稻瘟病抗性分子機制及抗病育種策略研究進展

王如意, 劉 杰, 馮 琴, 張熠玚, 肖 寧, 吳 俊,鄭文靜, 李愛宏, 寧約瑟*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，北京 100193；2. 全國農(nóng)業(yè)技術推廣服務中心，北京 100125；3. 江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所，揚州 225009；4. 湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，長沙 410128；5. 遼寧省水稻研究所，沈陽 110101)

1 近10年稻瘟病病害發(fā)生危害情況的統(tǒng)計

稻瘟病是由Pyriculariaoryzae侵染引起的對水稻安全生產(chǎn)影響最嚴重的世界性稻作病害,已經(jīng)在超過85個國家發(fā)生。全世界每年因稻瘟病造成的損失足以養(yǎng)活6 000萬人口[1]。由于其在生產(chǎn)上的嚴重危害性和在科學研究上的重要性,2010年稻瘟病被Science雜志列為食品安全“最嚴重的生物威脅”之一[2]。2012年稻瘟病菌被國際分子植物病理學界列為“十大植物病原真菌之首”[3]。

稻瘟病在我國不同水稻種植區(qū)及水稻不同生育期的不同組織部位均有發(fā)生(圖1),嚴重影響了水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。據(jù)全國農(nóng)業(yè)技術推廣服務中心數(shù)據(jù)顯示,2012年-2021年我國稻瘟病年均發(fā)生面積381.5萬hm2次(圖2a),年均實際損失36.8萬t(圖2b),其中2014、2015年連續(xù)兩年發(fā)生面積超過500萬hm2次,造成年實際稻谷損失超過50萬t(圖2)。

圖1 稻瘟病發(fā)病情況Fig.1 Incidence of rice blast

圖2 2012年-2021年我國稻瘟病發(fā)生面積(a)及引起的實際損失(b)Fig.2 The occurrence area (a) of rice blast and caused actual losses (b) in China from 2012 to 2021

我國稻作區(qū)自然生態(tài)環(huán)境、水稻種植類型與栽培制度復雜多樣,稻瘟病的發(fā)生具有明顯的區(qū)域性差異。例如,隨著優(yōu)質(zhì)食味粳稻的推廣,江蘇省稻瘟病發(fā)生風險也逐步加大,2014年稻瘟病在江蘇省偏重發(fā)生,發(fā)生面積達到100萬hm2,占水稻播種面積的43%,嚴重影響了水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)[4]。華南雙季稻稻作區(qū)以秈稻為主,該區(qū)稻瘟菌病原小種分化復雜,稻瘟病發(fā)生具有點多面廣、地域間發(fā)生分布不平衡等特點。據(jù)全國農(nóng)業(yè)技術推廣服務中心統(tǒng)計,2015年-2021年,廣東省稻瘟病年發(fā)生面積約26.7萬hm2,平均年損失稻谷約為2.5萬t。

多年來,“預防為主,綜合防治”的植物保護工作方針為我國病蟲害的防控指明了方向,為糧食安全生產(chǎn)提供了重要保障[5]。在稻瘟病防治措施中,培育和推廣稻瘟病抗性品種被認為是防控稻瘟病最為經(jīng)濟、有效和環(huán)保的策略[6]。因此,在國家和有關省農(nóng)作物新品種審定中,稻瘟病抗性一直被作為水稻新品種審定的重要指標,實行抗性不達標一票否決制度[7]。為控制稻瘟病的發(fā)生,廣東省大力推廣以廣譜抗稻瘟病材料‘BL122’ (含稻瘟病抗病基因Pi1和Pi2)為父本的‘粵恢9802’等高抗稻瘟病雜交稻新品種。2013年-2021年,‘粵恢9802’在廣東稻瘟病發(fā)病區(qū)累計推廣33萬hm2。東北早熟單季稻稻作區(qū)是我國粳稻的主產(chǎn)區(qū)之一,2018年以來,黑龍江省每年對當?shù)刂髟云贩N進行接種測定,水稻品種整體抗病性有較大提升。全球氣候變化以及種植制度的變革加劇了稻瘟菌種群的變化,稻瘟病防控形勢依然嚴峻。2020年和2023年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部先后兩次將稻瘟病列入一類農(nóng)作物病蟲害名錄。因此,一方面確定水稻品種抗瘟性及發(fā)病風險,結(jié)合田間生產(chǎn)實際,優(yōu)先種植在當?shù)匕l(fā)病風險低的水稻品種,降低稻瘟病大面積暴發(fā)風險。另一方面,加強對稻瘟病常發(fā)區(qū)主栽品種的調(diào)整,避免單一抗病品種大面積種植,避免因抗病品種的垂直抗性喪失而造成巨大損失。為了應對稻瘟菌種群變化對水稻生產(chǎn)帶來的危害,系統(tǒng)深入地研究稻瘟菌與水稻的相互作用,揭示水稻的抗病分子機制,改良水稻品種的稻瘟病抗性,加強對稻瘟病的綜合防控,對確保我國糧食安全具有舉足輕重的作用。

