植物病原真菌對殺菌劑抗性的研究進展

吳小美, 王海霞, 云英子, 馬忠華*

(1. 浙江大學生物技術研究所，浙江省作物病蟲生物學重點實驗室，杭州 310058；2. 鎮(zhèn)江市植保植檢站，鎮(zhèn)江 212002；3. 福建農(nóng)林大學植物保護學院，閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室，福州 350002)

殺菌劑在植物病害防治中發(fā)揮著重要作用,然而隨著藥劑的長期使用,病原菌抗藥性問題也日趨嚴重,成為制約藥劑防治效果和使用壽命的重要因素之一。20世紀70年代之前所使用的殺菌劑幾乎都是保護性殺菌劑,作用位點多,不易引發(fā)病原菌產(chǎn)生抗藥性,但是隨著殺菌劑的發(fā)展進入高效、內(nèi)吸、作用位點較為單一的內(nèi)吸型殺菌劑時代以來,殺菌劑抗性問題愈發(fā)普遍和嚴重,已成為化學防治所面臨的一大挑戰(zhàn)。

由于病原菌對殺菌劑的抗性可以隨著病原菌的繁殖而穩(wěn)定遺傳給后代,病原菌的抗性群體在藥劑的選擇壓力下會逐步擴展,進而使得病菌群體對殺菌劑的敏感性整體下降。病原菌的抗藥性主要是由病原菌的單個或者多個基因突變造成的,在自然條件下抗性菌株在病菌群體中出現(xiàn)的頻率很低,因此不會影響殺菌劑對病害的防治效果。但是,由于殺菌劑的連續(xù)使用,在持續(xù)的藥劑選擇壓力下,敏感菌株生長繁殖受到抑制,抗藥菌株得以迅速生長和繁殖,在病菌群體中逐漸占優(yōu)勢地位,從而導致殺菌劑的防效下降甚至失效?？剐跃甑倪m合度(包括溫度適應性、產(chǎn)孢和致病能力等)決定了抗性菌株群體的發(fā)展趨勢。如果抗性菌株適合度低,在自然環(huán)境中生存力弱,那么一旦停止使用殺菌劑,抗性菌株的種群比例就會下降;但是如果抗性菌株與敏感菌株的適合度相似,在自然界能夠保持良好的生長繁殖和致病能力,則容易導致田間殺菌劑抗性問題[1]?？傮w來說,病原菌對殺菌劑產(chǎn)生抗性的機制主要包括以下幾種情況:1)殺菌劑作用靶點突變導致藥劑與靶標的結合能力降低;2)殺菌劑靶標基因的過量表達;3)病菌對殺菌劑外排能力或代謝分解能力增強。除此之外,近來研究發(fā)現(xiàn),表觀遺傳在病菌抗藥性中也發(fā)揮重要作用。

本文對幾類常用殺菌劑的抗藥性現(xiàn)狀及抗性機制進行綜述,包括:苯并咪唑類殺菌劑(benzimidazole,BZD)、肌球蛋白抑制劑(myosin inhibitor)、甾醇脫甲基抑制劑(sterol demethylation inhibitor,DMI)、QoI類抑制劑(quinone outside inhibitor,QoI)、琥珀酸脫氫酶抑制劑(succinate dehydrogenase inhibitor,SDHI)以及二甲酰亞胺類殺菌劑(dicarboximide,DC)。在此基礎上,介紹幾種殺菌劑抗性快速檢測技術的研究進展。

1 殺菌劑抗性的分子機制

1.1 苯并咪唑類殺菌劑

苯并咪唑類殺菌劑是一類以苯并咪唑環(huán)為母體的內(nèi)吸廣譜性殺菌劑,其代表藥劑有苯菌靈、多菌靈以及甲基硫菌靈等。該類藥劑自20世紀60年代投入市場以來,在多種病害防控中發(fā)揮了重要作用。該類殺菌劑靶向病菌的β-tubulin蛋白,通過抑制微管蛋白組裝而阻斷細胞分裂[2]。由于長期使用,目前已有100多種真菌對苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生了抗性[3]。病菌對該類藥劑的抗性多由菌體內(nèi)靶蛋白的突變所致(表1)。在大多數(shù)抗性菌株中,β-tubulin基因的單堿基突變導致單個氨基酸的改變,影響藥劑與靶標的結合能力,進而產(chǎn)生抗藥性[4-5]。研究發(fā)現(xiàn),β-tubulin基因上第6、50、167、198、200、235或者第240位密碼子的突變均會導致病原菌對苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生抗性[1,6-7],其中以E198A/G/K/Q和F200Y突變最為常見[6],且不同位點氨基酸的突變導致的菌體抗藥性水平不同。在實生鏈核盤菌Moniliniafructicola中,β-tubulin上第6和第198位氨基酸的突變分別導致菌株產(chǎn)生低水平和高水平抗藥性[8];在蘋果黑星病菌Venturiainaequalis中,β-tubulin上第198和第200位氨基酸的突變分別導致菌株產(chǎn)生中等水平和高水平抗性[9];在禾谷鐮孢復合種Fusariumgraminearumcomplex中,β-tubulin上F167Y或F200Y突變導致菌株產(chǎn)生中等水平抗性[10-11],E198A或E198L突變則導致病菌的高水平抗性[12-13]。另外,β-tubulin基因同一位點密碼子的不同突變也會使菌株產(chǎn)生不同水平的抗性;例如,在Tapesiayallundae的抗性菌株中,β-tubulin上第198位氨基酸如果由谷氨酸突變?yōu)楸彼?、甘氨酸、賴氨酸或者谷氨酰?可導致突變菌株對該類藥劑產(chǎn)生不同水平的抗性,抗性菌株EC50的變化范圍為0.5～25 μg/mL[14]。

