對(duì)半翅目害蟲具有活性的Bt殺蟲蛋白研究進(jìn)展

孫曉妮, 曹蓓蓓, 束長龍, 耿麗麗, 王澤宇, 張 杰

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害綜合治理全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

農(nóng)作物病蟲害的暴發(fā)為害對(duì)糧食安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。全球每年因病蟲害造成的損失約占作物總損失的35%,其中蟲害損失占病蟲害總損失的14%左右[1-2]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中害蟲種類繁多,半翅目刺吸式口器害蟲已成為我國農(nóng)作物面臨的主要威脅之一,其不僅刺吸植物汁液,絕大多數(shù)種類還可傳播植物病毒。半翅目的稻飛虱、小麥蚜蟲是危害全國主糧生產(chǎn)最重要的兩類害蟲。稻飛虱主要危害水稻,一般可造成水稻產(chǎn)量損失10%～20%,嚴(yán)重時(shí)損失可達(dá)50%甚至絕收;小麥蚜蟲在小麥生產(chǎn)過程中造成損失占比最高,達(dá)33.45%[3]。此外,蝽、木虱、粉虱等其他半翅目害蟲為害棉花、果樹、蔬菜等也造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。長期以來,半翅目害蟲的防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥,然而此類害蟲的生物學(xué)特性促使其對(duì)大多數(shù)化學(xué)殺蟲劑均產(chǎn)生了抗性并長期維持在中等至高等水平[4-5];同時(shí),不科學(xué)地使用化學(xué)殺蟲劑還帶來了農(nóng)藥殘留、食品安全等風(fēng)險(xiǎn),也引發(fā)了環(huán)境污染、生態(tài)失衡等問題。

目前,農(nóng)業(yè)害蟲綠色防控中通常選用微生物殺蟲劑替代化學(xué)殺蟲劑來控制靶標(biāo)害蟲,其中應(yīng)用最廣泛當(dāng)屬以蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)為基礎(chǔ)的微生物殺蟲劑和轉(zhuǎn)Bt基因作物。本文系統(tǒng)地梳理了我國農(nóng)林業(yè)中重要的半翅目害蟲種類、為害特點(diǎn)以及主要防治手段,重點(diǎn)歸納了國內(nèi)外來源于蘇云金芽胞桿菌的殺蟲蛋白對(duì)半翅目害蟲殺蟲活性的研究進(jìn)展,總結(jié)了挖掘具有半翅目殺蟲活性的Bt殺蟲蛋白的基礎(chǔ),并提出了Bt殺蟲蛋白應(yīng)用于半翅目害蟲防治的建議。

1 半翅目害蟲的為害與防治

半翅目Hemiptera是昆蟲綱不完全變態(tài)類昆蟲中數(shù)量最多的目,目前已知物種數(shù)量約10.4萬種[6]。此類昆蟲個(gè)體小、繁殖能力強(qiáng)、種群數(shù)量大、寄主范圍廣,絕大多為植食性,通過刺吸式口器刺吸植物汁液直接引起植物組織壞死,其取食和產(chǎn)卵過程中產(chǎn)生的機(jī)械損傷,分泌的水解酶等化學(xué)物質(zhì)以及排泄至莖稈或葉片表面的“蜜露”使得霉菌更易滋生,間接抑制了寄主植物的呼吸和光合作用[7],甚至一些類群還可傳播多種植物病毒引起植物病毒病,導(dǎo)致作物的產(chǎn)量降低與質(zhì)量下降,是世界上最重要的農(nóng)林害蟲種類。

