合成生物學(xué)助力鏈霉菌天然產(chǎn)物農(nóng)藥創(chuàng)制與產(chǎn)業(yè)化

潘明慧, 楊 雪, 杜國(guó)忠, 李曉瑾, 張艷艷,向文勝,2*, 李珊珊*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193；2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

中國(guó)的生態(tài)環(huán)境多樣,物種資源豐富,以9%的耕地和6%的淡水資源養(yǎng)活了世界上近1/5的人口,是名副其實(shí)的農(nóng)耕大國(guó)。然而,農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常伴隨著嚴(yán)重繁復(fù)的病、蟲、草危害,導(dǎo)致糧食損失可高達(dá)每年總產(chǎn)量的1/3[1]。農(nóng)藥是防控病蟲草害、提高糧食單產(chǎn)最有效的手段,是保障糧食增產(chǎn)豐收的重要支柱。近年來(lái),用于農(nóng)業(yè)病蟲草害防治的化學(xué)農(nóng)藥使用量呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)趨勢(shì),然而,病蟲草害抗藥性、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)殘超標(biāo)以及農(nóng)區(qū)環(huán)境污染等問(wèn)題,仍給國(guó)家糧食安全、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和生態(tài)安全帶來(lái)了隱患。2006年,我國(guó)提出了“公共植保、綠色植?！钡睦砟?開啟了農(nóng)作物病蟲草害綠色防控新征程;2018年以來(lái),藥肥“兩減”“糧豐”國(guó)家重點(diǎn)專項(xiàng)和一系列政策的扶持,進(jìn)一步推動(dòng)了農(nóng)業(yè)病蟲草害綠色防控理念;2021年,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)《“十四五”全國(guó)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展規(guī)劃》,明確優(yōu)先發(fā)展生物農(nóng)藥,走農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展之路;2021年9月,中共中央政治局就加強(qiáng)我國(guó)生物安全建設(shè)進(jìn)行第三十三次集體學(xué)習(xí),習(xí)近平總書記強(qiáng)調(diào):要加快推進(jìn)生物科技創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用,集成推廣生物防治、綠色防控技術(shù)和模式,促進(jìn)人與自然和諧共生,為我國(guó)農(nóng)作物病蟲草害防控和生物農(nóng)藥的發(fā)展指明了方向。

微生物天然產(chǎn)物農(nóng)藥主要是以微生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物為有效成分的農(nóng)藥。鏈霉菌Streptomyces以能夠產(chǎn)生大量活性次級(jí)代謝產(chǎn)物而著稱,是天然產(chǎn)物農(nóng)藥的重要工業(yè)生產(chǎn)菌。鏈霉菌天然活性產(chǎn)物可用作農(nóng)用殺菌劑、殺蟲劑、除草劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,因具有高效、低毒和環(huán)境友好等特點(diǎn),在農(nóng)作物病蟲草害綠色防控中占據(jù)重要地位。截至2022年7月,天然產(chǎn)物農(nóng)藥(主要指農(nóng)用抗生素)在生物農(nóng)藥登記的活性成分總數(shù)中占比超60%,總體產(chǎn)量也占到生物農(nóng)藥總產(chǎn)量的2/3。其中,阿維菌素、井岡霉素、春雷霉素等相關(guān)產(chǎn)品登記超3 500個(gè)[2]。盡管如此,微生物天然產(chǎn)物農(nóng)藥研發(fā)在菌株資源挖掘、新活性化合物發(fā)現(xiàn)及產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中仍面臨若干挑戰(zhàn),這也對(duì)微生物天然產(chǎn)物農(nóng)藥的創(chuàng)制提出了新的要求。

合成生物學(xué)是一門交叉學(xué)科,其以工程化為理念,根據(jù)需求對(duì)生物體進(jìn)行理性設(shè)計(jì)、改造乃至重新合成,創(chuàng)建賦予非自然功能的“人造生命”[3]。合成生物學(xué)的核心內(nèi)涵是“會(huì)聚”,它會(huì)聚了科學(xué)研究帶來(lái)的“發(fā)現(xiàn)能力”,工程學(xué)理念帶來(lái)的“建造能力”,以及顛覆性技術(shù)帶來(lái)的“發(fā)明能力”,從而全面提升社會(huì)的“創(chuàng)新能力”[4]。在技術(shù)飛速發(fā)展的時(shí)代,如何利用合成生物學(xué)技術(shù)助力農(nóng)作物病蟲草害綠色防控是推動(dòng)農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新、保障國(guó)家糧食安全的重要研究?jī)?nèi)容[5]。本文總結(jié)了合成生物學(xué)助力鏈霉菌天然產(chǎn)物農(nóng)藥挖掘、改造及工程化的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用進(jìn)展,為加快農(nóng)作物病蟲草害綠色防控進(jìn)程,保障國(guó)家糧食安全、生態(tài)安全和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全,筑牢國(guó)家生物安全屏障提供參考。

1 鏈霉菌天然產(chǎn)物農(nóng)藥的發(fā)展和應(yīng)用

放線菌門是細(xì)菌最大的門之一,廣泛分布于土壤環(huán)境中,可以有效改善土壤質(zhì)量和肥力[6]。同時(shí),放線菌門的鏈霉菌屬細(xì)菌是天然產(chǎn)物藥物的重要生產(chǎn)者,其產(chǎn)生的若干天然產(chǎn)物在促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及病蟲草害防治方面均具有良好的活性與巨大的應(yīng)用價(jià)值,如阿維菌素(avermectin)、井岡霉素(jinggangmycin)和春雷霉素(kasugamycin)已經(jīng)成為廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物病蟲草害防治的天然產(chǎn)物農(nóng)藥。