Duan等[15]對2017年-2018年從我國6省份黃瓜上采集的619株黃瓜褐斑病菌Corynesporacassiicola進行靶基因β-tubulin序列比較分析,首次發(fā)現(xiàn)含有3種雙突變E198A和M163I,E198A和F167Y,以及E198A和F200S的抗性菌株,其中,雙突變E198A和M163I分布廣、頻率高,成為C.cassiicola優(yōu)勢抗性種群。與E198A單突變菌株相比,3種雙突變菌株對苯并咪唑類藥劑的抗性水平更高,且對多菌靈、苯菌靈和噻菌靈產(chǎn)生很強的交互耐藥性。該研究表明,隨著藥劑使用量的增加和使用時間的延長,對苯并咪唑中等水平抗性的單突變抗性菌株可能會進一步演變?yōu)楦咚娇剐缘碾p突變菌株。

通常情況下,與敏感菌株相比,抗性菌株的適合度可能有不同程度的改變。Yan等[16]通過實驗室藥劑馴化誘導獲得了串珠鐮孢Fusariummoniliforme抗性菌株,發(fā)現(xiàn)其β-tubulin上第5位氨基酸發(fā)生突變同時導致病菌對低溫的敏感性增強。在田間發(fā)現(xiàn)的實生鏈核盤菌M.fructicola的多菌靈抗性菌株β-tubulin上第6位氨基酸發(fā)生突變后對低溫也更敏感[8]。然而,有些抗性菌株對高溫表現(xiàn)敏感,例如,M.fructicolaβ-tubulin上第198位突變以及核果鏈核盤菌M.laxa第240位氨基酸突變菌株都對高溫敏感[8,17],此外,從田間分離到的抗甲基硫菌靈的木瓜蒂腐病病菌Lasiodiplodiatheobromae的產(chǎn)孢能力明顯低于敏感菌株[18]。任璐等[19]對室內(nèi)誘導的抗甲基硫菌靈的瓜類白粉病菌Podosphaerafusca的適合度進行研究發(fā)現(xiàn),在無藥劑壓力下,突變體的產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、侵染頻率及引起的病情指數(shù)均顯著低于親本。當前,苯并咪唑類殺菌劑仍然在多種作物上登記使用,因此,監(jiān)測該類殺菌劑的抗性、解析新的抗性機制對藥劑的合理使用仍有現(xiàn)實意義。

1.2 肌球蛋白抑制劑

在真核細胞中,肌球蛋白與絲狀肌動蛋白及其伴侶蛋白結合,通過水解ATP將生物能轉化為機械力,而機械力對細胞分裂、囊泡運輸?shù)雀鞣N細胞活動至關重要[105]。因此,肌球蛋白可以作為一個全新的藥靶,用于開發(fā)新型殺菌劑。氰烯菌酯是江蘇農(nóng)藥研究所有限公司研發(fā)的對鐮刀菌引起的作物病害(例如小麥赤霉病、水稻惡苗病)有特效的新藥劑,該藥劑直接作用于病原菌的Ⅰ型肌球蛋白(MyoⅠ),并抑制其ATP酶活性[106-107]。對禾谷鐮孢Fusarium graminearumMyoⅠ晶體結構的分析表明,氰烯菌酯的結合位點位于MyoⅠ與肌動蛋白結合的變構口袋中,當氰烯菌酯與MyoⅠ結合時,變構口袋變形,使得MyoⅠ不能與肌動蛋白結合,進而使得MyoⅠ失去活性[108]。由于MyoⅠ對鐮刀菌生長和真菌毒素生物合成至關重要,MyoⅠ抑制劑不僅抑制真菌生長,還顯著減少脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的產(chǎn)生[106]。

浙江大學生物技術研究所作物病蟲生物學重點實驗室從2008年開始,連續(xù)10多年監(jiān)測田間赤霉病菌對氰烯菌酯的抗性情況,到目前為止,沒有發(fā)現(xiàn)田間赤霉病菌對氰烯菌酯產(chǎn)生抗藥性問題。與赤霉病菌不同的是,目前田間已經(jīng)發(fā)現(xiàn)水稻惡苗病病原藤倉鐮孢Fusarium fujikuroi對氰烯菌酯產(chǎn)生抗性(表1)。Wu等[21]檢測了2017年-2018年浙江省F.fujikuroi對氰烯菌酯的抗性情況,結果發(fā)現(xiàn),其對氰烯菌酯的抗性頻率從2017年的18%增加到2018年的47%?？剐詸C制研究發(fā)現(xiàn),F.fujikuroi的MyoⅠ密碼子218或219位發(fā)生突變導致其產(chǎn)生抗藥性。

連鎖零售業(yè)實體企業(yè)的產(chǎn)業(yè)在商品流通的過程中，展現(xiàn)了一條完整的產(chǎn)業(yè)鏈。這個時候，就需要針對實際情況，構建合作共同體。但是在傳統(tǒng)的理念上，連鎖性零售業(yè)實體企業(yè)僅僅就擔負了銷售商品的主要任務，而且這樣就顯得銷售渠道過于單一。因此，這個時候，不少企業(yè)就開始加入了零售業(yè)的電商范疇，還有不少代理商，直接在天貓與淘寶平臺上展開銷售業(yè)務，這樣不僅壓縮了實體零售企業(yè)利潤空間，而且也提升了實體零售企業(yè)的競爭力。

