酶菌協(xié)同發(fā)酵改善菜籽餅粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究

鄧生青 郭誠(chéng)諾 韓明霞 王鈺明 趙 峰 解競(jìng)靜 薩仁娜

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

我國(guó)家禽年出欄量居世界第一,長(zhǎng)期以來以玉米-豆粕型飼糧為主,這些原料大量依賴進(jìn)口,使得飼料成本逐年升高[1]。為了緩解養(yǎng)殖業(yè)飼料原料的供需矛盾,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部實(shí)施“豆粕減量替代”行動(dòng),引導(dǎo)養(yǎng)殖企業(yè)以雜粕類原料替代豆粕。因此,利用生物技術(shù)手段提高雜粕類原料的消化利用率,開發(fā)利用不同地區(qū)的原料,緩解進(jìn)口豆粕的壓力,具有重要意義。菜籽餅粕是油菜籽榨油加工后的副產(chǎn)物,在2020—2021年產(chǎn)量約1 000萬t,是產(chǎn)量最高的雜粕類蛋白質(zhì)飼料原料[2],其粗蛋白質(zhì)(CP)含量略低于豆粕,含有豐富的含硫氨基酸,賴氨酸和精氨酸含量略低[3]。由于普通菜籽餅粕含有硫甙(Gls)、芥子堿、植酸、單寧和纖維等抗?fàn)I養(yǎng)因子,適口性差,消化率低于豆粕[4]。研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加10%的菜籽粕顯著降低了肉雞的生長(zhǎng)性能[5]。菜籽餅粕的纖維主要存在于菜籽殼上,是難以被家禽利用的結(jié)構(gòu)性多糖(纖維素、果膠多糖、木質(zhì)素、半纖維素等),彼此間通過氫鍵與木葡聚糖相互連接形成剛性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),并將蛋白質(zhì)等養(yǎng)分纏繞包埋。菜籽餅粕中的大部分纖維不能被畜禽體內(nèi)消化酶降解,也不能被上消化道吸收[6]。Gls是菜籽餅粕毒理作用最大的抗?fàn)I養(yǎng)因子,可引起甲狀腺腫,導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩[7]。

目前通過發(fā)酵技術(shù)可以消除Gls、單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子[8],但對(duì)纖維的降解作用不顯著[9]。Olukomaiya等[10]報(bào)道了發(fā)酵后菜籽粕的中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)等含量出現(xiàn)升高的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn),利用酶解技術(shù)可以降解菜籽餅粕中的纖維并增加產(chǎn)物中小肽含量,但對(duì)Gls幾乎無作用[11-12]。而酶菌協(xié)同發(fā)酵雜粕可將酶解技術(shù)和發(fā)酵技術(shù)有效結(jié)合,從而提高飼料利用率[8,13]。Goodarzi等[14]研究發(fā)現(xiàn),在菜籽餅液態(tài)自發(fā)發(fā)酵過程中加入果膠酶、葡聚糖酶和植酸酶后,可降低結(jié)構(gòu)性多糖和植酸含量,并顯著提高了肉雞生長(zhǎng)性能。不同產(chǎn)地不同加工工藝生產(chǎn)的菜籽餅粕,所含有的養(yǎng)分和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量差異較大[15-16],利用微生物發(fā)酵技術(shù)改善菜籽餅粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值受菜籽餅粕的性質(zhì)、來源、榨油的加工工藝、儲(chǔ)存條件、發(fā)酵菌種的選擇、固體發(fā)酵的條件等因素影響[17-20],如發(fā)酵后菜籽餅粕CP含量升高[18,20]或無變化[10],NDF含量降低[18]或升高[10]。由此可見,菜籽餅粕生產(chǎn)條件、發(fā)酵菌種和工藝不同,對(duì)菜籽餅粕的改善效果差異很大。目前尚缺乏發(fā)酵工藝對(duì)不同來源的菜籽餅粕是否具備普遍適用性的研究。因此,本研究以不同來源的菜籽餅粕為底物,開展酶菌協(xié)同發(fā)酵,分析探討發(fā)酵工藝對(duì)不同來源菜籽餅粕的改善作用,為菜籽餅粕的有效利用提供數(shù)據(jù)與理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