2 水稻稻瘟病抗病機制研究進展

2.1 稻瘟病抗病基因匯總

截至目前,已經(jīng)有30多個稻瘟病抗病基因(resistance genes,R)被相繼鑒定和克隆。其中,大多數(shù)稻瘟病抗病基因,如Pi-ta、Pi2、Pi9、Piz-t、Pizh、Pi5、Pi50、Pik、Pi1、Pikm、Pi54(Pikh)、Pikp、Pid3、Pi25、Pid4、Pid3-A4、Pi36、Pi37、Pi56(t)、Pi63、Pia、Pib、Pi-CO39、Pish、Pi35、Pit、Pb1、Pi64和Pigm等編碼核苷酸結(jié)合和富亮氨酸重復結(jié)構(gòu)域受體(nucleotide-binding and leucine-rich repeat receptor,NLR)蛋白[8]。還有一些非NLR類抗病基因編碼蛋白激酶,如Pid2、Pi68(t)和Pi65分別編碼含有B-lectin 結(jié)構(gòu)域的類受體激酶、含有Malectin結(jié)構(gòu)域的類受體激酶和含有多個LRR (leucine-rich repeat)結(jié)構(gòu)域的類受體類激酶[9-11]。此外,Ptr編碼一個包含4個Armadillo重復的蛋白[12]?？共』虻蔫b定和克隆為抗病材料的創(chuàng)制和利用奠定了基礎。

2.2 稻瘟菌AVR蛋白與水稻NLR蛋白的識別

水稻R基因和稻瘟菌無毒基因(avirulence genes,AVR)的識別遵循“基因?qū)颉奔僬f。水稻抗稻瘟病R基因與稻瘟菌中AVR基因相對應,目前已報道的AVR/R基因?qū)χ饕?Avr-Pita/Pi-ta、Avr-Pik/Pik、AvrPiz-t/Piz-t、Avr-Pia/Pia、Avr1-CO39/Pi-CO39、AvrPi54/Pi54、AvrPi9/Pi9[8]、AvrPib/Pib[13]和Avr-Pii/Pii[14]。研究發(fā)現(xiàn),水稻R蛋白Pi-ta 的 LRR 結(jié)構(gòu)域能夠直接和稻瘟菌的 AVR蛋白 Avr-Pita 相互作用,誘導植物的局部細胞死亡,阻止稻瘟菌進一步擴散[15], 這是水稻和稻瘟菌互作系統(tǒng)中首次證明R蛋白和相應的AVR蛋白直接相互作用。隨后發(fā)現(xiàn)AVR蛋白AvrPi54與R蛋白Pi54能夠在水稻原生質(zhì)膜上直接互作激發(fā)特異性抗病反應[16]。近來研究表明,植物中NLR蛋白也以成對的形式發(fā)揮作用,稱為 Senser NLR和Helper NLR。Senser NLR整合了特殊的結(jié)構(gòu)域來識別病原菌AVR蛋白,而Helper NLR負責起始下游免疫信號。如Pikp由Senser NLR 蛋白Pikp-1和 Helper NLR蛋白Pikp-2組成,Pikp-1含有 HMA 結(jié)構(gòu)域 (heavy-metal-associated domain),能夠與Avr-PikD直接相互作用;Pikp-1和Pikp-2 協(xié)同行使功能對含有Avr-PikD的稻瘟菌小種產(chǎn)生免疫反應[17]。HMA 結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的差異決定了水稻對AVR蛋白的特異性抗性。因此,水稻R基因Pik的多個等位基因(Pikm、Piks、Pikp和Pikh)分別對含有相應Avr-Pik的稻瘟菌小種表現(xiàn)特異抗性[18]。類似地,水稻抗病蛋白Pia由Senser NLR 蛋白RGA5和Helper NLR蛋白 RGA4組成,對攜帶Avr-Pia或Avr1-CO39的稻瘟菌表現(xiàn)特異的抗性[19]。RGA5能夠抑制RGA4的激活,Avr-Pia和 Avr1-CO39與RGA5的HMA結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合,解除 RGA5對RGA4 的抑制作用從而激發(fā)免疫反應[20]。