1.3 甾醇脫甲基抑制劑(DMI)

DMI類是最大的一類殺菌劑,靶向真菌麥角甾醇的合成途徑,其作用靶標為CYP51基因編碼的14α脫甲基酶,抑制麥角甾醇前體24-亞甲基二氫羊毛甾醇(24-methylenedihydrogenlanosterol)的l4位上脫甲基化[109]。自20世紀70年代投入市場以來,多種植物病原真菌對DMI類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性,包括:大麥白粉病菌Erysiphe graminisf.sp.hordei[22]、蘋果黑星病菌Venturia inaequalis[40,110]、指狀青霉Penicillium digitatum[36,111]、瓜類白粉病菌P.fusca[112]、櫻桃葉斑病菌Blumeriella jaapii[41]、實生鏈核盤菌M.fructicola[44]、香蕉黑條葉斑病菌Mycosphaerella fijiensis[23]、玉米黑粉病菌Ustilago maydis[24]以及小麥發(fā)酵殼針孢Zymoseptoria tritici[25,27]等。研究表明,植物病原真菌對DMI的抗性機制主要包括:1)CYP51基因點突變;2)CYP51基因高表達(表1)。

1.3.1CYP51基因點突變導致對DMI的抗性

由于DMI類藥劑長期用于防治小麥病害,20世紀90年代首先在歐洲發(fā)現(xiàn)了抗DMI的小麥發(fā)酵殼針孢Z.tritici菌株;抗性菌株Cyp51上至少存在17種氨基酸突變類型,包括第107位天冬氨酸突變?yōu)槔i氨酸、第134位天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼嵋约暗?36位纈氨酸突變?yōu)楸彼岬萚26,28]。對2019年-2020年采自愛沙尼亞的353株大麥柱隔孢葉斑病菌Ramularia collo-cygni的抗性菌株進行CYP51基因測序發(fā)現(xiàn),Cyp51蛋白的氨基酸序列存在6種突變,即I381T、I384T、S459C/Y/T/L,其中第459位絲氨酸突變?yōu)榘腚装彼?S459C)最為常見,該位點2019年平均發(fā)生頻率為80%,2020年為79%[29]。

DMI類藥劑對麥類作物的白粉病有良好的防治效果,但由于長期大量使用,很多地區(qū)的麥類白粉病菌已對其產(chǎn)生抗性。白粉病菌對DMI類藥劑的抗性也是由CYP51基因的點突變所致,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗性突變位點包括:小麥白粉病菌的S79T、Y136F、K175N以及大麥白粉病菌的Y136F、K147Q、Y137F、S524T等[30-32]。此外,葡萄白粉病菌Uncinula necator對三唑醇的高水平抗性由Cyp51的Y136F突變所致;有趣的是,在自然情況下U.necator中存在A、B兩種群體,這兩類菌群在產(chǎn)孢能力、致病性和地理分布等方面存在明顯差異,A、B兩種菌群的Cyp51蛋白第37和156位氨基酸不同,B類菌群相比于A類菌群對三唑類藥劑更加敏感,且更易發(fā)生第136位氨基酸點突變(Y136F)[33]。由于三唑類藥劑的長期使用,在部分法國葡萄園中,含有Y136F點突變的B類菌群抗性菌株已占到病菌群體的90%以上[34,48]。與U.necator存在兩個菌群相類似,Tapesia acuformis和T.yallundae是引起麥類眼斑病的2個近緣種。T.acuformis對DMI類中的三唑亞類藥劑具有抗性卻對咪唑亞類藥劑敏感,而T.yallundae對這兩亞類藥劑均敏感。研究發(fā)現(xiàn),T.yallundae和大多數(shù)絲狀真菌中Cyp51第180位氨基酸均為苯丙氨酸,而T.acuformis中Cyp51第180位為亮氨酸,可能由于第180位氨基酸的不同導致了這2種病原菌對DMI類藥劑敏感性的差異[113]。另外,值得注意的是,同一種病菌的Cyp51上存在多個點突變,不同點突變的組合可以引起病菌對DMI產(chǎn)生不同的抗藥性水平[38]。

1.3.2CYP51基因高表達導致對DMI的抗性

已有研究表明,CYP51基因的高表達能夠?qū)е虏【鷮MI類藥劑產(chǎn)生抗性。目前,真菌中存在幾種調(diào)控CYP51基因高表達的分子機制。在人類病原菌白色念珠菌Candida albicans中,CYP51基因拷貝數(shù)的增加導致該基因高表達,進而引起病菌對DMI類藥劑產(chǎn)生抗性[35]。在植物病原真菌中,CYP51基因高表達常由基因啟動子區(qū)的序列變異所致 (表1)。例如,指狀青霉P.digitatum抗性和敏感菌株的CYP51基因的編碼區(qū)序列完全一致,但在抗性菌株的CYP51基因啟動子區(qū)域有5個串聯(lián)的126bp特異性重復序列,而在敏感菌株中只有1個;將抗性菌株的CYP51基因啟動子區(qū)轉化到敏感菌株中,轉化子對DMI表現(xiàn)抗性;相反,將抗性菌株中126bp特異性重復序列從5次串聯(lián)降至2次串聯(lián),轉化子對DMI的抗性水平也相應下降;表明抗性菌株啟動子區(qū)域的126bp特異性重復序列的插入引起CYP51基因高水平表達,從而使菌株對DMI產(chǎn)生抗性[36]。此外,在多種植物病原菌抗性菌株中均檢測到CYP51基因啟動子區(qū)的改變,包括:蘋果黑星病菌V.inaequalis[40]、櫻桃葉斑病菌B.jaapii[41-42]、實生鏈核盤菌M.fructicola[43-45]和小麥發(fā)酵殼針孢Z.tritici[46-47]等。在這些病菌的抗性菌株中,CYP51基因啟動子區(qū)均發(fā)現(xiàn)插入片段,不同病菌中插入片段大小不同,從65bp到幾千個堿基不等;插入片段中含有轉錄調(diào)控因子的順式元件,進而導致CYP51基因高水平表達;但目前在這些病菌中尚沒有找到作用順式元件的轉錄調(diào)控因子。