菌種:枯草芽孢桿菌(B.subtilis)購自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,植物乳桿菌(L.plantarum)為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

酶源:纖維素酶,活性20 000 U/g;果膠酶,活性30 000 U/g;α-半乳糖苷酶,活性5 000 U/g。以上酶源均由天津博菲德科技有限公司惠贈(zèng)。

主要原料:工藝優(yōu)化用菜籽餅產(chǎn)自天津;另根據(jù)不同產(chǎn)地從我國(guó)不同區(qū)域采集了8個(gè)菜籽粕和1個(gè)菜籽餅,粉碎過0.42 mm篩備用。

培養(yǎng)基:MRS和LB培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021年12月至2022年5月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。試驗(yàn)共分為2個(gè)部分。試驗(yàn)1:以工藝優(yōu)化用菜籽餅為發(fā)酵底物,以發(fā)酵后菜籽餅的NDF降解率(%)、Gls降解率(%)、酸溶蛋白(TCA-SP)增加率(%)為評(píng)價(jià)指標(biāo),以總變化率(總變化率=0.7×NDF降解率+0.15×Gls降解率+0.15×TCA-SP增加率)為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo),確定酶菌協(xié)同最優(yōu)發(fā)酵工藝,并進(jìn)行發(fā)酵效果的驗(yàn)證。試驗(yàn)2:在最佳酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝下對(duì)菜籽粕1、2、3、4、5、6、7、8及菜籽餅9進(jìn)行酶菌協(xié)同發(fā)酵處理,探討酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝對(duì)不同來源菜籽餅粕的纖維降解效果及養(yǎng)分的改善效果。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種發(fā)酵液制備

將枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌分別在LB和MRS培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)后,挑取單菌落,分別接種于LB、MRS液體培養(yǎng)基中,在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h,按1%的接種量分別接種到含100 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中,培養(yǎng)18 h后備用。

1.3.2 發(fā)酵過程

準(zhǔn)確稱取50.0 g菜籽餅置于500 mL三角瓶中,將菌種發(fā)酵液以枯草芽孢桿菌∶植物乳桿菌=5∶1的接種比例,按照12%的接種量接種至菜籽餅培養(yǎng)基中,加入蒸餾水調(diào)整料水比為1.0∶1.2,攪拌均勻后用無菌透氣過濾封口膜封口,在35 ℃條件下恒溫靜置發(fā)酵96 h。發(fā)酵結(jié)束后于55 ℃低溫烘干,粉碎待測(cè)。

1.4 酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝優(yōu)化

以總變化率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo),以纖維素酶、果膠酶和α-半乳糖苷酶不同添加梯度為試驗(yàn)因素,設(shè)計(jì)L9(34)三因素三水平正交試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

用于測(cè)定纖維含量的樣品粉碎過0.84 mm篩,用于測(cè)定CP和TCA-SP含量的樣品粉碎過0.42 mm篩,用于測(cè)定氨基酸和Gls含量的樣品粉碎過0.25 mm篩。對(duì)工藝優(yōu)化用菜籽餅發(fā)酵前后的pH及CP、TCA-SP、NDF、ADF、Gls和氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定,以及菜籽餅發(fā)酵前后掃描電鏡分析和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分析。對(duì)9個(gè)不同來源菜籽餅粕發(fā)酵前后的pH及CP、TCA-SP、NDF和Gls含量進(jìn)行測(cè)定。

1.5.1 養(yǎng)分測(cè)定

Gls含量采用氯化鈀比色法[21]測(cè)定,DM含量通過105 ℃烘箱干燥4 h測(cè)定,CP含量采用凱氏定氮法測(cè)定,TCA-SP含量參照NY/T 3801—2020[22]測(cè)定,NDF含量參照GB/T 20806—2006[23]采用Van Soest分析法測(cè)定,ADF含量參照NY/T 1459—2007[24]采用Van Soest分析法測(cè)定,氨基酸含量利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.5.2 pH測(cè)定