大多數(shù)水稻R蛋白與對應的稻瘟菌AVR蛋白不直接相互作用,這些R蛋白在水稻中的關鍵互作因子介導了R蛋白對AVR蛋白的識別。如NLR蛋白Pii和相對應的Avr-Pii均與水稻胞吐作用相關蛋白OsExo70-F2和OsExo70-F3 相互作用,而OsExo70-F2和OsExo70-F3是R基因Pii介導抗性的必需因子[21]。近來發(fā)現(xiàn)NLR蛋白Pib和相應的AvrPib與水稻SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)SH3P2相互作用,在正常情況下SH3P2抑制Pib的激活,稻瘟菌侵染時AvrPib與SH3P2互作抑制SH3P2-Pib復合物的形成從而激活Pib[22]。此外,研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子WRKY45和RAI1分別特異地與NLR蛋白Pb1或PID3相互作用,是NLR蛋白抗病途徑中的必需因子[23-24]。稻瘟菌AVR基因與水稻R基因的互作機制研究為拓展R基因的抗譜提供了關鍵理論基礎。

2.3 廣譜NLR抗病蛋白信號通路

水稻NLR蛋白Piz-t、Pi9和Pigm等對多個稻瘟菌小種具有抗性,表現(xiàn)出廣譜抗性特征,受到廣泛關注和深入研究。Piz-t特異性識別稻瘟菌AvrPiz-t蛋白并通過多種信號通路激發(fā)水稻的免疫反應。AvrPiz-t能夠抑制水稻bZIP 類型轉(zhuǎn)錄因子APIP5轉(zhuǎn)錄活性和蛋白積累,促進效應蛋白激發(fā)的細胞壞死,而Piz-t通過靶向APIP5,阻止APIP5介導的細胞壞死[25]。AvrPiz-t可以抑制E3泛素連接酶APIP10的體外泛素化活性抑制水稻的基礎防衛(wèi)反應,APIP10與維管植物單鋅指轉(zhuǎn)錄因子OsVOZ1與OsVOZ2相互作用促進其通過26S蛋白酶體途徑降解,抑制OsVOZ1/OsVOZ2 的表達會削弱Piz-t蛋白積累和對非親和小種的抗病性[26],說明APIP10通過OsVOZ1/OsVOZ2調(diào)控Piz-t介導的免疫反應。此外,抗病蛋白Piz-t促進水稻胰蛋白酶抑制劑APIP4蛋白積累,增強其活性從而增強免疫[27],因此OsVOZ1/OsVOZ2作用于R蛋白Piz-t上游,正調(diào)控Piz-t蛋白積累,激活的Piz-t進一步通過其下游蛋白APIP5和APIP4調(diào)控稻瘟病抗性。R蛋白Pi9能夠特異性識別稻瘟菌AvrPi9蛋白,近來發(fā)現(xiàn)AvrPi9與含有類泛素結(jié)構(gòu)域的蛋白ANIP1互作并維持其穩(wěn)定性,而ANIP1促進稻瘟菌抗性正調(diào)控因子OsWRKY62的降解,減弱寄主免疫反應。雖然Pi9也能夠穩(wěn)定ANIP1,但AvrPi9可以促進ANIP1和Pi9的解離從而激活Pi9[28]。目前R基因Pigm相應的稻瘟菌無毒基因還沒有報道,研究發(fā)現(xiàn)PigmR能夠促進具有RRM結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子PIBP1在細胞核中積累,PIBP1與細胞壁相關激酶基因OsWAK14和苯丙氨酶基因OsPAL1的啟動子直接結(jié)合并促進它們的表達,增強水稻對稻瘟病的抗性[29]。此外,PigmR能夠穩(wěn)定去泛素化酶PICI1,PICI1使甲硫氨酸合成酶OsMETS1去泛素化并維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,促進乙烯的生物合成從而激活免疫[30]。因此,廣譜NLR抗病蛋白一方面通過APIP5、OsVOZ1/OsVOZ2、OsWRKY62和PIBP1等轉(zhuǎn)錄因子促進下游抗病相關基因的表達;另一方面,泛素化/去泛素化修飾酶APIP10、ANIP1和PICI1參與了抗病信號的調(diào)控。下游抗病信號通過代謝防御途徑的關鍵酶,比如PAL參與的苯丙氨酸代謝和OsMETS1參與的乙烯代謝途徑參與了廣譜NLR抗病基因介導的抗病信號通路。