1.1 我國主要半翅目害蟲及其危害

我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的半翅目害蟲包括飛虱、蚜蟲、粉虱、蝽、葉蟬和木虱(表 1),嚴(yán)重威脅了我國主糧作物、經(jīng)濟(jì)作物以及設(shè)施農(nóng)業(yè)蔬菜等的安全生產(chǎn)。1)飛虱:主要為稻飛虱,是水稻上主要的刺吸式口器害蟲,包括褐飛虱Nilaparvatalugens、白背飛虱Sogatellafurcifera和灰飛虱Laodelphaxstriatellus。稻飛虱在我國年均發(fā)生面積1 600萬hm2左右(數(shù)據(jù)來源https:∥www.natesc.org.cn/),年均損失稻谷10萬～15萬t,其中褐飛虱、白背飛虱被列入農(nóng)業(yè)農(nóng)村部一類農(nóng)作物病蟲害名錄。2)蚜蟲:主要包括荻草谷網(wǎng)蚜Sitobionmiscanthi、禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi、麥二叉蚜Schizaphisgraminum、棉蚜Aphisgossypii、桃蚜Myzuspersicae,為害小麥、大麥等禾本科作物,棉花,瓜類,梨、桃等果樹以及十字花科蔬菜。蚜蟲全國發(fā)生面積約1 300萬hm2,其中禾谷縊管蚜、麥二叉蚜被列入農(nóng)業(yè)農(nóng)村部一類農(nóng)作物病蟲害名錄。3)粉虱:設(shè)施蔬菜上最重要的農(nóng)業(yè)害蟲之一,主要有溫室白粉虱Trialeurodesvaporariorum、黑刺粉虱Aleurocanthusspiniferus和煙粉虱Bemisiatabaci。其中煙粉虱被稱為“超級(jí)害蟲”,被列為最危險(xiǎn)的100種入侵物種之一[8]。4)蝽:常見種類包括綠盲蝽Apolyguslucorum、中黑盲蝽Adelphocorissuturalis、茶翅蝽Halyomorphahalys等,主要為害棉花、果樹以及十字花科蔬菜等。5)葉蟬:半翅目中最大的類群,主要包括大青葉蟬Cicadellaviridis、黑尾葉蟬Nephotettixcincticeps、電光葉蟬Maiestasdorsalis,主要寄主為水稻、小麥、玉米和林木等。6)木虱:包括梨木虱Cacopsyllachinensis、柑橘木虱Diaphorinacitri、梧桐木虱Carsidaralimbata,為害我國梨、柑橘等果樹和梧桐等林木,其中柑橘木虱是柑橘重要病害黃龍病的傳播者。

表1 我國主要半翅目害蟲的危害與防治Table 1 Damages and control of major hemipteran insect pests in China

1.2 半翅目害蟲的防治及其存在問題

長期以來,半翅目害蟲的防治主要由化學(xué)殺蟲劑主導(dǎo),以新煙堿類、有機(jī)磷類、菊酯類等類型為主,常用品種包括吡蚜酮、吡蟲啉、噻嗪酮等?；瘜W(xué)農(nóng)藥能在害蟲大面積暴發(fā)時(shí)快速發(fā)揮作用,挽回?fù)p失,在保障我國糧食供應(yīng)方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。然而,由于蚜蟲、粉虱、飛虱等半翅目害蟲具有種群數(shù)量大、繁殖速度快、適應(yīng)性極強(qiáng)等生物學(xué)特點(diǎn),長期濫用化學(xué)殺蟲劑進(jìn)行防治已造成害蟲抗藥性不斷上升。目前褐飛虱、灰飛虱、棉蚜、煙粉虱等多數(shù)重要半翅目害蟲已對(duì)多種常規(guī)化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生較高抗性[9-10]。灰飛虱已對(duì)毒死蜱、吡蟲啉、氟蟲腈、噻嗪酮和乙蟲腈分別產(chǎn)生了中到高等水平抗性,如對(duì)溴氰菊酯的抗性水平高達(dá)1 072倍[11];棉蚜對(duì)呋蟲胺、噻蟲嗪、啶蟲脒、噻蟲胺、吡蟲啉和噻蟲啉6種新煙堿類殺蟲劑產(chǎn)生了較高水平的抗性,其中對(duì)啶蟲脒、噻蟲胺、吡蟲啉和噻蟲啉的抗性倍數(shù)最高,分別達(dá)2 682、13 756、1 542倍和1 393倍[12]。