鏈霉菌天然產(chǎn)物農(nóng)藥從功能上主要?jiǎng)澐譃闅⒕鷦?bactericide)、殺蟲劑(insecticide)、除草劑(herbicide)和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(plant-growth regulator,PGR)(圖1),在結(jié)構(gòu)上包括聚酮類、多肽類、萜類等主要骨架。我國(guó)天然產(chǎn)物農(nóng)藥的研究迄今有70多年的發(fā)展歷程,成功開發(fā)應(yīng)用了多種農(nóng)藥品種,對(duì)我國(guó)鏈霉菌天然產(chǎn)物農(nóng)藥及其產(chǎn)生菌、應(yīng)用現(xiàn)狀總結(jié)詳見表1。自20世紀(jì)50年代以來(lái),包括滅瘟素-S(blasticidin-S)、春雷霉素、井岡霉素、農(nóng)抗120(agro-antibiotic 120)、寧南霉素(ningnanmycin)、中生菌素(zhongshengmycin)、武夷菌素(wuyiencin)等多種殺菌劑先后問(wèn)世,其中井岡霉素是我國(guó)應(yīng)用面積最廣的天然產(chǎn)物農(nóng)藥之一,廣泛用于水稻紋枯病、棉花立枯病和麥類紋枯病等的防治[7]。1975年,具有高效殺蟲活性的新型生物殺蟲劑阿維菌素被發(fā)現(xiàn),日本科學(xué)家大村智和美國(guó)科學(xué)家威廉 C·坎貝爾作為首次發(fā)現(xiàn)者共同獲得2015年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1984年,阿維菌素在中國(guó)首次被分離鑒定,至今仍廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)。此外,阿維菌素B1母體結(jié)構(gòu)的半合成衍生物甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(簡(jiǎn)稱甲維鹽)對(duì)鱗翅目害蟲的殺蟲活性增強(qiáng),是一種新型高效的殺蟲劑、殺螨劑[8]。微生物除草劑的研究較農(nóng)用殺菌劑、殺蟲劑相對(duì)薄弱,近3年無(wú)微生物除草劑獲批登記[9]。目前微生物除草劑研發(fā)應(yīng)用方面利用最廣的是真菌,如1963年研發(fā)的微生物菌劑“魯保一號(hào)”對(duì)菟絲子有良好防效,是我國(guó)首個(gè)大規(guī)模應(yīng)用的微生物除草劑[9]。此外,雙丙氨膦及其衍生物草銨膦是由鏈霉菌(產(chǎn)綠色鏈霉菌StreptomycesviridochromogenesDSM 40736和吸水鏈霉菌StreptomyceshygroscopicusATCC 21705)產(chǎn)生的非選擇性內(nèi)吸輸導(dǎo)型高效除草劑,能夠抑制光合作用過(guò)程中的光合磷酸化作用,相關(guān)產(chǎn)品廣泛用于防除果園、苗圃、橡膠園等園區(qū)內(nèi)多種一年生和多年生禾本科雜草及闊葉雜草[10]。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的研究多數(shù)集中在植物內(nèi)源激素,如赤霉素類、脫落酸類和細(xì)胞分裂素類等,也有研究者在植物致病菌中發(fā)現(xiàn)了植物外源激素,如冠霉素(coronatine,COR)[11]和生物刺激劑維大力(VDAL)[12]等。鏈霉菌發(fā)酵液中也發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的生長(zhǎng)素,如吲哚乙酸等[13-15],但能作為新農(nóng)藥開發(fā)應(yīng)用的新活性天然產(chǎn)物鮮有報(bào)道。向文勝團(tuán)隊(duì)從藥用植物重樓Parispolyphylla的根際土壤中篩選到一株鏈霉菌Streptomycessp. NEAU6,在其活性代謝產(chǎn)物中分離得到一種核苷類似物——谷維菌素(guvermectin)。利用該活性化合物浸種,可以促進(jìn)水稻根系和胚芽的生長(zhǎng)、分蘗和早熟,增強(qiáng)水稻的抗病性和抗逆性,提高出米率[16],并促進(jìn)玉米在高溫脅迫下的生長(zhǎng)和提高耐受性[17],誘導(dǎo)擬南芥早期開花[18]。2021年,谷維菌素在國(guó)內(nèi)成功注冊(cè)為新型天然植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(原藥登記證號(hào):PD20212929),并技術(shù)轉(zhuǎn)讓于遠(yuǎn)大生科植物保護(hù)(上海)有限公司,相關(guān)產(chǎn)品“福余有佳?”擬上市。

圖1 鏈霉菌代謝產(chǎn)物農(nóng)藥活性成分示例與分類Fig.1 Examples and classification of the natural product biopesticides produced by Streptomyces

2 合成生物學(xué)在天然產(chǎn)物研究中的重要價(jià)值

《禮記·大學(xué)》有言:致知在格物,物格而后知至。合成生物學(xué)的興起和飛速發(fā)展開創(chuàng)了從“格物致知”向“造物致用”的理念轉(zhuǎn)換,最終從工程學(xué)的研究角度落實(shí)到產(chǎn)業(yè)化。合成生物學(xué)以多學(xué)科交叉的相融性,實(shí)現(xiàn)從分析、認(rèn)識(shí)、定量、預(yù)測(cè)到人工設(shè)計(jì)合成生命的科學(xué)跨越,在材料、能源等社會(huì)經(jīng)濟(jì)重要領(lǐng)域以及醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品等人民健康相關(guān)領(lǐng)域都取得了顛覆性進(jìn)展,帶來(lái)了生命科學(xué)領(lǐng)域的第三次革命[41]。聚焦天然產(chǎn)物相關(guān)研究,合成生物學(xué)分別在高效底盤細(xì)胞的優(yōu)化、植物源天然產(chǎn)物的微生物細(xì)胞工廠搭建、微生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物挖掘,以及代謝途徑優(yōu)化改造等方面推進(jìn)了天然產(chǎn)物高效生物制造。

底盤細(xì)胞的選擇及改造是實(shí)現(xiàn)利用合成生物學(xué)方法生產(chǎn)天然產(chǎn)物的基礎(chǔ),研究者們通過(guò)基因組最小化、抗逆性調(diào)整、代謝需求改造、基因編輯工具開發(fā)等,構(gòu)建了大腸桿菌Escherichiacoli[42-43]、谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum[44]、鏈霉菌[45-46]、釀酒酵母Saccharomycescerevisiae[47]等多個(gè)微生物高效底盤細(xì)胞工廠,為天然產(chǎn)物的高效生物合成提供平臺(tái)。萜類化合物青蒿素(artemisinin)是一種治療瘧疾的優(yōu)良植物源天然產(chǎn)物,2015年我國(guó)科學(xué)家屠呦呦因?yàn)樵谇噍锼氐陌l(fā)現(xiàn)及抗瘧疾研究方面的巨大貢獻(xiàn)獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。為了降低青蒿素的生產(chǎn)成本,Keasling團(tuán)隊(duì)克隆了青蒿素生物合成途徑關(guān)鍵酶的編碼基因,在酵母中構(gòu)建了青蒿素合成前體青蒿酸(artemisinic acid)的異源生物合成途徑,并通過(guò)優(yōu)化酵母細(xì)胞工廠,將青蒿酸的產(chǎn)量提高了若干數(shù)量級(jí),具備了工業(yè)化生產(chǎn)的潛力[48-49],相關(guān)研究是利用合成生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)植物源天然產(chǎn)物高效微生物合成的重要里程碑。除此之外,Keasling團(tuán)隊(duì)以半乳糖為原料,在釀酒酵母中完成了大麻素生物合成途徑的異源重構(gòu),實(shí)現(xiàn)了包括大麻萜酚酸(cannabigerolic acid)、四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol)、大麻二酚(cannabinoid)在內(nèi)的多種主要大麻素及其衍生物的生物全合成,開啟了發(fā)酵合成大麻素的新征程[50]。另外,基于合成生物學(xué)使能技術(shù),一線廣譜抗癌藥物紫杉醇及其重要中間體也分別在大腸桿菌[51-53]、釀酒酵母[54-55]中實(shí)現(xiàn)了生物合成途徑的重構(gòu)。伴隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,合成生物學(xué)使能技術(shù)也極大地推動(dòng)了微生物天然產(chǎn)物資源的挖掘[56],以及天然產(chǎn)物高效生物合成途徑的重構(gòu)與優(yōu)化[57-59]。

3 合成生物學(xué)助力鏈霉菌活性資源的發(fā)掘

鏈霉菌是活性天然產(chǎn)物的巨大資源寶庫(kù)。在放線菌產(chǎn)生的超過(guò)13 700余種次級(jí)代謝產(chǎn)物中,超過(guò)80%的天然產(chǎn)物來(lái)源于鏈霉菌。目前臨床和農(nóng)業(yè)上使用的150多種抗生素,約2/3來(lái)源于鏈霉菌天然產(chǎn)物或其衍生物[60]。此外,現(xiàn)代組學(xué)技術(shù)也揭示了鏈霉菌基因組存在大量沉默的生物合成基因簇(biosynthesis gene clusters,BGCs),表明其具有巨大的天然產(chǎn)物合成潛力。利用合成生物學(xué)使能技術(shù),發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)沉默基因簇表達(dá)的小分子和其他刺激因素,助力新活性化合物的表達(dá),將加速對(duì)鏈霉菌天然產(chǎn)物寶庫(kù)的探索與應(yīng)用[61]。