3 水稻感病基因/負調(diào)控因子研究進展

感病基因(susceptibility gene,S)是指植物中有利于病原菌侵染的基因,是病原菌成功侵染寄主必需的關鍵因子[8]。在稻瘟病抗病性研究過程中,發(fā)現(xiàn)一些感病基因/抗病負調(diào)控因子的功能缺失突變表現(xiàn)廣譜抗病性(圖3)。雖然這些S基因編碼的蛋白沒有保守性,但是一些感病基因介導的信號轉(zhuǎn)導存在類似性。比如,Bsr-d1 編碼 C2H2類轉(zhuǎn)錄因子,Bsr-d1蛋白促進下游過氧化物酶基因的轉(zhuǎn)錄導致活性氧(reactive oxygen species,ROS)的消除,使水稻感病。而bsr-d1 突變體導致活性氧增加,表現(xiàn)出對稻瘟病廣譜抗病性[31](圖3)。ROD1基因編碼包含C2結(jié)構(gòu)域的鈣感應蛋白,能促進CatB介導的過氧化氫酶活性,抑制活性氧的積累導致感病。而ROD1缺失突變體表現(xiàn)出對稻瘟病的廣譜抗性[32](圖3)。說明Bsr-d1和ROD1都通過調(diào)控ROS的產(chǎn)生介導抗病性。Bsr-k1編碼TPR(tetratricopeptide repeats)類型蛋白,能夠與苯丙氨酸代謝限速酶基因OsPAL(OsPAL1～OsPAL7)的mRNA結(jié)合促進其降解,導致木質(zhì)素合成減少進而削弱免疫反應。而Bsr-k1功能喪失突變體中木質(zhì)素合成增多,賦予水稻對稻瘟病菌的廣譜抗性[33](圖3)。RLK類型激酶(receptor-like kinases)BDR1能夠磷酸化MPK3,抑制稻瘟菌誘導的茉莉酸(jasmonic acid,JA)信號和萜類生物合成基因TPS3和TPS29的表達,負調(diào)控稻瘟抗性。BDR1功能缺失突變體抑制JA信號和萜類代謝物途徑,增強稻瘟病抗性[34](圖3)。表明Bsr-k1和BDR1都通過參與抗病代謝物合成介導抗病性。近來發(fā)現(xiàn)稻瘟菌侵染水稻時,水稻磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸被招募到侵染菌絲周圍促進其侵染。水稻感病基因RBL1編碼胞嘧啶二脂酰甘油合成酶(CDP-DAG合成酶),參與磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸的生物合成。rbl1突變體中細胞膜磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸含量顯著減少,抑制了稻瘟菌的侵染[35](圖3)。感病基因的鑒定及其信號轉(zhuǎn)導的解析為水稻抗病育種提供了新的切入點。

4 其他抗病相關基因

4.1 其他稻瘟病正調(diào)控因子

除了稻瘟病抗病基因和感病基因,研究發(fā)現(xiàn)一些參與水稻生長發(fā)育調(diào)控的調(diào)控因子兼具廣譜抗病性。IPA1是調(diào)控水稻理想株型的關鍵基因,近來發(fā)現(xiàn)稻瘟菌能夠誘導IPA1磷酸化,促進IPA1與抗病正調(diào)控因子WRKY45 啟動子的結(jié)合,促進其表達,增強水稻對稻瘟菌的廣譜抗病性[36]。水稻捕光復合體亞基LHCB5的高表達促進LHCB5的磷酸化水平,磷酸化的LHCB5增加了葉綠體中ROS的累積和對稻瘟病菌多個小種的廣譜抗性[37]。水稻中蛋白酶體成熟因子UMP1編碼基因的一個天然等位基因UMP1R2115,增加了蛋白酶體的豐度和活性,促進過氧化物酶和過氧化氫酶的降解,導致ROS積累,賦予水稻對稻瘟病菌等的廣譜抗性[38]。與抗病基因相比,盡管這些基因表現(xiàn)出不完全抗性,但這些基因介導的抗病性不依賴稻瘟菌AVR基因的限制具有重要的潛在應用價值。