除了化學(xué)防治外,其他防治手段也在半翅目害蟲綜合防治中發(fā)揮了一定的作用?？瓜x品種選育是農(nóng)業(yè)防治中主要策略之一,目前已經(jīng)選育出的對(duì)稻飛虱有效的水稻品種包括‘ASD7’‘IR36’‘Mudgo’‘粳秈89’等,抗蚜蟲大豆品種有‘吉科豆1號(hào)’‘吉農(nóng)9號(hào)’等。但是,傳統(tǒng)育種比較困難,周期又長,因此通過應(yīng)用抗性作物品種進(jìn)行半翅目害蟲的防治面臨巨大挑戰(zhàn)。此外,稻虱纓小蜂Anagrusnilaparvatae[13]、煙蚜繭蜂Aphidiusgifuensis[14]等寄生性天敵昆蟲與異色瓢蟲Harmoniaaxyridis[14]、黑肩綠盲蝽Cyrtorhinuslividipennis[15]等捕食性天敵昆蟲在國內(nèi)的半翅目害蟲防治上也有所應(yīng)用,但優(yōu)良天敵昆蟲品種選育艱難,且其工廠化繁育、打破滯育等問題仍然困擾天敵昆蟲大規(guī)模商業(yè)化。

目前已有少量生物源殺蟲產(chǎn)品應(yīng)用于半翅目害蟲的防治,如微生物農(nóng)藥金龜子綠僵菌MetarhiziumanisopliaeCQMa421、球孢白僵菌Beauveriabassiana以及植物源農(nóng)藥印楝素等[16-19],然而這些屈指可數(shù)的生物農(nóng)藥并不能滿足半翅目害蟲為害日益嚴(yán)重的防治需求。

2 蘇云金芽胞桿菌

當(dāng)前,我國農(nóng)作物的病蟲害防治在“預(yù)防為主、綜合防治”基礎(chǔ)上,推行“綠色防控、生態(tài)治理”,尋找綠色安全高效的防治手段、減少化學(xué)農(nóng)藥使用量現(xiàn)已成為全社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。蘇云金芽胞桿菌(Bt)是迄今為止生物防治中應(yīng)用最成功的昆蟲病原細(xì)菌。此類細(xì)菌絕大多數(shù)天然存在于全球各地土壤中,現(xiàn)已從土壤、水、昆蟲尸體、植株根系及葉片等環(huán)境中分離獲得。Bt因其在整個(gè)生命周期中產(chǎn)生不同類型的殺蟲物質(zhì)而聞名于世,其在芽胞形成期產(chǎn)生具有多種形態(tài)的伴胞晶體蛋白— Cry蛋白(crystal protein)和Cyt蛋白(cytolytic protein),在營養(yǎng)生長階段還可合成并分泌營養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip(vegetative insecticidal protein)以及分泌型殺蟲蛋白Sip(secreted insecticidal protein)。目前Bt制劑與轉(zhuǎn)Bt基因植物已成功應(yīng)用于鱗翅目、鞘翅目等咀嚼式口器害蟲的防治。然而,典型的Bt殺蟲晶體蛋白對(duì)半翅目刺吸式口器害蟲的殺蟲活性較低,尚無商業(yè)化應(yīng)用的先例。2018年以來,國內(nèi)外研究人員才陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多個(gè)對(duì)飛虱、蚜蟲等半翅目害蟲有較高殺蟲活性的新型Bt殺蟲蛋白[20-23],這些殺蟲蛋白基因有望開發(fā)轉(zhuǎn)Bt基因植物用于半翅目害蟲的防治,標(biāo)志著稻飛虱等半翅目害蟲的綠色防控取得了突破性進(jìn)展。