研究還發(fā)現(xiàn),盡管釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中僅含有1個CYP51基因,但多種病原真菌中含有2～3個CYP51基因[1]。例如,指狀青霉中含有2個CYP51基因(PdCYP51A和PdCYP51B),除了先前報道的PdCYP51A啟動子區(qū)126bp重復串聯(lián)序列導致的DMI抗性之外,PdCYP51B啟動子區(qū)的195bp或199bp序列插入同樣可以導致對DMI的抗性,并且該插入比PdCYP51A啟動子區(qū)126bp重復串聯(lián)序列更為穩(wěn)定[37-39]。

1.4 QoI類藥劑

自從1996年第一個QoI藥劑醚菌酯投入市場以來,目前已有21個QoI藥劑被成功開發(fā)用于防治各類植物病害,然而抗藥性問題成為制約該類藥劑防效的重要因素。QoI抗性最早發(fā)生在德國北部的小麥白粉病菌群體,之后小麥發(fā)酵殼針孢Z.tritici中也發(fā)生了QoI抗藥性問題,目前至少有47種植物病原菌對QoI藥劑產(chǎn)生了抗性。

QoI類藥劑通過與真菌細胞色素b和c1復合體Qo部位結合而阻斷呼吸作用的電子傳遞,從而抑制真菌的生長[114-115]。在大多數(shù)病原真菌的QoI抗性菌株中,細胞色素b基因cyt b的點突變導致了病菌對該類藥劑產(chǎn)生抗性,而且第143位的甘氨酸突變?yōu)楸彼?G143A)是最為常見的突變類型 (表1)。例如,在巴西的中部和南部,稻瘟病菌Pyricularia oryzaeG143A突變類型從2005年占群體的36%上升到2012年的90%[50];在愛沙尼亞,大麥柱隔孢葉斑病菌R.collo-cygni中G143A突變基因型在病菌群體中的比例達到80%[29],導致QoI藥劑失去防治效果。此外,第129位或137位上氨基酸突變也可以導致QoI抗性[115]。例如,大豆銹病病菌Phakopsora pachyrhiziCytb上F129L突變導致病菌對QoI產(chǎn)生抗性[52];核桃瘡痂病菌 Venturia effusa對QoI的抗性由G137S所致[53];葡萄霜霉病菌Plasmopara viticola的抗性菌株中存在F129L和G143A2種點突變;小麥褐斑病菌Pyrenophora tritici-repentis的抗性菌株中則發(fā)現(xiàn)F129L、G137R和G143A3種突變類型[54-55]。研究發(fā)現(xiàn),Cytb不同的點突變類型導致不同的抗性水平,一般情況下,F129L和G137R/S導致病菌對QoI產(chǎn)生中低水平抗性,而G143A則引起高水平抗性[1,15,52]。

研究發(fā)現(xiàn),多數(shù)情況下,G143A突變不引起病菌適合度的改變。在灰葡萄孢Botrytis cinerea中,G143A突變的QoI抗性菌株在菌絲生長、產(chǎn)孢和致病性等生物學特性上與敏感菌株類似[60];在葡萄白粉病菌U.necator中,在QoI藥劑篩選壓力下,G143A突變的QoI抗性菌株在實驗室和田間條件下都能夠穩(wěn)定生長,在無藥劑篩選的情況下,抗性菌株也可以在田間穩(wěn)定存在[59];在互隔鏈格孢Alternaria alternata中,QoI抗性菌株的適合度也沒有改變,甚至在一些柑橘品種上QoI抗性菌株的致病力更強[61]。與田間自然產(chǎn)生的抗性菌株不同,在實驗室誘導獲得的由G143S突變所致的稻瘟病菌抗性突變體的適合度下降[51]。另外,含G143A的Venturia inaequalis、Podosphaera fusca和Phytophthora megasperma抗性菌株,其適合度也有所下降[62]。值得一提的是,研究發(fā)現(xiàn),如果緊鄰著CYT b第143位密碼子之后有內(nèi)含子,病菌不容易產(chǎn)生G143A突變。釀酒酵母緊接著G143之后含有1個內(nèi)含子,在酵母中G143A的點突變使得其后的內(nèi)含子不能正確剪接,使得菌體不能形成成熟的CYT bmRNA,菌體的呼吸功能受損,在自然條件下難以生存[63]。

除了細胞色素b的點突變外,其他生理生化機制的改變也可能導致菌體對QoI產(chǎn)生抗性。在小麥發(fā)酵殼針孢Z.tritici中,交替呼吸途徑中交替氧化酶(alternativeoxidase,AOX)的高表達也會導致病菌對QoI藥劑敏感性降低[64]。

1.5 琥珀酸脫氫酶抑制劑(SDHI)