4.2 microRNA介導的稻瘟病抗性

microRNAs (miRNAs) 是一類調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達水平的非編碼RNA[39]。miRNAs與AGROUNATE (AGO)蛋白結(jié)合形成RNA誘導沉默復合體,該復合體的miRNA與靶基因序列堿基互補配對,通過切割mRNA、促進DNA甲基化或阻遏翻譯等方式來抑制下游基因表達[39-42],研究表明多個“miRNA-靶基因”參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和抗逆等生物學過程[43]。其中miR398b 靶向4個超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)基因OsCSD1、OsCSD2、OsCCSD和OsSODX。在水稻中過表達miR398b或敲除靶基因OsCSD1、OsCSD2和OsSODX能夠增強SOD活性,增加 H2O2的累積,提高水稻對稻瘟病的抗性[44]。miR160a靶向5個生長素響應因子(auxin response factor, ARF)編碼基因OsARF8、OsARF10、OsARF13、OsARF18和OsARF22。在水稻中超表達miR160a或敲除OsARF8、OsARF18或OsARF22增強對稻瘟病的抗性[45]。此外,研究發(fā)現(xiàn)miRNA及其靶基因也能夠負調(diào)節(jié)稻瘟病抗性。miR319b靶向JA信號通路關鍵基因OsTCP21。過表達miR319b抑制JA合成通路多個基因表達,促進稻瘟菌的侵染;而過表達OsTCP21增強了JA合成通路中這些基因的表達,抑制了稻瘟菌的侵染[46]。miR1871靶向一個定位于細胞壁的基因OsMFAP1。過表達miR1871或敲除OsMFAP1削弱水稻的基礎免疫反應,而抑制miR1871的功能或過表達OsMFAP1不僅提高了水稻對稻瘟菌的抗性,還顯著提高了水稻的產(chǎn)量,暗示miR1871可能是一個具有抗病育種應用價值的潛在感病基因[47]。此外,miR168能夠靶向并抑制OsAGO1的表達,負調(diào)控多個miRNAs的積累。通過負調(diào)控miR1320的表達能增強稻瘟病抗性,通過負調(diào)控miR535和miR164的表達能增加水稻穗數(shù)并延長抽穗時間,最終提高產(chǎn)量。抑制miR168的表達能同時提高稻瘟抗性和水稻產(chǎn)量[48]。這些研究表明,microRNA作為一種非蛋白的抗病相關基因廣泛參與水稻對稻瘟病抗性的調(diào)控,在水稻抗病育種中具有應用潛力。

5 水稻稻瘟病抗病育種策略

稻瘟病抗病基因、感病基因以及其他抗病相關基因的挖掘、克隆與應用,大幅提升了生產(chǎn)上水稻主推品種的稻瘟病抗性。然而,隨著全球氣候變化和水稻種植制度的變革,新品種需要進一步拓展抗病譜和廣泛適應性,以應對變化的新環(huán)境。

5.1 抗病基因的聚合

雖然抗病基因具有垂直抗性,但是抗病蛋白僅能識別包含有相應無毒效應因子的病原小種,限制了單個抗病基因抗病品種的大面積推廣。采用多個抗病基因的聚合有助于培育廣譜稻瘟病抗性品種。例如:以‘07GY31’水稻材料為基礎,將抗病基因Pi9和Piz-t分別與抗病基因Pi54進行聚合,創(chuàng)制了葉瘟和穗瘟抗性均顯著提高的新材料[49];類似地,以‘YD6號’水稻材料為基礎,將Piz不同等位基因(Pigm、Pi40、Pi9、Pi2和Piz)和Pi1、Pi33以及Pi54分別進行聚合,發(fā)現(xiàn)Pigm/Pi1、Pigm/Pi54和Pigm/Pi33組合表現(xiàn)廣譜抗性,且對其他農(nóng)藝性狀沒有明顯影響[50]。另外,Pita和Pi3/Pi5/Pii聚合,以及Pita和Pia聚合也能產(chǎn)生較強的穗瘟抗性[51]。然而,雖然聚合Pib、Pi25和Pi54 能夠顯著提高稻瘟病抗性,但同時嚴重影響產(chǎn)量[52]。因此,抗病基因聚合的應用價值還需評價其綜合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)。通過選用優(yōu)良骨干親本作為共同遺傳背景,構(gòu)建不同單基因的精確滲入系,在此基礎上再進行聚合,是解決這一技術瓶頸的有效手段。

5.2 分子設計育種

隨著水稻全基因組測序的完成,功能基因組學以及生物信息學的發(fā)展,分子設計育種成為引領水稻遺傳改良的關鍵技術。該技術在明確全基因組序列的基礎上,優(yōu)化選擇最佳親本基因組組合,通過雜交和分子標記選擇等技術,聚合大量優(yōu)異基因,從而培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗和廣泛適用性的優(yōu)良新品種。分子設計育種能夠?qū)崿F(xiàn)從經(jīng)驗育種到定向高效的精確育種轉(zhuǎn)變,大幅提高育種效率。Wei等根據(jù)報道的225個水稻QTL基因信息,結(jié)合等位變異的序列信息,將關鍵功能變異位點對應到水稻基因組位置上,獲得包含348個變異位點和562個等位基因的圖譜,通過收集來自26個國家的404份種質(zhì)材料,獲得了覆蓋大部分等位基因(95.5%)的水稻材料[53],為水稻遺傳改良提供了豐富的供體資源。研究者從404份材料中發(fā)現(xiàn)7份材料中包含抗病基因Pi9,而Pi9位點的單堿基等位基因?qū)е聫姷牡疚敛】剐?因此,含有這些等位基因的材料可作為育種應用的重要供體[53]。另一方面,高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗病多性狀聚合是分子設計育種亟待解決的關鍵科學問題。通過對江蘇、浙江、山東等地大面積推廣應用的200余份粳稻品種進行重測序和全基因組分析,及關鍵性狀基因定位,發(fā)現(xiàn)控制千粒重和每穗粒數(shù)等關鍵性狀基因的強化選擇是促進該區(qū)域粳稻品種產(chǎn)量提高的重要遺傳基礎。與此同時,發(fā)現(xiàn)選育的高產(chǎn)水稻品種稻米的直鏈淀粉含量呈現(xiàn)顯著下降,稻瘟病抗性水平表現(xiàn)降低的趨勢,表明稻米品質(zhì)和抗稻瘟病性狀存在顯著的負相關。通過全基因組連鎖圖譜的構(gòu)建,發(fā)現(xiàn)6號染色體Piz基因座感病等位基因連鎖是制約品種產(chǎn)量品質(zhì)抗病平衡的關鍵因素。以此為基礎,利用基因組設計育種策略,通過選擇核心親本和打破關鍵基因累贅連鎖,利用抗病基因Piz-t和Pigm分別創(chuàng)制了高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗病新品系‘XY99’和‘JXY1’[54]。