2.1 蘇云金芽胞桿菌殺蟲蛋白

Bt殺蟲蛋白種類多,對(duì)多種農(nóng)業(yè)害蟲、線蟲及不同來源的人類癌細(xì)胞均具有生物活性。這些殺蟲蛋白對(duì)鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等農(nóng)林業(yè)重要害蟲以及一些線蟲、原生動(dòng)物和螨蟲具有高效特異的毒殺作用[24]。最初,Bt殺蟲蛋白依據(jù)殺蟲譜的不同分為CryI、CryⅡ、CryⅢ、CryⅣ類;1998年,修訂的四級(jí)命名系統(tǒng)將Bt殺蟲蛋白按照氨基酸相似性程度進(jìn)行分類[25]。隨著基因組測序技術(shù)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的發(fā)展與更新,細(xì)菌殺蟲蛋白命名委員會(huì)根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)特征(如three-domain, Toxin_10/Bin-like, Etx_Mtx2等)并結(jié)合先前的四級(jí)命名系統(tǒng),將細(xì)菌殺蟲蛋白重新定義了17個(gè)類型[25],更好地反映了殺蟲蛋白種類與殺蟲作用方式的多樣性。截至2023年6月,細(xì)菌殺蟲蛋白質(zhì)資源中心已命名并公布了1 075個(gè)Bt殺蟲蛋白(數(shù)據(jù)來源https:∥www.bpprc.org),涵蓋了17類細(xì)菌殺蟲蛋白中的10個(gè)類型[25]:1)Cry(mnemonic retained for three-domain proteins):由3個(gè)核心結(jié)構(gòu)域組成,也稱之為3D-Cry蛋白(three-domain Cry protein)。Cry蛋白是Bt最主要的殺蟲活性成分,多達(dá)755種;2)Mpp(pesticidal proteins with homology to the Etx_Mtx2 family):與Etx_Mtx2家族同源的殺蟲蛋白,已命名32種;3)Tpp(pesticidal proteins with homology to the Toxin_10/Bin family):與Toxin_10/Bin家族同源的殺蟲蛋白,已有30種;4)Gpp(pesticidal proteins with homology to the aegerolysins):與溶血酶(aegerolysins)同源的殺蟲蛋白;5)App(pesticidal proteins with a predominately alpha helical structure):主要具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的殺蟲蛋白;6)Cyt(mnemonic retained for Cyt related proteins):溶細(xì)胞毒素相關(guān)的蛋白,已公布44種;7)Vip(mnemonic retained for Vip3 related proteins):Vip3蛋白家族,多達(dá)131種;8)Vpa(pesticidal proteins related to Vip2 catalytic component):與Vip2催化組分相關(guān)的殺蟲蛋白;9)Vpb(pesticidal proteins related to the binding partner of the Vip1/ Vip2 binary toxin):與二元毒素Vip1/Vip2結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白;10)Xpp(a holding name for pesticidal proteins with currently unclassified homology groups):目前未分類的同源殺蟲蛋白家族。Bt蛋白的殺蟲作用機(jī)理研究主要集中于3D-Cry蛋白,以Cry1A蛋白對(duì)鱗翅目幼蟲的“順序結(jié)合”模型為代表。然而,對(duì)半翅目害蟲有高活性的Bt殺蟲蛋白近幾年才陸續(xù)發(fā)現(xiàn),其殺蟲機(jī)制尚未明確。

2.2 Bt制劑與轉(zhuǎn)Bt基因作物的應(yīng)用

Bt菌株通過發(fā)酵生產(chǎn)制成微生物殺蟲劑產(chǎn)品,此類制劑具有靶標(biāo)特異性、對(duì)非靶標(biāo)生物幾乎無副作用等特點(diǎn)。1938年,全球首個(gè)Bt殺蟲制劑Sporine在法國問世,主要用于防治地中海粉螟Ephestiakuehniella。隨著基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展,研究人員開發(fā)出殺蟲譜廣、殺蟲毒力高的第二代Bt殺蟲劑,如我國第一個(gè)Bt工程菌G033A及其產(chǎn)品[26]。Bt制劑一般為噴霧劑、粉劑、顆粒劑等,可在農(nóng)田、溫室、空中以及水生環(huán)境使用,對(duì)農(nóng)作物以及觀賞植物上的害蟲具有良好防效。Bt制劑在全球生產(chǎn)應(yīng)用已有85年,迄今為止登記產(chǎn)品數(shù)量達(dá)249個(gè)(數(shù)據(jù)來源http:∥www.chinapesticide.org.cn/),成為應(yīng)用最成功的微生物殺蟲劑。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)方面的迅猛發(fā)展,全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積急劇增加。自1996年開始種植以來,目前已有包括玉米、棉花、馬鈴薯、大豆、水稻、甘蔗、白楊、豇豆、番茄和茄子在內(nèi)的10種植物270多個(gè)轉(zhuǎn)Bt基因品種或品系在全球范圍內(nèi)批準(zhǔn)商業(yè)化種植(數(shù)據(jù)來源https:∥www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/)。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲作物面積在全球種植面積達(dá)1億 hm2,這些Bt殺蟲基因主要被用于增強(qiáng)作物對(duì)鱗翅目和鞘翅目害蟲的抗性,包括cry1A、cry1C、cry1F、cry2A、cry3A、cry3Bb1、cry9C、cry34Ab1/cry35Ab1和vip3A。此外,已商業(yè)化的抗半翅目的轉(zhuǎn)Bt基因作物僅有一例,即孟山都公司開發(fā)的表達(dá)Cry51Aa2突變蛋白的轉(zhuǎn)Bt基因棉花用于防治半翅目豆莢草盲蝽Lygushesperus和美洲牧草盲蝽Lyguslineolaris[27]。

