，以二倍稀釋法加入山蒼子精油，使其終質(zhì)量濃度達(dá)到0（對(duì)照）、MIC、MFC，在30 ℃下?lián)u床培養(yǎng)3 h，6 000 r/min離心10 min，加入體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液固定3 h，離心10 min并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.02 mol/L pH 7.2）洗滌3 次，涂抹于載玻片上，用體積分?jǐn)?shù)20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液依次沖洗，進(jìn)行梯度脫水，裹上扎好孔的保鮮膜，于-20 ℃下預(yù)凍12 h，再放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h，最后將有細(xì)胞的載玻片進(jìn)行噴金處理，鏡檢拍照。

1.3.5 表面電荷的測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)期的白假絲酵母菌加入含不同質(zhì)量濃度山蒼子精油（0、MIC、MFC）的YPD培養(yǎng)基中，于30 ℃下培養(yǎng)15 h后用冷凍離心機(jī)6 000 r/min離心10 min，以PBS（0.01 mol/L pH 7.2）洗滌3 次并重懸至菌懸液濃度為1×107CFU/mL后，用激光粒度儀測(cè)細(xì)胞表面電荷。

1.3.6 細(xì)胞膜完整性的測(cè)定

用熒光倒置顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性。調(diào)整對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白假絲酵母菌菌懸液濃度為1×107CFU/mL，分別加入不同質(zhì)量濃度的山蒼子精油，使其終質(zhì)量濃度分別為0、MIC、MFC。在30 ℃的搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，混勻，取1 mL的培養(yǎng)液6 000 r/min離心10 min，用PBS（0.01 mol/L pH 7.2）洗滌3 次并懸重，于96 孔板中分別加入190 μL稀釋100 倍的菌懸液和10 μL按照體積比1∶3混合的SYBR Green I和PI染料，25 ℃避光孵育25 min，在20×物鏡、10×目鏡熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3.7 電導(dǎo)率的測(cè)定

1.3.8 分子物質(zhì)泄漏情況分析

參照柏梅[21]的方法對(duì)山蒼子精油作用后大分子物質(zhì)泄漏情況進(jìn)行分析。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)周期的白假絲酵母菌于6 000 r/min下離心10 min，獲得的菌體沉淀用無(wú)菌PBS（0.01 mol/L pH 7.2）清洗，此過(guò)程重復(fù)3 次后獲得菌體沉淀用無(wú)菌PBS（0.01 mol/L pH 7.2）重懸至菌懸液的濃度為1×107CFU/mL。將白假絲酵母菌菌懸液與不同質(zhì)量濃度山蒼子精油（0、MIC、MFC）混合并在30 ℃下振蕩培養(yǎng)，每4 h使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260nm和OD280nm，以添加等量5%吐溫20的實(shí)驗(yàn)組作為對(duì)照組。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，采用Excel 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 山蒼子精油主要活性成分

采用GC-MS對(duì)山蒼子精油進(jìn)行成分分析，所得分析譜圖如圖1所示，與NIST質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)后的結(jié)果列于表1。

表1 山蒼子油精主要成分分析Table 1 Analysis of major components in Litsea cubeba essential oil

圖1 山蒼子精油GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Gas chromatography-mass spectrometry total ion current chromatogram of Litsea cubeba essential oil

由圖1可以得出，山蒼子精油經(jīng)GC-MS分析，共檢測(cè)出90 種物質(zhì)，其中(Z)-檸檬醛（13.28%）、檸檬醛（12.52%）、D-檸檬烯（12.45%）、甲基庚烯酮（7.13%）、芳樟醇（6.57%）、香茅醛（6.47%）含量較高（表1）。成分分析結(jié)果表明，山蒼子精油主要成分為單萜類(lèi)化合物及其氧化物，如D-檸檬烯、月桂烯、檸檬醛、芳樟醇等，總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為59.0361%。有研究表明，D-檸檬烯、檸檬醛、芳樟醇具有抑菌殺菌的作用[20,22-23]，在食品中可用作天然防腐保鮮劑。但也有研究者認(rèn)為植物精油中存在的微量成分對(duì)抑菌活性的影響比植物精油中的主要成分更重要，主要成分與其他活性較弱的微量成分的組合可能會(huì)達(dá)到協(xié)同效應(yīng)[10]，這表明與植物精油的主要成分相比，植物精油的抗菌活性更強(qiáng)。