稱取發(fā)酵前后的樣品5.0 g,加蒸餾水50 mL,攪拌30 min后,用預(yù)先校正過的pH計(jì)測(cè)定其pH。

1.5.3 電鏡掃描分析

取適量樣品粉碎過0.25 mm篩后,置于導(dǎo)電膠固定在掃描電鏡專用樣品臺(tái)上,用磁控濺射鉑金進(jìn)行噴金處理,再將處理好的樣品用掃描電鏡(SU3500,日本)進(jìn)行觀察并拍照留存。

1.5.4 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分析

將樣品碎過0.25 mm,取適量樣品采用變性結(jié)合加熱的方法來提取菜籽餅粕蛋白質(zhì)并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,具體操作參照文獻(xiàn)[25]進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理,采用SAS 9.4軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同來源菜籽餅粕化學(xué)成分

由表2可知,菜籽餅9的CP、NDF和TCA-SP含量分別為41.31%、40.39%和2.61%。菜籽粕1～8的CP、NDF和TCA-SP含量分別在37.07%～44.93%、27.03%～40.22%和2.11%～3.19%;CP的變異系數(shù)為6.17%,NDF和TCA-SP的變異系數(shù)均超過了10%。菜籽餅9的Gls含量為18.81 μmol/g。菜籽粕1～8的Gls含量在18.10～57.64 μmol/g,Gls的變異系數(shù)為38.67%,Gls含量最高的是產(chǎn)地為安徽的菜籽粕6,Gls含量最低的是產(chǎn)地為福建的菜籽粕5。

表2 不同來源菜籽餅粕化學(xué)成分(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.2 酶菌協(xié)同發(fā)酵菜籽餅的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知,從極差結(jié)果來看,果膠酶對(duì)總變化率的影響最大,纖維素酶次之,α-半乳糖苷酶的影響最小,即果膠酶>纖維素酶>α-半乳糖苷酶,最優(yōu)配比組合為纖維素酶∶果膠酶∶α-半乳糖苷酶=3∶3∶3,此時(shí)總變化率為46.44%。

表3 酶菌協(xié)同發(fā)酵菜籽餅的正交試驗(yàn)結(jié)果(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.3 酶菌協(xié)同發(fā)酵對(duì)菜籽餅pH及化學(xué)成分的影響

由表4可知,在最優(yōu)配比組合酶菌協(xié)同發(fā)酵條件下,菜籽餅發(fā)酵后的pH顯著低于發(fā)酵前(P<0.05),CP、TCA-SP含量顯著高于發(fā)酵前(P<0.05),NDF、ADF、半纖維素、Gls含量顯著低于發(fā)酵前(P<0.05),谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸及總氨基酸含量顯著高于發(fā)酵前(P<0.05)。

表4 酶菌協(xié)同發(fā)酵對(duì)菜籽餅pH及化學(xué)成分的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表4項(xiàng)目Items發(fā)酵前Before fermentation發(fā)酵后After fermentation均值標(biāo)準(zhǔn)誤SEMP值P-value絲氨酸 Ser/%1.54 1.550.010.06谷氨酸 Glu/%7.61b 7.73a 0.020.04甘氨酸 Gly/%2.05 2.13 0.020.10丙氨酸 Ala/%1.60b 1.68a 0.010.03半胱氨酸 Cys/%0.62 0.61 0.010.42纈氨酸 Val/%1.89b 1.94a 0.010.04蛋氨酸 Met/%0.75 0.75 0.010.42異亮氨酸 Ile/%1.56 1.58 0.010.12亮氨酸 Leu/%2.41b 2.45a 0.010.03酪氨酸 Tyr/%0.94 0.98 0.010.18苯丙氨酸 Phe/%1.71 1.73 0.010.07賴氨酸 Lys/%1.33 1.24 0.050.28組氨酸 His/%0.92 0.93 0.010.18精氨酸 Arg/%2.95 2.91 0.040.55脯氨酸 Pro/%1.76 1.80 0.010.17總氨基酸 TAA/%34.30b 34.72a 0.01<0.01