3 對(duì)半翅目害蟲有活性的Bt殺蟲蛋白

據(jù)統(tǒng)計(jì),共計(jì)22種Bt殺蟲蛋白對(duì)半翅目害蟲展現(xiàn)出不同程度的殺蟲活性(圖1),這些蛋白依據(jù)結(jié)構(gòu)特征可分為3D-Cry、Cyt、Mpp、Tpp 等4大類。

圖1 對(duì)半翅目害蟲有殺蟲活性的Bt殺蟲蛋白Fig.1 Bt proteins with insecticidal activity against hemipteran pests

3.1 3D-Cry蛋白

目前,已報(bào)道了9種3D-Cry蛋白對(duì)蚜蟲、飛虱、木虱等具有殺蟲活性,其中絕大多數(shù)3D-Cry蛋白對(duì)半翅目害蟲的毒性處于較低水平。1995年,Walters等測試了3D-Cry蛋白對(duì)蚜蟲的殺蟲活性,發(fā)現(xiàn)200 μg/mL Cry2Aa蛋白對(duì)馬鈴薯長管蚜Macrosiphumeuphorbiae成蟲72 h的致死率為92%,同樣條件下360 μg/mL Cry3A、350 μg/mL Cry11A蛋白對(duì)馬鈴薯長管蚜成蟲的致死率分別僅為52%、64%[28]。2009年,Porcar等發(fā)現(xiàn)高濃度的Cry1A、Cry3A、Cry4A、Cry11A對(duì)豌豆蚜Acyrthosiphonpisum若蟲有一定程度的致死作用,經(jīng)胰蛋白酶活化后這些Cry蛋白的殺蟲毒力有所增強(qiáng);蛋白濃度為500 μg/mL時(shí),Cry11A、Cry4A對(duì)豌豆蚜致死率可達(dá)100%,Cry3A蛋白的致死率為60%,而Cry1Ab致死率僅為25%;進(jìn)一步測定發(fā)現(xiàn),Cry4A對(duì)豌豆蚜的致死中濃度(lethal concentration 50, LC50)為70～100 μg/mL[29]。隨后2011年,Li等測試了濃度為500 μg/mL的Cry1Ac對(duì)豌豆蚜2齡若蟲的殺蟲活性,蛋白處理后7 d豌豆蚜的死亡率接近71%[30]。2013年,Shao等發(fā)現(xiàn)Cry1Ab原毒素對(duì)褐飛虱3齡若蟲的LC50為190.23 μg/mL[31],處于低水平殺蟲活性。2014年,Palma等報(bào)道了與Cry41Aa氨基酸序列一致性約40%的Cry41Aa-like蛋白(新命名法命名為Cry73Ba1)對(duì)桃蚜2齡若蟲表現(xiàn)出中等毒性,LC50為32.7 μg/mL[32]。最近5年,僅有3篇關(guān)于Cry1類蛋白對(duì)半翅目害蟲殺蟲活性的報(bào)道。2018年,Shao等發(fā)現(xiàn)Cry1Ac原蛋白或胰蛋白酶激活的Cry1Ac蛋白對(duì)褐飛虱2齡若蟲的死亡率較低,LC50分別為198.92 μg/mL和450.18 μg/mL[33]。2019年,Fernandez-Luna等研究發(fā)現(xiàn)Cry1Ab及Cry1Ba活化毒素對(duì)亞洲柑橘木虱成蟲有殺蟲活性,LC50約為120 μg/mL[34]。2022年,Torres-Quintero等發(fā)現(xiàn)Bt菌株GP919在濃度為10 μg/mL時(shí)對(duì)桃蚜若蟲的致死率為80%以上,LC50為9.01 μg/mL;進(jìn)而研究人員發(fā)現(xiàn),該菌株中胰蛋白酶處理后的Cry1Cb2(約65 kD)對(duì)桃蚜若蟲的LC50為6.58 μg/mL,這是首次報(bào)道3D-Cry蛋白對(duì)半翅目刺吸式害蟲具有較高水平的殺蟲活性[23]。