3.1 合成生物學(xué)助力天然產(chǎn)物生物合成基因簇的發(fā)掘

從可培養(yǎng)微生物中發(fā)掘新的活性分子是發(fā)現(xiàn)新型臨床藥物和綠色農(nóng)藥的主要方法[62],挖掘可產(chǎn)生活性物質(zhì)的菌株資源是關(guān)鍵性的一步。鏈霉菌能與多種動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌建立共生體系,它們作為宿主微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成成員,主要通過(guò)與宿主交換化學(xué)信號(hào)而建立穩(wěn)定的相互作用。環(huán)境中的病原微生物形成的選擇壓力能使共生鏈霉菌產(chǎn)生有效的抗菌、抗病等化合物。根據(jù)“內(nèi)共生理論”,共生菌可能產(chǎn)生與其宿主相同或相似的代謝產(chǎn)物[63-65]。因此,從藥用植物、土壤等環(huán)境中篩選鏈霉菌資源,并從中分離具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒的天然活性物質(zhì),為新藥、新活性的綠色天然農(nóng)藥的研發(fā)提供了重要的途徑。但隨著鏈霉菌資源的不斷挖掘,從環(huán)境中分離新種屬的鏈霉菌以及新骨架的天然產(chǎn)物越來(lái)越困難[66-68]。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)和快速發(fā)展,將天然產(chǎn)物研究者的注意力從菌種篩選轉(zhuǎn)向了天然產(chǎn)物合成途徑基因的挖掘。海量基因組測(cè)序數(shù)據(jù)表明,除目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的次級(jí)代謝產(chǎn)物,仍存在大量活性代謝物有待開發(fā),它們可能隱藏在未被充分探索的生態(tài)環(huán)境、未被培養(yǎng)的鏈霉菌以及未被激活的生物合成途徑中[56, 69]。通過(guò)建立基因組學(xué)驅(qū)動(dòng)的大數(shù)據(jù)挖掘策略,能夠?qū)⑦@些生物合成途徑與化學(xué)實(shí)體聯(lián)系起來(lái),推動(dòng)新天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)。

宏基因組、泛基因組和基因組挖掘是目前常用的3種不同規(guī)模下的挖掘策略[70]。宏基因組挖掘策略主要基于共生關(guān)系,建立環(huán)境DNA宏基因組文庫(kù),篩選和識(shí)別次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成途徑,為未培養(yǎng)微生物代謝產(chǎn)物挖掘提供了前所未有的機(jī)會(huì),目前已有多個(gè)研究證明了利用宏基因組從土壤等環(huán)境中挖掘次級(jí)代謝產(chǎn)物的可行性[71-72]。而泛基因組和基因組挖掘則是分別針對(duì)某一菌種的多個(gè)菌株合集和某一特定的放線菌菌株進(jìn)行分析。基于基因組學(xué)驅(qū)動(dòng)的挖掘策略通常以序列相似性、功能特性為導(dǎo)向[73-74]。序列相似性導(dǎo)向是以次級(jí)代謝產(chǎn)物合成過(guò)程中保守相似的序列作為標(biāo)簽,利用基因與化合物結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的關(guān)系指導(dǎo)新化合物的挖掘,如通過(guò)篩選具有保守序列標(biāo)簽的多種土壤樣品,鑒定出7種有效的環(huán)氧酮蛋白酶體抑制劑和兩種稀有色氨酸二聚體天然產(chǎn)物[75-76];以非核糖體肽合成過(guò)程中普遍存在的自由基S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)酶、烯二炔類化合物的核心結(jié)構(gòu)基因PKSE為探針進(jìn)行篩選,豐富了烯二炔、非核糖體肽的種類[77-78]。功能特性導(dǎo)向則是利用抗性基因、顏色表型篩選等進(jìn)行檢測(cè)。利用抗性基因在灰色產(chǎn)色鏈霉菌Streptomycesgriseochromogenes中獲得了滅瘟素的BGC[79]。面對(duì)海量的基因組數(shù)據(jù),人們近年來(lái)陸續(xù)開發(fā)了一系列生物信息學(xué)工具用于分析鏈霉菌的基因組數(shù)據(jù),預(yù)測(cè)天然產(chǎn)物的BGCs。例如antiSMASH作為一個(gè)BGC分析平臺(tái),已被廣泛用于預(yù)測(cè)幾乎所有類型代謝產(chǎn)物的BGCs;TaxiBGC則提供了一個(gè)計(jì)算機(jī)平臺(tái),用于從鳥槍法宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中預(yù)測(cè)試驗(yàn)表征的BGCs及其已知的次級(jí)代謝產(chǎn)物[80]。此外,CORASON[81]、EvoMining[82]、Antibiotic Resistant Target Seeker[83]等基于進(jìn)化關(guān)系的生物信息學(xué)平臺(tái)也逐漸被開發(fā),用于天然產(chǎn)物BGCs的挖掘。

3.2 合成生物學(xué)助力天然次級(jí)代謝產(chǎn)物資源的發(fā)掘

BGCs的深度挖掘?yàn)榘l(fā)現(xiàn)新化合物骨架、新活性天然產(chǎn)物提供了重要的途徑[66],然而,鏈霉菌有大量BGCs在試驗(yàn)條件下仍處于沉默狀態(tài)。利用合成生物學(xué)將BGCs進(jìn)行原位激活或異源表達(dá),實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物由“預(yù)測(cè)”到“產(chǎn)物獲得”的轉(zhuǎn)變是重要的研究?jī)?nèi)容。

通過(guò)調(diào)控BGCs內(nèi)部的關(guān)鍵酶或者特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達(dá)激活沉默基因簇是一種有效方式[84]。例如,聚酮合酶和非核糖體肽中的?；螂幕d體蛋白(carrier protein,CP)需要從無(wú)活性的脫輔基apo形式活化為全酶holo形式才能發(fā)揮作用,該過(guò)程需要在磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(phosphopantetheinyl transferase,PPTase)的催化下完成[85]。利用這一原理,Zhang等通過(guò)過(guò)表達(dá)PPTase激活元件建立了翻譯后修飾激活的方法,在多株鏈霉菌中成功實(shí)現(xiàn)了沉默基因簇的激活[86]。此外,Wang等開發(fā)了一種轉(zhuǎn)錄因子誘餌(transcription factor decoy,TFD)技術(shù),通過(guò)設(shè)計(jì)一段含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的核酸序列作為基因簇阻遏蛋白的誘餌,解除阻遏蛋白對(duì)BGCs表達(dá)的抑制,成功激活鏈霉菌中處于沉默狀態(tài)的多個(gè)BGCs,并獲得一種新化合物oxazolepoxidomycin A[87]。

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因組編輯技術(shù)目前已被用于激活鏈霉菌沉默BGCs[88]。CRISPR技術(shù)可分為靶向激活和非靶向激活兩種方式。CRISPR技術(shù)的靶向激活是在生物信息學(xué)的指導(dǎo)下,精準(zhǔn)地對(duì)鏈霉菌基因組進(jìn)行編輯,以相對(duì)較高的效率啟動(dòng)特定的沉默BGCs的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成。例如,Zhang等利用CRISPR-Cas9技術(shù)將強(qiáng)啟動(dòng)子kasOp*插入玫瑰孢鏈霉菌Streptomycesroseosporus內(nèi)polycyclic tetramate macrolactam(PTM)的相似基因簇,激活基因簇的表達(dá),獲得化合物alteramide A及其衍生物,同時(shí)利用該策略在委內(nèi)瑞拉鏈霉菌Streptomycesvenezuelae中激活了新型色素生物合成基因簇的表達(dá)[89];利用CRISPR的基因轉(zhuǎn)錄激活(CRISPR/dCas-mediated transcriptional activation, CRISPRa)系統(tǒng)和基因轉(zhuǎn)錄干擾(CRISPR/dCas-mediated transcriptional interference, CRISPRi)系統(tǒng),可調(diào)控微生物次級(jí)代謝物生物合成基因的轉(zhuǎn)錄效率,實(shí)現(xiàn)沉默BGCs的可控表達(dá)[90]。CRISPR技術(shù)的非靶向激活則是通過(guò)對(duì)鏈霉菌基因組的編輯隨機(jī)激活潛在的BGCs。例如,Culp等根據(jù)鏈霉素合成基因簇中高度保守的基因序列設(shè)計(jì)單引導(dǎo)(single guide RNA,sgRNA)靶序列,利用CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)11株放線菌的基因組進(jìn)行了編輯,通過(guò)敲除鏈霉素的BGC,成功激活了thiolactomycin、amicetin和5-chloro-3-formylindole的表達(dá)[91]。目前,研究者已經(jīng)開發(fā)了一系列有效的CRISPR工具盒,通過(guò)異源高效元件插入、阻遏蛋白敲除等策略實(shí)現(xiàn)沉默基因簇的激活。相較于傳統(tǒng)的同源重組方法,CRISPR技術(shù)不僅提高了基因操作的成功率,而且也為基因操作困難的鏈霉菌提供了有效的技術(shù)方法,加快了沉默BGCs的原位激活和表征。