5.3 感病基因編輯

水稻抗病基因賦予其對病原生理小種的垂直抗性,被育種家優(yōu)先應用于水稻品種改良,但抗病基因的小種特異性使得其抗病譜較窄,限制了抗病品種的大面積推廣。感病基因是寄主植物中協(xié)助病原菌成功侵染的關鍵因子,隨著對稻瘟菌致病性的認知和基因編輯技術的發(fā)展,通過對感病基因的編輯可以阻止病原菌在寄主體內(nèi)完成侵染循環(huán),成為提高水稻抗病性的一種新策略。研究表明在‘日本晴’中敲除感病基因Pi21或Bsr-d1增強了水稻對稻瘟病的抗性,敲除感病基因Xa5增強了水稻對白葉枯病的抗性,同時敲除Pi21、Bsr-d1和Xa5 3個感病基因顯著提高了水稻對稻瘟病和白葉枯病的廣譜抗性,且敲除材料的株高和千粒重等農(nóng)藝性狀無明顯變化[55]。在雜交水稻骨干不育系‘隆科638S’中同時敲除感病基因Bsr-d1、Pi21和OsERF922顯著增強了對稻瘟病的抗性[56]。以上研究為稻瘟病育種提供了新的種質(zhì)資源。因此,通過CRISPR-Cas9技術編輯水稻感病基因有望創(chuàng)制廣譜抗病新材料,對水稻抗病分子育種和其他作物抗病性改良具有重要指導意義。

5.4 抗病基因的病原誘導表達

病原菌侵染激活植株抗病基因及信號通路賦予植株抗病性,而抗病基因的組成型激活往往導致自我免疫,影響植物的生長發(fā)育。例如,擬南芥的抗病關鍵調(diào)控因子NPR1通過調(diào)控水楊酸信號增強抗病性。在小麥和水稻中異源表達NPR1分別顯著提高對小麥紋枯病、水稻白葉枯病和稻瘟病的抗性。但NPR1的組成型激活影響農(nóng)作物的產(chǎn)量等性狀,限制了其在生產(chǎn)上的應用。在水稻中,利用TBF1基因上游開放閱讀框(uORF)在翻譯水平上精準調(diào)控NPR1的表達,使得在沒有病原菌侵染時,NPR1蛋白處于低表達水平;而當有病原菌侵染時,NPR1蛋白快速高表達,阻止病原菌的侵染。uORFTBF1-NPR1水稻材料對稻瘟病、白葉枯病和細菌性條斑病均有較好的抗性,并且不影響其他主要農(nóng)藝性狀[57]。類似地,病原菌誘導的PR1b啟動子以及水稻乙醇脫氫酶5′-UTR的翻譯增強子共同驅(qū)動WRKY45的表達,顯著增強水稻對稻瘟病的抗性[58]。因此,病原誘導以及在翻譯水平精準調(diào)控抗病基因的表達,能夠顯著提高作物對不同類型病原菌的廣譜抗性,同時不影響其他農(nóng)藝性狀。該技術在農(nóng)作物生產(chǎn)上具有潛在重要應用價值。