3.2 細(xì)胞裂解殺蟲蛋白(Cyt)

對(duì)半翅目害蟲具有殺蟲活性的Bt細(xì)胞裂解殺蟲蛋白(Cyt)研究較少,迄今僅有Porcar等測試了≥125 μg/mL的Cyt1Aa會(huì)對(duì)桃蚜若蟲產(chǎn)生體重抑制活性,體重抑制率為40%[29]。

3.3 Etx_Mtx2類殺蟲蛋白(Mpp)

迄今為止,已有來源于蘇云金芽胞桿菌的Mpp家族蛋白Mpp51Aa2以及二元毒素Mpp64Ba/Mpp64Ca對(duì)幾種盲蝽或者飛虱具有中等至高等水平殺蟲活性的報(bào)道。2012年,Baum等發(fā)現(xiàn)Mpp51Aa2對(duì)棉花害蟲豆莢草盲蝽的LC50為72.9 μg/mL[35]。孟山都公司開發(fā)的表達(dá)Cry51Aa2.834_16蛋白(突變改造的Cry51Aa2)的轉(zhuǎn)基因棉花現(xiàn)已被批準(zhǔn)應(yīng)用于豆莢草盲蝽和美洲牧草盲蝽的防治,田間種植可有效控制盲蝽種群,這對(duì)于保護(hù)棉花免受盲蝽的取食危害具有重要的里程碑意義。隨后2018年,本團(tuán)隊(duì)的Liu等從野生菌株Bt 1012中獲得了國際上第一個(gè)對(duì)稻飛虱有高毒力的二元毒素Mpp64Ba/Mpp64Ca,該蛋白組合對(duì)白背飛虱、灰飛虱3齡若蟲的LC50分別為2.14和3.15 μg/mL[20],自此國內(nèi)關(guān)于對(duì)稻飛虱高活性的Bt殺蟲蛋白的研究翻開了新的一頁。

3.4 Toxin_10類殺蟲蛋白(Tpp)

對(duì)半翅目害蟲具有較高毒力的Bt殺蟲蛋白主要屬于Toxin_10類蛋白家族,共10種,占Tpp家族Bt殺蟲蛋白總數(shù)的三分之一。這10種Tpp殺蟲蛋白均由本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)、鑒定,目前均已獲得命名,其殺蟲活性測試的靶標(biāo)害蟲主要為稻飛虱。2018年,本團(tuán)隊(duì)從Bt野生菌株C9F1中克隆獲得了新型Bt殺蟲蛋白—Tpp78Aa1,經(jīng)測試Tpp78Aa1蛋白對(duì)灰飛虱和褐飛虱均展現(xiàn)出較高的殺蟲活性,LC50分別為6.89 μg/mL和15.78 μg/mL[21]。Tpp78Aa1蛋白是全球首例高效毒殺稻飛虱的單一組分Bt蛋白,并且發(fā)現(xiàn)Tpp78Aa1對(duì)幾種蚜蟲同樣具有較強(qiáng)致死作用,LC50為10～30 μg/mL[36],該蛋白晶體結(jié)構(gòu)已于2022年解析[37],建立了Cry78Aa對(duì)稻飛虱的殺蟲作用模型,初步揭示了殺蟲機(jī)理(待發(fā)表資料);因此該蛋白有望應(yīng)用于轉(zhuǎn)Bt基因作物防治多種半翅目刺吸式口器害蟲。2020年,本團(tuán)隊(duì)從Bt野生菌株B4F11中克隆獲得了與Tpp78Aa1同源蛋白Tpp78Ba1,其對(duì)灰飛虱3齡若蟲的LC50為9.72 μg/mL[22]。2023年,本團(tuán)隊(duì)基于生物信息學(xué)分析進(jìn)一步從本實(shí)驗(yàn)室菌株基因組數(shù)據(jù)庫中篩選Tpp家族蛋白編碼序列,并從中成功克隆表達(dá)了8種新型Tpp家族蛋白。其中,Tpp78Ab1、Tpp78Bb1、Tpp78Ca1、Tpp80Ae1 等4種蛋白對(duì)灰飛虱3齡若蟲的LC50分別為8.1、8.6、10.1、9.6 μg/mL,與Tpp78Aa1蛋白的活性相當(dāng);Tpp78Da1、Tpp80Aa3、Tpp80Ac1、Tpp80Ad1等4種蛋白在濃度20 μg/mL時(shí)對(duì)灰飛虱3齡若蟲的校正死亡率分別達(dá)到48.3%、49.6%、47.1%和48.4%,殺蟲活性略低于Tpp78Aa1蛋白[38]。