2.2 山蒼子油對(duì)白假絲酵母菌的抗菌活性

通過(guò)二倍稀釋法確定山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌的MIC為0.25 mg/mL，通過(guò)不同質(zhì)量濃度山蒼子精油處理后白假絲酵母菌的殘菌數(shù)如圖2A所示，確定MFC為1 mg/mL，這與吳均等[24]報(bào)道的山蒼子抑菌活性的MFC有一定的差異，這種差異可能是菌株的特異性造成的。山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌0～24 h的抗菌活性如圖2B所示，陰性對(duì)照組白假絲酵母菌在8～24 h內(nèi)生長(zhǎng)狀況良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。當(dāng)山蒼子精油質(zhì)量濃度達(dá)到MIC（0.25 mg/mL）和MFC（1 mg/mL）時(shí)，則完全抑制白假絲酵母菌的生長(zhǎng)。其中，在山蒼子精油質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL條件下處理4 h，白假絲酵母菌生長(zhǎng)已停滯。

圖2 山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌的抗菌活性Fig.2 Antimicrobial activity of Litsea cubeba essential oil against Candida albicans

2.3 山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌的抑菌機(jī)制

2.3.1 山蒼子精油作用前后白假絲酵母菌菌體微觀形態(tài)分析

用掃描電子顯微鏡觀察山蒼子精油處理前后白假絲酵母菌的微觀結(jié)構(gòu)變化。未經(jīng)山蒼子精油處理的白假絲酵母菌具有完整真菌的獨(dú)特特征，邊界光滑完整，呈橢圓形（圖3A）。與之相反，經(jīng)MIC-山蒼子精油處理后的白假絲酵母菌呈下凹、扭曲、褶皺狀（圖3B）。當(dāng)白假絲酵母菌暴露于MFC的山蒼子精油時(shí)，細(xì)胞明顯破裂，附著成團(tuán)（圖3C）。結(jié)果表明，山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌的細(xì)胞壁有明顯的損傷作用，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化可能是由于膜的溶解和轉(zhuǎn)化。Bajpai等[25]證實(shí)了蠟樣芽孢桿菌形態(tài)的改變是細(xì)胞壁表面惡化、細(xì)胞腫脹、膜破裂所致。

圖3 掃描電子顯微鏡觀察白假絲酵母菌細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Scanning electron microscopic observation of Candida albicans cell morphology

2.3.2 山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌細(xì)胞表面特性的影響

細(xì)胞膜的表面電荷在細(xì)胞的聚集與黏附、物質(zhì)合成分解與運(yùn)輸、信息的傳遞等過(guò)程中起重要作用[26]，表面電荷的改變被認(rèn)為是細(xì)胞對(duì)外部刺激最快的反應(yīng)之一[27]。山蒼子精油作用前后細(xì)胞表面電荷絕對(duì)值變化如圖4所示，與對(duì)照組相比較，經(jīng)MIC和MFC山蒼子精油處理后，菌體表面電荷絕對(duì)值均有所減少。結(jié)果表明，當(dāng)菌體暴露在一定量的山蒼子精油中，其表面電荷會(huì)減少，使細(xì)胞更易聚沉、成團(tuán)，從而影響菌體正常生長(zhǎng)繁殖。

圖4 山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌表面電荷的影響Fig.4 Effect of Litsea cubeba essential oil on surface charge of Candida albicans

2.3.3 山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌細(xì)胞膜完整性的影響

細(xì)胞膜是保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞外環(huán)境影響、維持細(xì)胞內(nèi)平衡的重要屏障。綠色熒光探SYBR Green I和紅色熒光染料PI可用于評(píng)價(jià)細(xì)胞膜的完整性。綠色熒光探針SYBR Green I可以被水解為熒光素，然后熒光素只在細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞中積累。但PI只能通過(guò)受損的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，隨后對(duì)核酸進(jìn)行染色，并發(fā)出紅色熒光[28]。本研究中未經(jīng)山蒼子精油處理的白假絲酵母菌細(xì)胞發(fā)出明亮的綠色熒光（圖5A），表明細(xì)胞膜完整；相反，白假絲酵母菌經(jīng)MIC山蒼子精油處理后，綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱，紅色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（圖5B），表明部分細(xì)胞受到了損傷，而在未受損傷的細(xì)胞中，SYBR Green I的水解性受到了一定程度的抑制。白假絲酵母菌經(jīng)MFC山蒼子精油處理后，幾乎沒(méi)有綠色熒光發(fā)射（圖5C），表明幾乎所有白假絲酵母菌的細(xì)胞膜都被破壞，致使細(xì)胞失活死亡。Liu Xue等[29]證實(shí)了芳樟醇可以穿過(guò)細(xì)胞膜，改變膜組成，增加膜流動(dòng)性，最終破壞細(xì)胞膜完整性。