異源表達(dá)BGCs也是激活沉默BGCs并獲得目標(biāo)產(chǎn)物的一種有效手段。與原位激活不同,異源表達(dá)繞過(guò)了天然的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),有利于天然產(chǎn)物生物合成途徑的理性設(shè)計(jì)與表達(dá)。但是,異源表達(dá)沉默BGCs面臨兩個(gè)亟待解決的問(wèn)題:構(gòu)建良好的底盤宿主菌株和建立次級(jí)代謝產(chǎn)物BGCs的高效克隆技術(shù)。在底盤宿主菌株構(gòu)建方面,利用CRISPR技術(shù)、Cre-loxP系統(tǒng)等可高效地對(duì)宿主菌的內(nèi)源BGCs進(jìn)行刪除[91],通過(guò)引入多拷貝位點(diǎn)ΦC31-attB增加基因簇拷貝數(shù)[92],以及通過(guò)更改調(diào)控元件、引入外排蛋白等方式優(yōu)化底盤宿主菌[93]。目前利用上述手段已經(jīng)構(gòu)建了白色鏈霉菌Streptomycesalbus、天藍(lán)色鏈霉菌Streptomycescoelicolor等多個(gè)優(yōu)良的底盤宿主。在大片段基因簇克隆方面,目前已經(jīng)建立了多種在體內(nèi)和體外克隆和組裝含有BGC的大片段DNA方法,如Red/ET、TAR、CATCH等[84, 88]。2022年,Liang等利用CRISPR-Cas12a的精準(zhǔn)靶向切割特性和瓊脂糖凝膠包埋制備高質(zhì)量基因組DNA的技術(shù),成功開發(fā)了一種高效克隆/編輯大片段DNA的方法,簡(jiǎn)稱為CAT-FISHING,該方法可獲得長(zhǎng)度高達(dá)145 kb的DNA大片段,為天然產(chǎn)物的發(fā)掘提供了有力的技術(shù)支撐[94]。

3.3 合成生物學(xué)助力新活性分子的獲得

鏈霉菌豐富的BGCs資源及DNA高效克隆技術(shù)為活性天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)提供了可能,而利用合成生物學(xué)設(shè)計(jì)、構(gòu)建自然界中沒(méi)有的生物合成途徑,也逐漸成為獲得新骨架、新活性天然產(chǎn)物的重要方式[95-97]。

組合生物合成(combinatorial biosynthesis)通過(guò)搭建新的生物合成途徑,能夠擴(kuò)展天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性,是獲得新結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物衍生物的研究熱點(diǎn)[98]。對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn),聚酮和非核糖體肽類化合物的結(jié)構(gòu)具有極大的可塑性,目前對(duì)這兩類化合物的生物改造主要可以分為3種,一是以前體為導(dǎo)向,通過(guò)引入不同的起始/延伸單元進(jìn)行改造;二是酶學(xué)水平的修飾;三是生物合成水平的重組[99]。以前體為導(dǎo)向的組合生物合成主要通過(guò)調(diào)控非核糖體肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)的腺苷?；Y(jié)構(gòu)域(adenylation domain,A)及聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)中的酰基轉(zhuǎn)移酶(acyltransferase,AT)結(jié)構(gòu)域引入非天然前體或延伸單元,從而生成多種天然產(chǎn)物衍生物。例如,Kalkreuter等對(duì)苦霉素(pikromycin)延伸模塊的AT結(jié)構(gòu)域進(jìn)行特異性突變后,成功產(chǎn)生了萘內(nèi)酯類似物[100];Ad等通過(guò)突變使AT結(jié)構(gòu)域失活,引入獨(dú)立的反式AT結(jié)構(gòu)域有效摻入氟化延伸單元從而獲得多氟化聚酮產(chǎn)物[101]。在酶學(xué)水平上對(duì)PKS和NRPS進(jìn)行改造,如結(jié)構(gòu)域的替換、模塊的替換以及模塊的合并或刪除,也是獲得新的天然產(chǎn)物的有效途徑[97]。例如研究者針對(duì)6-脫氧-紅霉內(nèi)酯B合酶(6-deoxy-erythronolide B synthase,DEBS)進(jìn)行了多種策略改造,如酮基還原酶結(jié)構(gòu)域的缺失,烯脂酰還原酶的堿基替換,改變硫脂酶的位置等,獲得了一系列的紅霉素衍生物[102];也有研究對(duì)綠色生物農(nóng)藥多殺菌素聚酮合酶基因進(jìn)行異源結(jié)構(gòu)域插入,獲得了殺蟲活性更好的丁烯基多殺菌素[103]。生物合成水平的重組是基于生物合成基因簇模塊間的序列高度重復(fù),通過(guò)選取部分合成模塊進(jìn)行重組,搭建新的生物合成通路。如基于尼可霉素(nikkomycin)和多氧霉素(polyoxin)在結(jié)構(gòu)上的相似性以及在基因簇上的同源性,將兩個(gè)基因簇融合得到polyoxin N等雜合抗生素[104]。綜上,利用組合生物合成,可以從多個(gè)方面對(duì)天然產(chǎn)物合成途徑進(jìn)行合理性改造,助力新藥的開發(fā)和新活性分子的獲得。

鏈霉菌是天然產(chǎn)物資源挖掘的重要源泉,合成生物學(xué)的應(yīng)用推動(dòng)了活性菌株資源與新天然產(chǎn)物的發(fā)掘。同時(shí),合成生物學(xué)使能技術(shù)也將進(jìn)一步推動(dòng)鏈霉菌天然產(chǎn)物高效細(xì)胞工廠的構(gòu)建與高效生物制造。

4 鏈霉菌天然產(chǎn)物高效細(xì)胞工廠構(gòu)建

天然產(chǎn)物作為鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物,通常為生長(zhǎng)非必要的代謝產(chǎn)物。菌株對(duì)這些次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成能力與效率通常難以滿足工業(yè)生產(chǎn)與應(yīng)用的需求[41]。了解并解析鏈霉菌的復(fù)雜代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò),開發(fā)高效的菌株改造元件與途徑重構(gòu)策略是構(gòu)建高效細(xì)胞工廠,實(shí)現(xiàn)鏈霉菌天然產(chǎn)物農(nóng)藥高效生物合成的重要研究?jī)?nèi)容。合成生物學(xué)“5M”策略涵蓋了元件與靶點(diǎn)的挖掘(mine)、模型建立與途徑設(shè)計(jì)(model)、元件組裝與通路搭建(manipulate)、菌株系統(tǒng)測(cè)試(measure)以及工業(yè)智能制造(manufacture)5個(gè)方面,為鏈霉菌高效細(xì)胞工廠的構(gòu)建與生產(chǎn)提供了一種有效的研究范式[33, 105]。