4 挖掘具有半翅目殺蟲活性的Bt殺蟲蛋白的基礎(chǔ)

前期發(fā)現(xiàn)應(yīng)用最為廣泛的3D-Cry蛋白對(duì)半翅目刺吸式害蟲的活性普遍較低,這可能是由于Bt與半翅目害蟲生態(tài)位的空間隔離、半翅目害蟲特殊中腸環(huán)境的限制、半翅目害蟲腸道結(jié)構(gòu)的阻礙及中腸結(jié)合特異性受體無法正確識(shí)別等諸多因素造成的[33,39-48]。如今高通量測序技術(shù)迭代發(fā)展,以及研究人員對(duì)半翅目害蟲生物學(xué)特性認(rèn)知的不斷更新,均為后期具有高效殺半翅目害蟲活性的Bt殺蟲蛋白的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。

4.1 建立穩(wěn)定的半翅目害蟲室內(nèi)殺蟲活性測定體系

與鱗翅目、鞘翅目等咀嚼式口器昆蟲不同,測定半翅目害蟲室內(nèi)殺蟲活性具有一定難度,因此建立高效穩(wěn)定的半翅目害蟲室內(nèi)殺蟲活性測定體系對(duì)于挖掘具有半翅目殺蟲活性的Bt殺蟲蛋白具有重要意義。半翅目害蟲具刺吸式口器,室內(nèi)殺蟲活性測定需采用人工液體飼料喂食。一方面,蚜蟲、飛虱、粉虱等半翅目害蟲對(duì)人工液體飼料的酸堿性、鹽離子濃度十分敏感,過酸或過堿、鹽離子濃度過高均會(huì)導(dǎo)致試蟲大量死亡,因此針對(duì)不同半翅目害蟲制定適宜的人工液體飼料配方是建立穩(wěn)定的生測體系的第一步。2001年,Fu等通過檢測各種微量元素對(duì)水稻褐飛虱的作用,開發(fā)出能夠使褐飛虱種群成功傳代的D97褐飛虱人工飼料[49],為后續(xù)褐飛虱生測體系的建立奠定了基礎(chǔ)。目前本團(tuán)隊(duì)也已熟練掌握適用于灰飛虱等刺吸式害蟲的液體人工飼料的配制以及“雙層膜飼喂”技術(shù)[50],試驗(yàn)過程中可針對(duì)具體情況適度控制液體飼料的鹽離子濃度等。另一方面,理想的生測裝置是建立穩(wěn)定生測體系的關(guān)鍵因素之一。半翅目害蟲個(gè)體小易溺死,生測過程中受生測裝置內(nèi)濕度影響較大。2015年,本團(tuán)隊(duì)與本單位昆蟲功能基因組研究團(tuán)隊(duì)合作設(shè)計(jì)了新的刺吸式害蟲的生測裝置[51],該裝置符合刺吸式害蟲取食特點(diǎn)且可維持適宜的濕度,使得先前生測對(duì)照組30%左右的死亡率降至10%以下,為后期Mpp64Ba/Mpp64Ca、Tpp78等新型Bt殺蟲蛋白對(duì)半翅目害蟲的殺蟲活性測定提供了可靠的技術(shù)保障。2016年,邵恩斯等發(fā)明了一種可同時(shí)進(jìn)行多組試驗(yàn)的褐飛虱生測裝置,為后續(xù)針對(duì)飛虱、葉蟬、蚜蟲等刺吸式口器害蟲的生測研究提供了技術(shù)支撐[52]。