琥珀酸脫氫酶抑制劑(SDHI)類殺菌劑作用于病原菌線粒體呼吸系統(tǒng)的復合物Ⅱ(即琥珀酸脫氫酶),通過抑制真菌的呼吸作用,進而抑制病原菌生長。琥珀酸脫氫酶是真菌呼吸鏈的重要組分,由黃素蛋白SdhA、鐵硫蛋白SdhB及2種嵌膜蛋白SdhC、SdhD等4個亞基組成;嵌膜蛋白SdhC和SdhD將SdhA和SdhB固定在內(nèi)膜上,且具有泛醌還原酶活性[116]。SDHI類殺菌劑通過完全或者部分占據(jù)琥珀酸脫氫酶泛醌的位點,抑制了電子從琥珀酸到泛醌的傳遞,干擾呼吸鏈上復合體Ⅱ電子傳遞,阻止其產(chǎn)生能量,進而達到抑制病原菌生長的效果[117]。

20世紀60年代,第一個SDHI殺菌劑萎銹靈進入市場,主要作為種子處理劑,防治擔子菌引起的真菌病害。20世紀80-90年代,新一代SDHI殺菌劑滅莠胺、氟酰胺、呋吡菌胺和噻呋酰胺等陸續(xù)上市,這4個藥劑主要防治水稻病害,防病譜相對較窄。2003年,巴斯夫公司成功研發(fā)了第一個內(nèi)吸廣譜性SDHI殺菌劑啶酰菌胺,可用于防治白粉病、灰霉病、莖腐病等多種病害。隨后,許多廣譜高效的SDHI類殺菌劑陸續(xù)上市,目前,已有23種SDHI類殺菌劑投入市場,在植物病害防治中發(fā)揮重要作用。隨著SDHI類殺菌劑的大量使用,目前Alternaria alternata、A.solani、Botrytis cinerea、Blumeriella jaapii、C.cassiicola、D.bryoniae、 F. graminearum、M.fructicola、P.fusca、Pyrenophora teres、R.collo-cygni、S.sclerotiorum、大蒜匐柄霉葉枯病Stemphylium vesicarium、U.nuda和V.inaequalis等20多種真菌已經(jīng)對該類藥劑產(chǎn)生了抗藥性,特別是抗SDHI的灰霉病菌已在世界各地發(fā)現(xiàn)[65,67-72,74-76,118]。盡管氟唑菌酰羥胺2019年年底才在我國登記用于防治小麥赤霉病,但在2021年病菌抗藥性監(jiān)測中,Shao等在田間已經(jīng)檢測到高抗該藥劑的小麥赤霉病菌[77]。

研究表明,病原菌對SDHI類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性多是由靶標琥珀酸脫氫酶突變所致,目前已發(fā)現(xiàn)至少27種發(fā)生在琥珀酸脫氫酶的SdhB、SdhC和SdhD這3個亞基上的氨基酸突變可以導致病菌產(chǎn)生抗藥性[65]。其中,以SdhB亞基上泛醌結合位點組氨酸突變?yōu)槔野彼嶙顬槌Ｒ?也偶有發(fā)現(xiàn)組氨酸突變?yōu)榱涟彼峄蛘呔彼?表1)。研究發(fā)現(xiàn),大麥柱隔孢葉斑病菌R.collo-cygni 在SdhB發(fā)生N224T、R264P、H266R/Y/L、B-T267I、B-I268V突變,以及SdhC發(fā)生T7S、Q8R/P、Q9L、A65P、A81P、N83S、N87S、G91R、A121G、H146R/L、R152M、H153R、K156N、K161N、N164H/P、G167D、G171D、V184L等多種突變,導致病菌對氟唑菌酰胺和啶酰菌胺等SDHI類藥劑產(chǎn)生抗性[29,78]?；移咸焰逽dhD第132位組氨酸突變?yōu)榫彼?H132R)、第230位天冬氨酸突變?yōu)榱涟彼?N230I)以及第272位組氨酸突變?yōu)榱涟彼?H272L)導致病菌產(chǎn)生抗藥性[66]。然而,目前尚未有報道表明SdhA亞基發(fā)生突變可引起抗藥性。

1.6 二甲酰亞胺類殺菌劑

二甲酰亞胺類殺菌劑是20世紀70年代初推出的一類廣譜性殺菌劑,被廣泛用于防治B.cinerea、M.fructicola以及Sclerotiniaspp.和Alternariaspp.引起的多種真菌病害。代表藥劑有乙烯菌核利、腐霉利、菌核凈和異菌脲等。由于二甲酰亞胺類殺菌劑的廣泛使用,多種植物病原真菌對該類藥劑產(chǎn)生了抗藥性,影響了藥劑的防效;尤其在灰霉病的防治中,抗性菌株的普遍存在導致該藥劑在全世界很多地區(qū)失去防效[79-80]。在大多數(shù)情況下,田間抗性菌株的適合度沒有明顯變化,在藥劑選擇壓力下,抗性病菌群體在田間能夠快速發(fā)展。例如,宋晰等和鄭媛萍等測定發(fā)現(xiàn),福建、上海、江蘇、山東、遼寧等省份的部分地區(qū)的田間病菌群體中,抗二甲酰亞胺類殺菌劑的灰葡萄孢處于優(yōu)勢群體,占79%～90%,表明抗性菌株在田間有很高的適合度[119-120]。