4.1 Mine:元件與靶點(diǎn)挖掘

4.1.1挖掘合成生物學(xué)元件

合成生物學(xué)元件,如啟動(dòng)子、調(diào)控因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等生物元件是構(gòu)建高效細(xì)胞工廠的基礎(chǔ)[106]。美國(guó)麻省理工大學(xué)建立了標(biāo)準(zhǔn)生物元件登記庫(kù),收集注冊(cè)了各種標(biāo)準(zhǔn)化生物元件(registry of standard biological parts,http:∥parts.igem.org/Main_Page)。開發(fā)多樣化的合成生物學(xué)元件將為高效細(xì)胞工廠的構(gòu)建提供豐富的元件支撐。Wang等以天藍(lán)色鏈霉菌內(nèi)的群體信號(hào)調(diào)控系統(tǒng)為研究對(duì)象,對(duì)系統(tǒng)內(nèi)受阻遏蛋白嚴(yán)格負(fù)調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子進(jìn)行改造,獲得了一個(gè)鏈霉菌組成型啟動(dòng)子kasOp*[107]。目前kasOp*已經(jīng)成為應(yīng)用最為廣泛的鏈霉菌啟動(dòng)子之一。在kasOp*的基礎(chǔ)上,Bai等開發(fā)了一系列不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子[108];Li等[109]和Luo等[110]分別基于不同鏈霉菌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)建立了組成型啟動(dòng)子元件庫(kù)。為了代謝適配的需求,多個(gè)鏈霉菌誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)也被開發(fā)并應(yīng)用,如對(duì)異丙基苯甲酸誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)[111]、土霉素(oxytetracycline)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)[112]、木糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)[113]、纖維二糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)[114]等。此外,不依賴于誘導(dǎo)劑的時(shí)序啟動(dòng)子和響應(yīng)特定中間代謝物的特征型啟動(dòng)子也進(jìn)一步被挖掘[115-116],拓展了合成生物學(xué)啟動(dòng)子元件庫(kù)。除誘導(dǎo)系統(tǒng)和時(shí)序性元件外,基于別構(gòu)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子構(gòu)建的動(dòng)態(tài)傳感器(biosensors)能響應(yīng)胞內(nèi)代謝物變化,自適應(yīng)調(diào)控目標(biāo)基因的激活或抑制[117],如群體感應(yīng)系統(tǒng)[118]和響應(yīng)前體乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A[119]的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等,是高通量篩選、動(dòng)態(tài)切換胞內(nèi)代謝流的新型合成生物學(xué)元件。伴隨著合成生物學(xué)元件庫(kù)的擴(kuò)增,各元件之間的干涉效應(yīng)以及性能的表征尤為重要。絕緣子RiboJ被開發(fā)用于不同回路間干涉效應(yīng)的消除[120]、特性表征[121]以及模塊化性能提升[108]。除上述元件外,碳源利用和產(chǎn)物外排轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的挖掘和應(yīng)用也是構(gòu)建天然產(chǎn)物高效細(xì)胞工廠的重要手段[122]。在阿維鏈霉菌Streptomycesavermitilis中過(guò)表達(dá)麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)通路的malEFG-a提高了菌株對(duì)淀粉的利用效率,在縮短發(fā)酵周期的同時(shí)將阿維菌素產(chǎn)量提升了2.6倍[123];過(guò)表達(dá)阿維菌素的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AvtAB,使阿維菌素活性組分B1a胞內(nèi)與胞外產(chǎn)量的比率從6∶1下降到4.5∶1,總產(chǎn)量提升50%[124]。Chu等[125]開發(fā)了即插即用(tunable plug-and-play exporter,TuPPE)的聚酮類天然產(chǎn)物外排轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),通過(guò)增強(qiáng)產(chǎn)物外排顯著提升聚酮類農(nóng)藥的生物合成效率。合成生物學(xué)元件的開發(fā)和改造為構(gòu)建鏈霉菌高效細(xì)胞工廠提供了重要的工具支撐。

4.1.2挖掘有效操縱靶點(diǎn)

理想的細(xì)胞工廠能夠最大化將碳源用于目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成,然而該代謝過(guò)程受到調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的嚴(yán)格控制。鏈霉菌具有十分復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò),簡(jiǎn)單地調(diào)控目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成途徑難以滿足產(chǎn)業(yè)化的需求。因此,深度解析鏈霉菌代謝調(diào)控機(jī)制、挖掘影響鏈霉菌活性代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的有效靶點(diǎn)是構(gòu)建高效細(xì)胞工廠的重要研究?jī)?nèi)容。解析鏈霉菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制,如常見的SARP家族(Streptomycesantibiotic regulatory proteins)、TetR家族、LAL家族(large ATP-binding regulators of the LuxR family)等,將為重定向碳流分布,提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量提供重要指導(dǎo)。例如,過(guò)表達(dá)fredericamycin(FDM)生物合成途徑內(nèi)的激活轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子fdmR1使灰色鏈霉菌StreptomycesgriseusATCC 49344生產(chǎn)的FDM A產(chǎn)量提升6倍[126];通過(guò)解析鏈霉菌內(nèi)源的群體感應(yīng)系統(tǒng),Tian等[127]結(jié)合CRISPRi技術(shù)對(duì)Streptomycesrapamycinicus的三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)、脂肪酸合成和氨基酸合成途徑進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)整,最終使rapamycin產(chǎn)量提升約660%。此外,Wang等基于途徑特異性的代謝物響應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,開發(fā)了紅霉素響應(yīng)的MphR生物傳感器,并通過(guò)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome-binding site,RBS)微調(diào)mphR表達(dá)水平優(yōu)化傳感器的靈敏度,結(jié)合微流體熒光激活液滴分選(fluorescence-activated droplet sorting,FADS)對(duì)生產(chǎn)紅霉素的紅色糖多孢菌Saccharopolysporaerythraea文庫(kù)進(jìn)行了精確的高通量篩選,從野生型菌株和高產(chǎn)工業(yè)菌株中分別獲得了產(chǎn)量提高6.8倍和超過(guò)100%的突變體[128],這對(duì)高產(chǎn)工程菌株的進(jìn)一步改造和篩選都具有重要意義。

鏈霉菌的代謝和調(diào)控機(jī)制在自然進(jìn)化過(guò)程中演變得十分復(fù)雜,使得大部分關(guān)鍵基因仍未被發(fā)現(xiàn)。比較基因組學(xué)技術(shù)能夠在全基因組水平上挖掘影響天然產(chǎn)物生物合成和代謝的關(guān)鍵基因。Zhang等通過(guò)對(duì)比鹽霉素(salinomycin)高產(chǎn)菌株與野生型菌株的基因組差異,發(fā)現(xiàn)了白色鏈霉菌中鹽霉素合成的競(jìng)爭(zhēng)基因簇和負(fù)調(diào)控基因[129];Liu等[130]通過(guò)比較分析米爾貝霉素(milbemycins)高產(chǎn)菌株冰城鏈霉菌StreptomycesbingchenggensisBC04和野生型菌株BC-101-4的基因組,篩選出133個(gè)與產(chǎn)量相關(guān)的候選基因,進(jìn)一步對(duì)3個(gè)初級(jí)代謝相關(guān)的靶點(diǎn)基因進(jìn)行組合表達(dá),將米爾貝霉素A3/A4產(chǎn)量提升了26.7%。此外,利用合成生物學(xué)使能技術(shù)進(jìn)行的非理性改造建立了“基因型→表型”的反向遺傳篩選,不僅能夠在基因組規(guī)模挖掘影響菌株產(chǎn)量的操縱靶點(diǎn),同時(shí)可以進(jìn)一步深化對(duì)菌株的代謝認(rèn)知。RNA干擾(RNAi)和轉(zhuǎn)座子測(cè)序(transposon sequencing,Tn-seq)技術(shù)結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)將基因型與表型相關(guān)聯(lián),能夠篩選與目標(biāo)化合物產(chǎn)量相關(guān)的基因。近些年CRISPR/Cas技術(shù)的快速發(fā)展和創(chuàng)新,不僅革新了基因編輯的方式,也拓展了其在大規(guī)模、可示蹤的反向遺傳篩選的應(yīng)用,通過(guò)設(shè)計(jì)sgRNA構(gòu)建全基因組擾動(dòng)文庫(kù),將CRISPRi篩選與菌株目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量相關(guān)聯(lián),獲取提升產(chǎn)量的潛在有益靶點(diǎn)。Liu等在谷氨酸棒桿菌中構(gòu)建了靶向397個(gè)外排蛋白的sgRNA陣列文庫(kù),篩選到了目前唯一已知的L-脯氨酸外排蛋白,通過(guò)過(guò)表達(dá)該外排蛋白使胞外脯氨酸產(chǎn)量提升了約100%[131]。這些有效操縱靶點(diǎn)的挖掘策略為構(gòu)建鏈霉菌高效細(xì)胞工廠提供重要的技術(shù)支撐。