4.2 建立候選菌株與殺蟲基因資源數(shù)據(jù)庫

候選菌株與殺蟲基因數(shù)據(jù)庫的建立為發(fā)現(xiàn)對(duì)半翅目害蟲具有較高活性的新型Bt菌株與殺蟲基因資源提供了保障。前期研究人員發(fā)現(xiàn)對(duì)半翅目害蟲具有高活性的一些新型Bt殺蟲蛋白在出發(fā)菌株中表達(dá)量普遍偏低(如Tpp78Aa1、Tpp78Ba1)[20,22],利用傳統(tǒng)方法測試菌株總晶體蛋白活性可能會(huì)遺漏一些高殺蟲活性的關(guān)鍵蛋白。因此,建立殺蟲基因資源數(shù)據(jù)庫,優(yōu)先從基因組層面考慮選擇分子量偏小(30～50 kD),且保守結(jié)構(gòu)域明顯區(qū)別于3D-Cry蛋白的新類型的Bt殺蟲蛋白,如Mpp、Tpp等,有助于高效挖掘?qū)Π氤崮亢οx有效的新型Bt殺蟲蛋白。Bt菌株資源庫則是高通量篩選對(duì)半翅目害蟲具有殺蟲活性的Bt菌株的前提,目前Bt菌株資源挖掘仍主要通過土壤分離進(jìn)行篩選。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)手段的不斷發(fā)展,新型Bt基因的發(fā)現(xiàn)不再僅僅使用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,Bt基因的挖掘已經(jīng)上升到基因組水平。2021年,Liu等設(shè)計(jì)了一種全面、高通量的Bt基因挖掘工具— BtToxin_Digger,其可以從數(shù)千個(gè)原始基因組和宏基因組數(shù)據(jù)中挖掘Bt基因[53],作為殺蟲基因資源數(shù)據(jù)庫的儲(chǔ)備。本團(tuán)隊(duì)也有豐富的可供篩選的野生菌株資源,而且已通過高通量測序技術(shù)獲得了6 000株Bt菌株基因組數(shù)據(jù),建立了菌株基因組數(shù)據(jù)拼接、組裝、注釋、比對(duì)等生物信息學(xué)分析平臺(tái)[54]。此外,基于Bt殺蟲蛋白氨基酸序列和細(xì)菌殺蟲蛋白保守結(jié)構(gòu)域特征,以及Bt殺蟲基因連鎖關(guān)系等,建立了成熟的新型Bt殺蟲基因挖掘體系。

5 問題與展望

半翅目害蟲的直接取食與傳播病毒造成的危害已成為農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中的最重大威脅之一。Bt及其殺蟲蛋白將成為控制半翅目害蟲最安全有效的手段之一,因此需加快現(xiàn)有高毒力Bt殺蟲蛋白的開發(fā)與應(yīng)用,進(jìn)一步深入挖掘?qū)Π氤崮亢οx高活性的Bt殺蟲蛋白和菌株資源。未來,Bt及其殺蟲蛋白對(duì)半翅目害蟲的防治工作,應(yīng)從以下幾個(gè)層面考慮:第一,就目前已獲得的幾種殺蟲活性較高的Bt殺蟲蛋白(LC50≤10 μg/mL)而言,不僅要深入了解這些新型Bt殺蟲蛋白的殺蟲機(jī)理,而且應(yīng)針對(duì)半翅目害蟲取食植物韌皮部或木質(zhì)部汁液的為害特點(diǎn),篩選組織特異表達(dá)啟動(dòng)子,開發(fā)符合實(shí)際應(yīng)用要求的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲植物,于半翅目害蟲取食的植物組織中穩(wěn)定表達(dá)Bt殺蟲蛋白,打破二者的生態(tài)隔離。第二,對(duì)于殺蟲活性處于中等水平的Bt殺蟲蛋白(10 μg/mL