在過去20年中,研究多種絲狀真菌對二甲酰亞胺類殺菌劑抗性機制發(fā)現(xiàn),該類藥劑能夠?qū)е抡婢母邼B透甘油(highosmolarityglycerol,HOG)信號途徑異常激活,進而抑制病菌生長[121]。從田間采集的抗該類藥劑的灰葡萄孢通常由HOG信號途徑上組氨酸激酶Bos1點突變所致,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BOS1上G278D、I365S/N/R、Q369P+N373S、I365S+T581P、G415D和A493T等點突變均可導致灰葡萄孢對二甲酰亞胺類殺菌劑產(chǎn)生抗性[81-82]。除了灰葡萄孢,A.alternata[83-84]、A.arborescens[86]、A.brassicicola[84]、A.longipes[85]、M.fructicola[87]、Sclerotinia homoeocarpa[88]和S.sclerotiorum[89]等對該類藥劑的抗性也由組氨酸激酶上點突變所致。

1.7 多藥抗性

多藥抗性(multidrugresistance,MDR)通常是指ATP結合盒式轉運蛋白(ATP-bindingcassettetransporter,ABC)高水平表達,使得病菌對多種藥劑產(chǎn)生抗性。ABC轉運蛋白是細胞膜上一類ATP驅(qū)動泵,通常由跨膜結構域和胞質(zhì)側ATP結合域組成。參與藥物運輸?shù)腁BC轉運蛋白能利用水解ATP的能量以主動運輸?shù)姆绞綄⒓毎麅?nèi)藥物轉運到細胞外。因此,ABC轉運蛋白高水平表達可將更多的藥劑從病菌的細胞內(nèi)運輸?shù)郊毎?導致病菌對多種藥劑產(chǎn)生抗性。目前,在灰霉萄孢B.cinerea[90-91]、黃色鐮孢F.culmorum[93-94]、禾谷鐮孢F.graminearum[95-96]、小麥發(fā)酵殼針孢Z.tritici[97-99]、稻瘟病菌P.oryzae[100]、實生鏈核盤菌M.fructicola[101]、指狀青霉P.digitatum[102-103]和草坪草幣斑病病原菌Sclerotinia homoeocarpa[104]等多種病原真菌中發(fā)現(xiàn),ABC轉運蛋白基因的過量表達導致病菌對包括DMI在內(nèi)的多種藥劑敏感性下降。在灰葡萄孢中,目前已確定了3種主要的MDR類型,MDR1菌株對咯菌腈、嘧菌環(huán)胺和托萘酯表現(xiàn)出耐藥性;MDR2菌株對環(huán)酰菌胺、放線菌酮、嘧菌環(huán)胺等表現(xiàn)抗性;MDR3菌株對多數(shù)殺菌劑均表現(xiàn)抗性。研究MDR機制發(fā)現(xiàn),MDR1和MDR2分別由ABC轉運蛋白ATRB和MFSM2的過量表達所致[91]。進一步研究發(fā)現(xiàn),MDR1菌株中,調(diào)控ATRB的轉錄因子Mrr1上發(fā)生點突變,導致ATRB過量表達[91];此外,MDR1菌株MRR1的第497位含有一個3bp的缺失,也能導致ATRB的高表達水平[92]。MDR2菌株在MFSM2啟動子中含有1 326bp的插入片段,導致MFSM2的高水平表達。MDR3來自MDR1和MDR2的自然雜交,MDR3菌株包含MDR1和MDR2的變異類型[91]。德國和法國多個葡萄園的灰葡萄孢群體中MDR菌株的頻率超過50%,導致嚴重的抗藥性問題[80]。多藥抗性的灰葡萄孢在我國也很普遍[122]。當前,多藥抗性仍是殺菌劑抗性治理中的一個重要難題。

1.8 表觀遺傳調(diào)控的病菌抗藥性

表觀遺傳學指在基因的DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下,由DNA序列修飾、組蛋白修飾、非編碼RNA、RNA干擾(RNAi)、染色質(zhì)重塑等因素導致靶標基因表達改變,并最終導致了表型變化[123]。

目前,表觀遺傳調(diào)控人類病原真菌抗藥性已經(jīng)受到高度關注。Calo等[124]研究發(fā)現(xiàn),人類病原真菌卷枝毛霉Mucor circinelloides可能通過RNAi介導對抗真菌藥物FK506產(chǎn)生抗性。FK506作用于肽基脯氨酰異構酶FKBP12,形成的FKBP12-FK506復合體抑制菌體內(nèi)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的活性。編碼FKBP12的fkbA基因或鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶2個亞基cnbR或cnaA基因的突變,可以使得病菌對FK506產(chǎn)生抗性。此外,表觀遺傳變化導致RNAi激活,進而沉默fkbA基因,使菌體也對FK506產(chǎn)生抗性。該研究首次揭示了表觀遺傳調(diào)控真菌的抗藥機制。

目前,表觀遺傳調(diào)控植物病原真菌抗藥性的研究還鮮有報道。Liu等近來研究發(fā)現(xiàn),戊唑醇能夠激活赤霉病菌菌體內(nèi)高滲透甘油(HOG)激酶信號途徑,該途徑上被激活的FgHog1激酶進入細胞核,磷酸化轉錄因子FgSR,FgSR能夠結合在FgCYP51基因啟動子區(qū)含有2個CGAA重復序列的順式元件上,且磷酸化的FgSR將染色質(zhì)重塑復合體SWI/SNF招募至藥靶基因FgCYP51的啟動子區(qū),對染色體進行重塑,移除藥靶基因區(qū)的核小體。由于核小體是基因轉錄的障礙,被組蛋白緊密纏繞的DNA是無法與眾多轉錄因子以及活化因子結合的,移除藥靶基因區(qū)的核小體,促進藥靶基因高水平轉錄,使得病菌對戊唑醇等三唑類藥劑產(chǎn)生耐藥性。轉錄因子FgSR突變體對三唑類藥劑的敏感性增加上千倍,表明表觀遺傳因子染色質(zhì)重塑復合體在病菌對藥物敏感性中發(fā)揮重要作用[49]。