圖5 山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig.5 Effect of Litsea cubeba essential oil on the cell membrane integrity of Candida albicans

2.3.4 電解質(zhì)泄漏情況分析結(jié)果

細(xì)胞膜具有選擇透過(guò)性，即使膜結(jié)構(gòu)受到輕微損傷，膜的通透性也會(huì)顯著增加，導(dǎo)致離子穩(wěn)態(tài)被破壞，滲透壓調(diào)節(jié)失控，從而使細(xì)胞產(chǎn)生毒性[30]。如圖6所示，經(jīng)MIC和MFC山蒼子精油處理后的白假絲酵母菌細(xì)胞膜受到破壞，相對(duì)電導(dǎo)率明顯高于對(duì)照組。這是因?yàn)殡娊赓|(zhì)從細(xì)胞泄漏到測(cè)試液中，并且隨山蒼子精油的濃度從MIC到MFC的增加，菌體細(xì)胞質(zhì)泄漏量升高。說(shuō)明山蒼子精油能夠破壞菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致胞內(nèi)電解質(zhì)流出，致使細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制或死亡。與本研究結(jié)果類(lèi)似，Ziaee等[20]用何首烏精油彎曲乳桿菌，Cui Haiying等[31]用牛至精油處理耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，Diao Wenru[32]用茴香籽油處理痢疾桿菌，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜通透性增加引起電解質(zhì)泄漏是導(dǎo)致彎曲乳桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、痢疾菌死亡的重要原因之一。

圖6 山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effect of Litsea cubeba essential oil on the electrical conductivity of Candida albicans

2.3.5 胞內(nèi)大分子泄漏情況分析結(jié)果

細(xì)胞膜系統(tǒng)遭到損傷，便會(huì)造成細(xì)菌內(nèi)部多種重要生物大分子（核酸、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)等）泄漏，從而影響正常的合成代謝功能[33]，胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)分別在OD260nm和OD280nm有最大吸收峰[34]。山蒼子精油處理后核酸和蛋白質(zhì)泄漏情況如圖7所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)MIC和MFC的山蒼子精油處理后，胞外菌液中核酸（圖7A）和蛋白質(zhì)（圖7B）的泄漏量明顯增加，其泄漏量與山蒼子精油的質(zhì)量濃度、處理時(shí)間成呈正相關(guān)。表明山蒼子精油能夠破壞菌體細(xì)胞膜，增加其通透性，造成胞內(nèi)大分子物質(zhì)流出，從而導(dǎo)致菌體死亡。張梅等[35]證實(shí)了植物源防腐劑能夠使大腸桿菌、金黃的色葡萄球菌、白假絲酵母菌的胞內(nèi)大分子核酸通過(guò)細(xì)胞膜滲漏到胞外，增加細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞受到不可修復(fù)的破壞。

圖7 山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌胞內(nèi)大分子泄漏的影響Fig.7 Effect of Litsea cubeba essential oil on intracellular macromolecule leakage from Candida albicans

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)GC-MS組分分析鑒定出山蒼子精油由90 種化合物組成，主要為單萜類(lèi)化合物和單萜氧化物，其含量最高的化合物依次是(Z)-檸檬醛（13.28%）、檸檬醛（12.52%）、D-檸檬烯（12.45%）、甲基庚烯酮（7.13%）、芳樟醇（6.57%）、香茅醛（6.47%）。山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌具有良好的抗菌活性，當(dāng)山蒼子精油質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL處理4 h時(shí)，白假絲酵母菌生長(zhǎng)已停滯。通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察菌體的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，山蒼子精油處理白假絲酵母菌菌體后，后者細(xì)胞壁受損，細(xì)胞變形、萎縮，隨著山蒼子精油量的增加，對(duì)細(xì)胞膜的損傷作用增強(qiáng)。此外，山蒼子精油處理后白假絲酵母菌細(xì)胞膜完整性被破壞，通透性增加，胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)失衡，大分子物質(zhì)泄漏，導(dǎo)致白假絲酵母菌代謝紊亂，菌體裂解死亡。本研究初步探究了山蒼子精油對(duì)白假絲酵母菌細(xì)胞膜屏障影響的機(jī)理，可為將山蒼子精油添加在發(fā)酵蔬菜汁和奶制品中抑制白假絲酵母菌提供理論依據(jù)，并對(duì)評(píng)估山蒼子精油及其生物活性化合物在食品加工與保存中的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)利用具有一定的意義。