4.2 Model:模型建立與途徑設(shè)計(jì)

從細(xì)胞全局角度認(rèn)知并理解鏈霉菌生理代謝特性對(duì)拓展代謝改造的靶向性十分必要[132]。基因組尺度生物模型(genome-scale biological models,GSBMs)通過(guò)模擬細(xì)胞的生理活動(dòng)以及與環(huán)境的相互作用,能夠更深入地理解微生物的生理特性,進(jìn)而反映微生物系統(tǒng)的復(fù)雜性和全面性。生物模型主要包括代謝網(wǎng)絡(luò)模型、轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型等。截至2019年,在鏈霉菌中共搭建和改造了9個(gè)GSBMs,涵蓋StreptomycescoelicolorA3(2)、S.clavuligerusATCC 27064等共8株鏈霉菌[133]?；蚪M尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型(genome-scale metabolic models,GSMMs)是基于基因組學(xué)數(shù)據(jù)并結(jié)合試驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得的細(xì)胞生理代謝反應(yīng)的全局代謝網(wǎng)絡(luò),用于表征基因-蛋白-反應(yīng)(gene-protein-reaction,GPR)間的關(guān)系。利用GSMM預(yù)測(cè),結(jié)合多種遺傳改造的方法對(duì)菌株進(jìn)行定向改造,并結(jié)合穩(wěn)定性同位素標(biāo)記試驗(yàn)驗(yàn)證代謝流,為系統(tǒng)代謝工程研究及高效細(xì)胞工廠構(gòu)建提供指導(dǎo)。Huang等搭建了FK506生產(chǎn)菌株Streptomycestsukubaensis的GSMM,通過(guò)模擬預(yù)測(cè)提升生物合成中前體和輔因子NADPH供應(yīng)的潛在靶點(diǎn),結(jié)合基因編輯技術(shù)進(jìn)行靶點(diǎn)組合試驗(yàn)驗(yàn)證,獲得產(chǎn)量提升1.47倍的高產(chǎn)菌株[134]。Razmilic等在StreptomycesleeuwenhoekiiC34的GSMMiVR1007中也預(yù)測(cè)到增強(qiáng)前體供應(yīng)的相關(guān)靶點(diǎn),經(jīng)基因編輯后有效提升了chaxalactin、chaxamycin的產(chǎn)量[135]。此外,Sulheim等[136]利用Sco-GSMM對(duì)異源表達(dá)“超級(jí)宿主”——天藍(lán)色鏈霉菌M1152及其母本菌株M145的蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及培養(yǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行了代謝差異性分析,其結(jié)果有助于M1152作為異源宿主的代謝改造?；蚪M尺度的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(transcriptional regulatory network,TRNs)和GSMMs在同一時(shí)期興起,但TRNs的發(fā)展速度相對(duì)較慢。TRNs描述的是微生物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子及σ因子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。其中,RNA聚合酶核心酶作為一個(gè)多通路樞紐,通過(guò)與不同的σ因子相互作用,控制胞內(nèi)資源分配,以協(xié)調(diào)微生物的生長(zhǎng)和生產(chǎn)[137]。為了實(shí)現(xiàn)微生物細(xì)胞工廠的高效性,自上而下的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)工程從最上層的核心RNA聚合酶到主調(diào)控層,再到較低的調(diào)控層,確保胞內(nèi)資源的整體轉(zhuǎn)換和精確調(diào)整?；蚪M尺度生物模型為構(gòu)建鏈霉菌高效細(xì)胞工廠提供了重要理論指導(dǎo)。

4.3 Manipulate:元件組裝與通路搭建

基于對(duì)生物合成基因簇的深度解析,結(jié)合基因組規(guī)模網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)及合成生物學(xué)元件的適配,對(duì)菌株進(jìn)行更深層次的遺傳操縱和改造。針對(duì)底物、代謝流、產(chǎn)物3個(gè)方面進(jìn)行改造和重設(shè)計(jì),同時(shí)以開發(fā)的誘導(dǎo)系統(tǒng)、生物傳感器、時(shí)序性表達(dá)等合成生物學(xué)元件進(jìn)行適配表達(dá)是構(gòu)建高效細(xì)胞工廠的常用且高效的策略。此外,CRISPR技術(shù)因其高效、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),已經(jīng)成為基因編輯操作中極其重要的技術(shù)手段。首先對(duì)于底物利用,碳源的選擇和優(yōu)化以及吸收轉(zhuǎn)運(yùn)是關(guān)鍵。Jin等[138]鑒定了鏈霉菌的糖吸收系統(tǒng),同時(shí)利用時(shí)序性啟動(dòng)子微調(diào)其表達(dá)水平,有效提高了聚酮類天然產(chǎn)物農(nóng)藥米爾貝霉素A3/A4、阿維菌素的活性組分B1a和尼莫克丁(nemadectin)的發(fā)酵產(chǎn)量。對(duì)代謝流的重設(shè)計(jì)包括但不限于前體供應(yīng)、輔因子及能量供給等方面[139]。Yu等[140]通過(guò)組合過(guò)表達(dá)巴豆酰輔酶A羧化酶和乙酰輔酶A羧化酶,在吸水鏈霉菌中搭建FK520合成的前體丙二酸單酰輔酶A和乙基丙二酸單酰輔酶A供應(yīng)模塊,使FK520的搖瓶產(chǎn)量提升至3 511.4 mg/L。此外,Yu等[141]在搭建前體、還原力和能量供應(yīng)模塊的同時(shí),倍增了脂肪酸合成途徑,使脂肪酸的得率達(dá)到最大理論產(chǎn)量的40%。鏈霉菌作為抗生素的主要生產(chǎn)菌,已經(jīng)進(jìn)化出了抵抗機(jī)制來(lái)防止自身毒性,例如產(chǎn)物外排蛋白、相關(guān)的調(diào)控系統(tǒng)等,通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白工程或調(diào)控因子改造增加產(chǎn)物外排來(lái)提升菌株自身的耐藥性,這也是提高產(chǎn)量的重要策略之一[142-143]。Wei等[144]闡述了Streptomycesgraminearus中TetR家族轉(zhuǎn)錄因子GouR激活谷氏菌素外排泵蛋白GouM的表達(dá),從而提升菌株谷氏菌素的產(chǎn)量。

盡管高效的合成生物學(xué)元件以及功能單元模塊的搭建能夠有效提升天然產(chǎn)物的合成效率,但仍有部分化合物的原生菌遺傳背景以及復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)仍不清晰,導(dǎo)致了產(chǎn)物的合成能力受限,針對(duì)這類天然產(chǎn)物的生物合成,異源表達(dá)技術(shù)為其高效合成提供了可能。選擇遺傳背景研究較為清晰的菌株作為出發(fā)菌株,并通過(guò)基因組的最小化[44]、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的簡(jiǎn)化進(jìn)一步優(yōu)化底盤細(xì)胞。其中白色鏈霉菌,因其能夠利用高效碳源——油脂的優(yōu)勢(shì),常被作為抗生素高效合成的底盤細(xì)胞[145]。與此同時(shí),基因簇克隆技術(shù)(大片段組裝技術(shù))也應(yīng)運(yùn)發(fā)展,如CATCH[146]、ExoCET[147]、CAT-FISHING[94]、CAPTURE[148]等。上述元件組裝、通路搭建和高效底盤構(gòu)建技術(shù)為鏈霉菌高效細(xì)胞工廠研發(fā)提供了重要的技術(shù)策略支撐。