2 殺菌劑抗性快速檢測技術

在殺菌劑的抗性檢測中,經(jīng)典的方法是在離體和/或活體上測定真菌對殺菌劑的敏感性,以此判斷病菌是否產(chǎn)生抗藥性。但對于大規(guī)?？顾幮詸z測來說,傳統(tǒng)手段無疑需要大量的時間和精力。隨著分子生物學技術的發(fā)展,在解析殺菌劑的抗性分子機制基礎上,開發(fā)分子檢測技術是大規(guī)模監(jiān)測病菌群體抗藥性的前提。目前,常用殺菌劑快速檢測技術包括:聚合酶鏈式反應(PCR)、PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)、等位基因特異性PCR(allele-specificPCR,AS-PCR)和環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)等(表2)。

表2 幾種常用的抗藥性分子檢測技術Table 2 Molecular technologies used for rapid detection of fungicide resistance

2.1 PCR

如前文所述,病菌對三唑類藥劑產(chǎn)生抗性源于多種病原真菌的CYP51基因啟動子區(qū)出現(xiàn)特定序列的插入片段導致相應基因的高表達。根據(jù)特異的插入片段,可以設計特異的PCR引物,進而快速檢測抗藥菌株。例如,Luo等[44]研究發(fā)現(xiàn),M.fructicolaCYP51啟動子區(qū)存在65 bp的Mona片段,導致病菌對DMI藥劑產(chǎn)生抗藥性;根據(jù)該插入片段設計的一組特異引物INS65-F/INS65-R,能快速地從抗性菌株中擴增出1個376 bp的特異性條帶,但不能從敏感菌株中擴增出該大小的條帶[125-126]。目前,PCR技術已經(jīng)成功用于鑒定抗DMI類藥劑的Penicilliumdigitatum[36,127]、Blumeriellajaapii[41-42]、Z.tritici[46]等病原真菌。

2.2 PCR-RFLP

PCR-RFLP將PCR技術和RFLP分析相結合,可以用于檢測由單點突變導致的抗藥性。通常,先利用PCR擴增待測目的DNA片段,然后通過DNA限制性內(nèi)切酶對擴增產(chǎn)物進行酶切,最后經(jīng)電泳分析目的DNA片段是否被切割分型,進而判斷待測樣品是否含有抗藥性基因型。例如,Li等[128]根據(jù)Ⅰ型肌球蛋白基因myosin-5上A135T、S217L和E420K點突變,設計了Fgmyo5-135F/R、Fgmyo5-217F/R和Fgmyo5-420F/R引物,利用這些引物分別擴增myosin-5基因841 bp(含A135T突變)、802 bp(含S217L突變)和1 649 bp(含E420K突變)的基因片段,而后用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、TasⅠ和DraⅠ對PCR產(chǎn)物進行酶切,含有A135T、S217L和E420K突變的PCR產(chǎn)物經(jīng)過酶切后,可以分別產(chǎn)生256 bp和585 bp 2個片段,61、287 bp和54 bp 3個片段以及932 bp和717 bp 2個片段,而不含基因點突變的PCR產(chǎn)物酶切后只能分別產(chǎn)生841 bp 1個片段,515 bp和287 bp 2個片段和1 649 bp 1個片段;對酶切產(chǎn)物電泳圖譜分析,進而對A135T、S217L和E420K突變的抗藥株進行鑒定。采用PCR-RFLP方法還檢測到了抗氰烯菌酯的F.graminearum菌株中的3種常見突變(A135T、S217L、E420K),準確率高達95.12%。目前,應用PCR-RFLP技術已經(jīng)成功檢測抗苯并咪唑類殺菌劑的B.cinerea[129]、Cladobotryumdendroides[130]、Monilinialaxa[17]、Colletotrichumgloeosporioides[131]等抗性菌株,抗QoI的B.graminisf.sp.hordei[132]、B.graminisf.sp.tritici[57]、P.fusca[133]、P.viticola[135]和R.collo-cygni[134]等,抗嘧菌酯的Alternariaalternata、A.tenuissima和A.arborescens[56]和P.viticola的雙炔酰菌胺抗性菌株[136-137]。

2.3 等位基因特異性PCR

等位基因特異性PCR也是一種簡單快速的檢測基因點突變的方法。該方法在設計引物時要求一條引物與目的片段完全匹配,另一條引物的3′端堿基與模板上突變的堿基匹配,在合適的PCR反應條件下,只有完全匹配的引物才能擴增出PCR產(chǎn)物。例如,羅梅等[138]和Fan等[139]以M.fructicola為對象,基于已知的多菌靈抗性機理,即靶標β微管蛋白基因TUB2的點突變E198A和H6Y,建立了等位基因特異性PCR檢測技術,快速靈敏地檢測M.fructicola對多菌靈的抗性,該技術有望在實踐中推廣使用。在殺菌劑抗藥性檢測方面,等位基因特異性PCR已經(jīng)應用于鑒定抗苯并咪唑類藥劑的Monilinalaxa[17]、M.fructicola[1]、Alternariaalternata、A.tenuissima、A.arborescens[140]、B.graminisf.sp.tritici[141],抗嘧菌酯的Didymellabryoniae[142],抗QoI和SDHI的B.cinerea[71]以及抗DMI的U.necator[33]等抗性菌株。