5.5 基于結(jié)構(gòu)生物學的抗病蛋白改造

NLR抗病蛋白的結(jié)構(gòu)解析使抗病機制研究有了突破性進展,也為抗病蛋白的改造提供了重要參考。水稻中,稻瘟菌Avr1-CO39蛋白能與水稻R蛋白RGA5的HMA結(jié)構(gòu)域直接互作,參照Avr1-CO39與RGA5-HMA互作界面,基于Avr-Pib與Avr1-CO39結(jié)構(gòu)基礎,科研人員對RGA5的HMA結(jié)構(gòu)域進行改造,設計出能識別非對應無毒效應蛋白Avr-Pib的新型抗病蛋白RGA5-HMA2,并證明含有RGA5-HMA2抗病蛋白的水稻對含有Avr-Pib的稻瘟菌具有抗性[59]。類似地,Pikm-1整合了HMA結(jié)構(gòu)域,研究發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域的兩個相鄰的氨基酸的突變拓展了對其他Avr-Pik效應蛋白的識別[60]。近來,研究者利用特異結(jié)合GFP的納米抗體序列替換Pikm-1的HMA結(jié)構(gòu)域獲得Pikm-1α-GFP,當Pikm-1α-GFP和Pikm-2以及GFP共同在煙草中表達時能夠產(chǎn)生類似于Pikm-1,Pikm-2和AvrPiKD共表達產(chǎn)生的過敏反應[61],該技術的進一步優(yōu)化完善有望在水稻中創(chuàng)制廣譜抗病新材料。通過改變抗病蛋白特定結(jié)構(gòu)域或關鍵氨基酸拓展抗病蛋白對效應蛋白的識別,有望有效擴展抗病基因的抗病譜。

6 挑戰(zhàn)和展望

6.1 種質(zhì)資源評價及優(yōu)異等位基因發(fā)掘

從豐富的水稻種質(zhì)資源中挖掘抗稻瘟病基因是創(chuàng)新種質(zhì)的有效途徑?？茖W家從82個國家收集了413份不同水稻種質(zhì),利用全基因組關聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS)鑒定種質(zhì)資源庫中的核心抗稻瘟病基因[62]。用5個稻瘟菌小種對413份水稻種質(zhì)資源進行抗病鑒定,利用GWAS技術鑒定到具有稻瘟病抗性功能的新基因LABR_64[63]。我國科學家開展了代表78萬份水稻種質(zhì)資源95%遺傳多樣性的3 010份亞洲栽培稻基因組研究,建立了核心種質(zhì)的基因型和重要農(nóng)業(yè)性狀表型數(shù)據(jù)庫,為開展水稻全基因組分子設計育種提供基因來源和遺傳信息,為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和多抗水稻新品種奠定基礎[64]。Shang等組裝了具有基因型和表型變異代表性的251份亞洲栽培稻核心種質(zhì)材料的基因組。利用泛基因組圖譜通過整合NLRs注釋信息,構(gòu)建了水稻泛NLRome,確定了泛NLRs家族基因的共線性,為抗病基因功能和進化研究提供了重要基礎[65]。

6.2 利用抗性蛋白互作網(wǎng)絡和信號通路挖掘新基因

水稻蛋白質(zhì)互作組能夠為蛋白網(wǎng)絡和功能研究提供寶貴信息。Wierbowski等將帶條形碼接頭與核酸分子相連接,獲得了覆蓋2 300個基因的水稻ORFeome,構(gòu)建了由289個蛋白質(zhì)之間的322對相互作用組成的高質(zhì)量蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作組圖譜[66]。轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控水稻生長發(fā)育和環(huán)境適應性的關鍵分子,科學家構(gòu)建了包括1 683個水稻轉(zhuǎn)錄因子的文庫,覆蓋水稻轉(zhuǎn)錄因子總量的70%左右[67],為水稻轉(zhuǎn)錄因子互作組的研究奠定了關鍵基礎。水稻基因組包含1 515個E3泛素連接酶基因,近來研究者通過PCR擴增和大規(guī)?；蚝铣色@得了1 499個E3泛素連接酶的全長編碼序列(覆蓋E3泛素連接酶的98.94%),并以此創(chuàng)制了均一化的水稻E3泛素連接酶酵母文庫(UbE3文庫)。利用水稻E3泛素連接酶文庫發(fā)現(xiàn) F-box類型E3泛素連接酶OsFBK16是OsPAL1～OsPAL7的核心E3泛素連接酶[68]。水稻ORFeome文庫、轉(zhuǎn)錄因子文庫和水稻E3泛素連接酶文庫的相繼建立為構(gòu)建水稻蛋白互作組調(diào)控稻瘟病抗性奠定了重要基礎。

遺傳篩選也是闡述抗性基因信號通路的重要方式。例如,水稻U-box類型E3泛素連接酶SPL11負調(diào)控稻瘟病和白葉枯病抗性。通過人工誘變得到了spl11突變體的一系列抑制子,其中抑制子SDS2編碼單子葉植物特異的SD-1類型的受體激酶。有趣的是,SPL11可以促進SDS2的泛素化降解,負調(diào)控水稻免疫,而SDS2能夠磷酸化類受體胞質(zhì)激酶OsRLCK118,進而磷酸化修飾NADPH氧化酶OsRbohB促進ROS產(chǎn)生正調(diào)控水稻先天免疫[69]?？共∠嚓P基因抑制子的遺傳篩選是遺傳水平上解析抗病信號通路的重要途徑,遺傳篩選與蛋白質(zhì)互作鑒定有利于抗病相關蛋白互作網(wǎng)絡的構(gòu)建。