4.4 Measure:菌株系統(tǒng)測(cè)試

深度測(cè)序、多組學(xué)分析、高通量篩選等技術(shù)的發(fā)展為我們深度認(rèn)知微生物的代謝調(diào)控規(guī)律,掌握菌株培養(yǎng)過(guò)程的系統(tǒng)參數(shù)提供了重要的技術(shù)支撐,并推動(dòng)了菌株代謝途徑的優(yōu)化以及高效微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建,是合成生物學(xué)在微生物天然產(chǎn)物創(chuàng)制與產(chǎn)業(yè)化研究中的重要環(huán)節(jié)。

4.4.1篩選目標(biāo)表型菌株

獲得高產(chǎn)天然產(chǎn)物生產(chǎn)菌株是鏈霉菌研發(fā)的重要目標(biāo)。目前,高效液相色譜分析仍是確定菌株產(chǎn)量,篩選高產(chǎn)菌株的主要方法,該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)菌株產(chǎn)量的精確定量,但是在大規(guī)模篩選過(guò)程中,效率相對(duì)較低。為了提高菌株篩選效率,研究者開發(fā)了雙報(bào)告基因篩選法(reporter-guided mutant selection,RGMS),利用目標(biāo)BGC關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子控制報(bào)告基因,可實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因的表達(dá)水平與目標(biāo)BGC的表達(dá)水平的偶聯(lián),在固體平板上實(shí)現(xiàn)目標(biāo)菌株的高效篩選。利用該策略,Xiang等實(shí)現(xiàn)了克拉維酸clavulanic acid高產(chǎn)棒狀鏈霉菌Streptomycesclavuligerus的高效篩選[149],Guo等高效篩選到激活杰多霉素(jadomycin)和gaudimycin沉默BGCs的委內(nèi)瑞拉鏈霉菌S.venezuelae菌株[150]。鏈霉菌的菌絲體形態(tài)限制了基于流式細(xì)胞儀的高通量篩選技術(shù)在鏈霉菌中的應(yīng)用。Bai等建立了委內(nèi)瑞拉鏈霉菌原生質(zhì)體制備技術(shù),以綠色熒光蛋白基因?yàn)閳?bào)告基因,利用流式細(xì)胞儀實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)菌株的高通量篩選[108]。為了解決原生質(zhì)體與發(fā)酵環(huán)境不匹配和存活率低等問(wèn)題,Tu等開發(fā)了基于微液滴的熒光分選技術(shù),以變鉛青鏈霉菌S.lividans66的菌絲體為篩選單元,實(shí)現(xiàn)了每小時(shí)篩選10 000個(gè)突變體的鏈霉菌高通量篩選[151]。此外,別構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子(allosteric transcription factors,aTFs)因具備能夠結(jié)合胞內(nèi)中間代謝物和抗生素等小分子化合物的特點(diǎn),已被用于開發(fā)為穩(wěn)定、靈敏的高通量體外小分子檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)能夠定量菌株發(fā)酵產(chǎn)物中目標(biāo)化合物的濃度,用于高產(chǎn)菌的高效篩選[152]。上述這些高通量菌株篩選策略對(duì)高效獲得鏈霉菌高產(chǎn)細(xì)胞工廠提供了重要的技術(shù)支撐。

4.4.2揭示天然產(chǎn)物生物合成的代謝和調(diào)控機(jī)制

為了更好地認(rèn)識(shí)菌株胞內(nèi)代謝分布和代謝瓶頸,建立代謝和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型,實(shí)現(xiàn)對(duì)菌株再認(rèn)知、再改造、再優(yōu)化的螺旋式上升,單一組學(xué)已經(jīng)不能滿足我們的需求。新一代測(cè)序技術(shù)、高分辨質(zhì)譜技術(shù)、多組學(xué)整合分析方法以及數(shù)據(jù)庫(kù)信息不斷完善,組學(xué)技術(shù)已經(jīng)逐漸發(fā)展為以多組學(xué)為主的技術(shù)手段,包括基因組學(xué)(genomics)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)、蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)、代謝組學(xué)(metabolomics)和通量組學(xué)(fluxomics)等。這些組學(xué)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用與數(shù)據(jù)分析為系統(tǒng)認(rèn)知菌株代謝與調(diào)控、預(yù)測(cè)新靶標(biāo)、設(shè)計(jì)重構(gòu)菌株代謝與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并獲得高效細(xì)胞工廠提供了重要的支撐[153-154]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)已被廣泛應(yīng)用于研究鏈霉菌生長(zhǎng)過(guò)程中形態(tài)-生理分化的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。例如Jeong等通過(guò)對(duì)天藍(lán)色鏈霉菌S.coelicolorA3(2)不同生長(zhǎng)階段全基因組范圍內(nèi)轉(zhuǎn)錄與翻譯關(guān)系的系統(tǒng)研究,發(fā)現(xiàn)翻譯控制同樣影響著該菌株次級(jí)代謝基因的表達(dá),改造翻譯控制系統(tǒng)可以為提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量提供新策略[155]。He等通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析阿維菌素高產(chǎn)菌和低產(chǎn)菌之間的轉(zhuǎn)錄水平差異基因,發(fā)現(xiàn)了明顯下調(diào)表達(dá)的TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SAV151,通過(guò)敲除該轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)現(xiàn)可以將ATCC31267菌株的阿維菌素產(chǎn)量提高一倍[156]。代謝組學(xué)旨在整體上定性和定量小分子代謝物,是天然產(chǎn)物研究中的重要組學(xué)技術(shù)[157]。Tian等通過(guò)比較代謝組學(xué)分析了SAM添加對(duì)菌株代謝的影響,發(fā)現(xiàn)了影響阿維菌素生物合成的前體代謝物,并開發(fā)了組合添加前體代謝物的策略,顯著提高了阿維菌素的產(chǎn)量[158]。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),通過(guò)比較蛋白質(zhì)表達(dá)水平能夠挖掘與天然產(chǎn)物生物合成相關(guān)的蛋白,也可以通過(guò)研究生長(zhǎng)過(guò)程中蛋白質(zhì)豐度的變化,揭示菌株生長(zhǎng)和生產(chǎn)中涉及的生物過(guò)程和代謝途徑的調(diào)控。Gallo等對(duì)擬無(wú)枝酸菌Amycolatopsisbalhimycina巴爾赫霉素(balhimycin)生產(chǎn)前和生產(chǎn)過(guò)程中的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較分析,揭示了與生產(chǎn)相關(guān)的主要代謝途徑[159]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析還可以研究與許多不同代謝過(guò)程相關(guān)的翻譯后修飾。Huang等采用基于高分辨質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)紅霉素產(chǎn)生菌紅色糖多孢菌的乙酰化蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)了乙?；鞍讌⑴c蛋白質(zhì)合成、糖酵解/糖異生、TCA循環(huán)、脂肪酸代謝、次級(jí)代謝等若干重要代謝途徑[160]。