將等位基因特異性PCR和熒光定量 PCR相結合的等位基因特異性熒光定量 PCR可以更有效地對殺菌劑抗性菌株進行定量檢測。目前,該技術已經(jīng)應用于多種病原真菌的抗藥性檢測,包括Alternariaspp.[56]、B.cinerea[143-144]、F.graminearum[146]和M.fructicola[139]等。此外,利用等位基因特異性熒光定量 PCR還可以快速地鑒定田間病原菌抗性群體的發(fā)生發(fā)展情況[1]。

2.4 LAMP

LAMP是一種速度快、靈敏度高和特異性強的核酸恒溫擴增技術。LAMP僅需1種具鏈置換活性的DNA聚合酶(如Bst、Gsp等)及針對靶基因6～8個區(qū)域設計的4～6條引物,在60～66℃的恒定溫度下,幾十分鐘就可以實現(xiàn)對靶基因進行大于109倍的擴增[154-155]。近年來,LAMP技術開始應用于殺菌劑抗藥性的檢測中。例如,Li等[147]利用LAMP技術建立了快速檢測因cytb基因發(fā)生G143A突變導致的C.cassiicola對QoI產(chǎn)生抗性的菌株。此外,Duan等應用LAMP技術成功檢測F.graminearum[10]、F.asiaticum[11]、S.sclerotiorum[148-149]和B.cinerea[151]的苯并咪唑類抗性突變類型,包括β-tubulin基因的F167Y、F200Y、E198A、E198K和E198V突變等。Hu等[150]利用LAMP方法檢測抗QoI的灰葡萄孢B.cinerea;Fan等[152]利用該技術檢測灰葡萄孢B.cinereaSDHB亞基第272位組氨酸突變?yōu)榫彼岬目剐跃辍?/p>

此外,LAMP方法還可用于檢測非藥物靶點突變介導的病菌抗藥性。例如,針對由CYP51啟動子區(qū)片段插入導致的DMI抗性,Fraaije[47]成功研發(fā)了快速檢測Zymoseptoriatritici中 由CYP51啟動子區(qū)片段插入所致的DMI抗性的LAMP方法。Chen等[153]建立了檢測M.fructicola中MfCYP51基因啟動子區(qū)65 bp插入片段的方法。

3 對策與展望

殺菌劑長期使用后,植物病原菌對藥劑進化出了多種自我防御的抗性機制,這些機制可能單獨或者協(xié)同發(fā)揮作用,使得藥劑防效下降或失去抑菌效果。深入揭示植物病原菌對殺菌劑的抗性機制,可為科學用藥以及新藥劑研發(fā)提供重要理論支撐。目前,植物病原真菌對殺菌劑的抗性多數(shù)是藥物靶基因位點突變所致,其次是藥靶基因和ABC轉運蛋白基因的高表達。此外,病菌仍存在著其他潛在的抗藥機制,例如,病原菌對藥劑的代謝分解作用增強。除了上述比較經(jīng)典的抗藥性機制之外,我們還需要關注在藥劑選擇壓力下,病菌對藥劑產(chǎn)生短期的、不穩(wěn)定遺傳的敏感性下降問題,病菌對藥劑的適應性使得在短期內(nèi)再次用藥時防治效果不佳。目前少數(shù)幾個研究案例表明,該現(xiàn)象可能與表觀遺傳變化相關,但具體機制有待于研究。

關于殺菌劑抗性治理,Brent等及Corkley等總結了一套抗性治理的基本策略[156-157],即:1)交替使用或混用不同作用機制的藥劑,2)限制每個生長季節(jié)的用藥次數(shù);3)盡可能在病害發(fā)生早期用藥;4)開發(fā)具有新作用機制的高活性殺菌劑;5)加強病害綜合防控,減輕病害壓力。

除了上述經(jīng)典的抗性治理策略之外,表觀遺傳調(diào)控和RNA干擾(RNAi)等技術有望在殺菌劑抗性治理中發(fā)揮重要作用。表觀遺傳修飾在調(diào)控病菌生長、致病、抗逆等方面發(fā)揮極其重要的作用,因此,針對病菌的表觀遺傳修飾,有望開發(fā)新型殺菌劑。目前,正在開發(fā)幾種表觀遺傳類藥物,如DNA甲基化抑制藥物、組蛋白乙酰轉移酶抑制劑、組蛋白脫乙酰酶抑制劑、蛋白質(zhì)甲基轉移酶抑制劑和組蛋白甲基化抑制劑等,在臨床上已經(jīng)有效用于治療真菌引起的人類疾病[158]。RNAi是另一種潛在的控制植物病害的新技術。RNAi可以通過將dsRNA分子輸送到目標生物體的細胞中來抑制靶標基因表達,與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)化學品相比,其可能更具針對性、更精準地控制病害。在過去的10年中,已經(jīng)開發(fā)了幾種dsRNA遞送系統(tǒng),包括葉面噴霧、灌溉和樹干注射,并且在特定環(huán)境下獲得良好的防治效果。目前,盡管RNAi在大田環(huán)境下對病害的防治效果尚不夠理想,但隨著RNAi遞送技術的不斷完善,對殺菌劑具有高抗性風險的病害,例如灰霉病、白粉病和霜霉病,RNAi具有巨大的應用潛力[159]。