6.3 利用新技術創(chuàng)制抗病材料

以CRISPR-Cas9為主的基因編輯技術為水稻突變體材料的創(chuàng)制和功能研究奠定了重要基礎。2013年該技術首次應用到水稻中,能夠在水稻基因組特定位置使DNA雙鏈斷裂,利用細胞內(nèi)源修復機制產(chǎn)生隨機的數(shù)個堿基插入或刪除,達到基因敲除的目的[70]。單堿基編輯技術的發(fā)展實現(xiàn)了特定堿基的高效精準替換,而引導編輯在不引入雙鏈斷裂和供體DNA模板的前提下實現(xiàn)小片段DNA的精準插入,缺失以及堿基的多種形式突變,提升了基因組編輯的精準性[71]。此外,通過將供體片段進行硫代修飾和磷酸化修飾后,實現(xiàn)了中等片段包括增強子和啟動子的靶向敲入[72]。在此基礎上,通過重復片段介導的同源重組方法實現(xiàn)中等片段的替換和原位蛋白標簽的精準融合[72]。近年來,科學家開發(fā)了能夠?qū)崿F(xiàn)5 kb及以上大片段DNA精準插入的PrimeRoot系統(tǒng),將稻瘟病抗病基因PigmR精準插入到水稻基因組上實現(xiàn)快速抗病育種[73]。這些基因編輯系統(tǒng)的升級改造將為水稻分子抗病育種提供有力的技術支撐。

6.4 葉瘟和穗瘟抗病機制差異

稻瘟病可以在水稻整個生育期以及水稻不同組織發(fā)生,其中葉瘟影響水稻的生長和發(fā)育,穗瘟直接影響水稻灌漿和產(chǎn)量。苗期的葉瘟接菌體系成熟,在溫室易于操作,而穗瘟的抗病分析需要在抽穗期進行,接菌條件和表型調(diào)查易受環(huán)境的影響。因此稻瘟病抗性分析往往從葉瘟研究入手。然而,水稻對葉瘟和穗瘟的抗性往往不完全一致。比如含有廣譜抗稻瘟病基因Pi2、Pi9、Pi40、Piz-t和Piz的近等基因系材料的葉瘟與穗瘟抗性存在顯著差異[74]。在水稻中超量表達14-3-3蛋白編碼基因OsGF14b增強對穗瘟抗性,但對葉瘟更敏感[75]。因此,葉瘟抗性效應好的抗病基因?qū)λ胛量剐孕写M一步分析,葉瘟和穗瘟抗病分子機制的差異還需要進一步研究。

6.5 稻瘟病抗性與水稻生長發(fā)育等的平衡

植物抗病過程激發(fā)了免疫相關的激素信號和代謝防御信號通路,是消耗能量的過程。植物需要權衡抗病與生長過程的能量分配,在病原菌侵染時減緩生長發(fā)育增強抗病性。免疫反應的激活往往影響植物的生長發(fā)育,如何平衡植物抗病性與生長發(fā)育是作物高產(chǎn)抗病育種的重點和難點問題。近來研究表明,作物能夠通過多種形式達到既高產(chǎn)又抗病的目的。比如,1)對生長信號通路抑制的解除。水稻rbl功能缺失突變體具有稻瘟病廣譜抗病性但具有嚴重的類病斑,影響水稻產(chǎn)量。而RBL基因定點缺失12個核苷酸的植株表現(xiàn)抗病性但只在成株期呈現(xiàn)微弱的類病斑表型[35]。2)關鍵防御基因的特異性誘導表達。利用uORF1在翻譯水平上精準調(diào)控NPR1的表達,使得只有在病原菌侵染時,NPR1蛋白才能快速高表達,從而阻止病原菌的侵染,增強水稻的抗病性,但不影響植物生長和產(chǎn)量[57]。類似地,病原誘導表達導致IPA1的磷酸化增強免疫而不影響產(chǎn)量[36]。3)感病基因的敲除。同時敲除Pi21、Bsr-d1和Xa5 3個感病基因顯著提高了水稻對稻瘟病和白葉枯病的廣譜抗性而不影響其他農(nóng)藝性狀。4)優(yōu)化自然變異位點平衡植物的抗性和生長。水稻Bsr-d1和ROD1的優(yōu)異自然變異位點能夠折中并平衡水稻的抗性和生長使得增加抗性不影響產(chǎn)量[31-32]。這些材料的鑒定為實現(xiàn)高產(chǎn)抗病材料的創(chuàng)制提供了很好的范例,有助于水稻抗病性改良,實現(xiàn)高產(chǎn)抗病新材料的創(chuàng)制。