多組學(xué)相結(jié)合的方法能夠在不同水平上認(rèn)知細(xì)胞的生理狀態(tài),從而更全面地揭示天然產(chǎn)物生物合成代謝和調(diào)控機(jī)制,為制定高產(chǎn)策略提供依據(jù)。Wang等利用代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、通量組學(xué)等分析技術(shù)揭示了胞內(nèi)三酰甘油(triacylglycerols,TAGs)在鏈霉菌初級(jí)代謝與次級(jí)代謝的“代謝轉(zhuǎn)換”中的關(guān)鍵作用,并建立了基于該認(rèn)知的動(dòng)態(tài)降解TAG的聚酮類天然產(chǎn)物高產(chǎn)策略,顯著提高了多種鏈霉菌聚酮化合物的產(chǎn)量,將阿維菌素的180 t發(fā)酵罐產(chǎn)量提高到9.31 g/L[161]。表達(dá)多殺菌素時(shí)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)不到目標(biāo)產(chǎn)物,Tan等基于轉(zhuǎn)錄組學(xué),蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等數(shù)據(jù),在不同水平上確定了阻礙多殺菌素在變鉛青鏈霉菌S.lividansTK24和白色鏈霉菌S.albusJ1074中異源表達(dá)的限速步驟,并通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化,將多殺菌素在白色鏈霉菌J1074中產(chǎn)量提高了1 000倍[162]。這些組學(xué)技術(shù)提升了我們對(duì)鏈霉菌的代謝和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)認(rèn)知,為進(jìn)一步工程化改造鏈霉菌,構(gòu)建高產(chǎn)工程菌株奠定了新的基礎(chǔ)。

4.5 Manufacture:工業(yè)智能制造

Manufacture是指將工業(yè)菌株從實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大到工業(yè)規(guī)模進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。下面簡(jiǎn)述幾種成功產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的天然產(chǎn)物農(nóng)藥。

4.5.1阿維菌素

阿維菌素是唯一一個(gè)年產(chǎn)值達(dá)到30億元的生物農(nóng)藥,最早由美國(guó)默克公司將其開發(fā)為殺蟲劑并實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。我國(guó)阿維菌素的研發(fā)始于1984年,上海市農(nóng)藥研究所沈寅初院士團(tuán)隊(duì)從廣東揭陽(yáng)土壤中分離到阿維菌素生產(chǎn)菌株7051菌株,該菌株于1992年轉(zhuǎn)讓給海門制藥廠(浙江海正藥業(yè)股份有限公司前身)進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn),相關(guān)成果先后獲得上海市一等獎(jiǎng)(1995年)、化工部一等獎(jiǎng)(1997年)和國(guó)家科技進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)(1999年)。李季倫院士團(tuán)隊(duì)于1986年開始研究阿維菌素,將其搖瓶發(fā)酵單位從最初的50～100 mg/L提高到3 500～4 000 mg/L,并在1996年與齊魯制藥廠合作完成了阿維菌素中試生產(chǎn),在30 t發(fā)酵罐上的發(fā)酵單位達(dá)到3 000 mg/L,在1998年,齊魯制藥廠正式投入阿維菌素工業(yè)化生產(chǎn)。李季倫院士團(tuán)隊(duì)的阿維菌素相關(guān)研究成果獲得了2006年國(guó)家科技進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)。2013年1月,張立新教授主持的973項(xiàng)目“合成微生物體系的適配性研究”正式啟動(dòng),旨在運(yùn)用新興的合成生物學(xué)手段大幅度提高阿維菌素的發(fā)酵單位。通過(guò)與企業(yè)合作,在120～550 t發(fā)酵罐中,將阿維菌素B1a的產(chǎn)量提高至9 000 mg/L以上,并通過(guò)優(yōu)化分離提取工藝,將阿維菌素的市場(chǎng)價(jià)格降低至500元/kg。2015年9月,中國(guó)成為阿維菌素原藥全球唯一生產(chǎn)國(guó)。張立新教授團(tuán)隊(duì)相關(guān)研究成果榮獲了2016年度國(guó)家科技進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)。

目前,在國(guó)內(nèi)進(jìn)行阿維菌素及衍生物農(nóng)藥登記的企業(yè)有10余家[163],其中阿維菌素原藥主要來(lái)自于齊魯制藥(內(nèi)蒙古)有限公司、寧夏泰益欣生物科技有限公司、河北威遠(yuǎn)生物化工有限公司、河北興柏藥業(yè)集團(tuán)公司和海正藥業(yè)集團(tuán)5家企業(yè)。

4.5.2井岡霉素

井岡霉素是由吸水鏈霉菌井岡變種S.hygroscopicusvar.jinggangensis產(chǎn)生的氨基糖苷類化合物,能夠有效防治水稻紋枯病,在亞洲各產(chǎn)區(qū)廣泛使用[153]。井岡霉素的有效成分為井岡霉素A,具有持效長(zhǎng)、耐雨水沖刷、環(huán)境安全、成本低廉等優(yōu)點(diǎn),是一種理想的生物農(nóng)藥[20]。井岡霉素最初由浙江省桐廬匯豐生物科技有限公司生產(chǎn),目前我國(guó)共有5家企業(yè)將井岡霉素A作為殺菌劑進(jìn)行了農(nóng)藥登記。

5 展望

2022年聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織公開信息表示,解決糧食安全的重要途徑之一是減少病蟲害帶來(lái)的損失,其中農(nóng)藥的使用必不可少。在未來(lái),我國(guó)將繼續(xù)堅(jiān)持走農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展道路,堅(jiān)持建立病蟲草害綠色防控體系,因此,創(chuàng)制高效、低毒、生態(tài)友好的綠色新農(nóng)藥,并不斷降低綠色農(nóng)藥的使用成本,是未來(lái)農(nóng)藥研發(fā)與推廣應(yīng)用的重要研究方向。其中,以活性代謝產(chǎn)物為有效成分的微生物天然產(chǎn)物農(nóng)藥新品種的創(chuàng)制,是未來(lái)綠色新農(nóng)藥研發(fā)的重要目標(biāo)。

20世紀(jì)中期是微生物天然產(chǎn)物挖掘的黃金時(shí)代,產(chǎn)生了大量以鏈霉素、阿維菌素為代表的鏈霉菌天然產(chǎn)物藥物。但受傳統(tǒng)菌株篩選及天然產(chǎn)物挖掘技術(shù)手段的限制,新骨架和新活性化合物的開發(fā)與發(fā)現(xiàn)步伐減緩;同時(shí)耐藥性問(wèn)題日益凸顯,特別是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中作物重大病蟲草害耐藥性問(wèn)題突出、新發(fā)突發(fā)重大病蟲草害缺少可有效使用的天然產(chǎn)物農(nóng)藥。這些問(wèn)題都對(duì)微生物天然產(chǎn)物新農(nóng)藥的研發(fā)提出了新要求。合成生物學(xué)作為一門交叉學(xué)科,其“會(huì)聚”特性給微生物天然產(chǎn)物新農(nóng)藥創(chuàng)制帶來(lái)了機(jī)遇,它的興起與快速發(fā)展重新打開了微生物天然產(chǎn)物農(nóng)藥挖掘與改造的大門。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展,積累了海量鏈霉菌基因組數(shù)據(jù),結(jié)合生物信息學(xué)與機(jī)器學(xué)習(xí)手段,已經(jīng)逐漸成為發(fā)現(xiàn)新骨架、新活性天然產(chǎn)物的重要研究策略,也是天然產(chǎn)物新農(nóng)藥創(chuàng)制的重要研究?jī)?nèi)容。與此同時(shí),“5M”策略在微生物天然產(chǎn)物新農(nóng)藥的發(fā)現(xiàn)與推廣應(yīng)用之間架起了重要的橋梁,極大地推動(dòng)微生物天然產(chǎn)物農(nóng)藥高效細(xì)胞工廠的構(gòu)建與綠色生物制造。將合成生物學(xué)“格物致知,造物致用”的研究理念融入新農(nóng)藥創(chuàng)制的研究方向,將突破現(xiàn)有微生物天然產(chǎn)物農(nóng)藥創(chuàng)制的瓶頸,為我國(guó)農(nóng)作物病蟲草害綠色防控體系提供充足的綠色農(nóng)藥儲(chǔ)備,在進(jìn)一步保障國(guó)家糧食安全、筑牢國(guó)家生物安全屏障的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。