2.4 酶菌協(xié)同發(fā)酵對(duì)菜籽餅表面形態(tài)的影響

在最優(yōu)配比組合酶菌協(xié)同發(fā)酵條件下,電鏡觀察發(fā)酵前后菜籽餅表面形態(tài)見圖1。在400倍電鏡觀察下,發(fā)酵前的菜籽餅顆粒大,形態(tài)不規(guī)則;發(fā)酵后的菜籽餅顆粒較小,結(jié)構(gòu)較松散。在3 000倍電鏡觀察下,發(fā)酵前的菜籽餅表面光滑平整,呈較大的片狀,無小孔隙且結(jié)構(gòu)較為完整;發(fā)酵后的菜籽餅表面粗糙,呈現(xiàn)不規(guī)則分布,孔隙較多。

2.5 酶菌協(xié)同發(fā)酵對(duì)菜籽餅蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的影響

在最優(yōu)配比組合酶菌協(xié)同發(fā)酵條件下,發(fā)酵前后菜籽餅的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量結(jié)果見圖2。A區(qū)域蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為30～75 ku,B區(qū)域蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為12～23 ku,發(fā)酵前菜籽餅的蛋白質(zhì)在A區(qū)域分布有多個(gè)條帶,發(fā)酵后菜籽餅的蛋白質(zhì)主要分布在B區(qū)域。

2.6 酶菌協(xié)同發(fā)酵對(duì)不同來源菜籽餅粕養(yǎng)分含量的影響

在最優(yōu)配比組合酶菌協(xié)同發(fā)酵條件下,對(duì)9個(gè)不同來源菜籽餅粕進(jìn)行酶菌協(xié)同發(fā)酵。

A:發(fā)酵前(400×);B:發(fā)酵前(3 000×);C:發(fā)酵后(400×);D:發(fā)酵后(3 000×)。

2.6.1 pH及CP、TCA-SP含量

由表5可知,發(fā)酵前,9個(gè)菜籽餅粕的pH在5.46～5.95,平均值為5.75;發(fā)酵后,9個(gè)菜籽餅粕的pH在3.92～4.27,平均值為4.06。9個(gè)菜籽餅粕發(fā)酵后的pH均顯著低于發(fā)酵前(P<0.05),其中變化幅度最高的為菜籽餅9,降低幅度為1.98。

由表6可知,發(fā)酵前,9個(gè)菜籽餅粕的CP含量在37.07%～45.56%,平均值為43.00%;發(fā)酵后,9個(gè)菜籽餅粕的CP含量在38.85%～46.15%,平均值為43.57%。菜籽粕1、3及菜籽餅9發(fā)酵后的CP含量顯著高于發(fā)酵前(P<0.05)。發(fā)酵前,9個(gè)菜籽餅粕的TCA-SP含量在2.11%～3.19%,平均值為2.42%;發(fā)酵后,9個(gè)菜籽餅粕的TCA-SP含量在5.35%～6.52%,平均值為5.95%。9個(gè)菜籽餅粕發(fā)酵后的TCA-SP含量顯著高于發(fā)酵前(P<0.05),其中變化幅度最高的為菜籽粕1,提高幅度為192.38%。

2.6.2 NDF和Gls含量

由表7可知,發(fā)酵前,9個(gè)菜籽餅粕的NDF含量在27.03%～40.39%,平均值為32.61%;發(fā)酵后,9個(gè)菜籽餅粕的NDF含量在20.62%～34.76%,平均值為26.08%。9個(gè)菜籽餅粕發(fā)酵后的NDF含量顯著低于發(fā)酵前(P<0.05),其中變化幅度最高的為菜籽粕7,降低了26.00%;變化幅度最低的是菜籽餅1,降低了13.95%。

由表8可知,發(fā)酵前,9個(gè)菜籽餅粕的Gls含量在18.10～57.64 μmol/g,平均值為29.99 μmol/g;發(fā)酵后,9個(gè)菜籽餅粕的Gls含量在13.62～46.23 μmol/g,平均值為22.80 μmol/g。9個(gè)菜籽餅粕發(fā)酵后的Gls含量顯著低于發(fā)酵前(P<0.05),其中變化幅度最高的為菜籽粕1,降低了31.30%;變化幅度最低的是菜籽粕4,降低了16.20%。

表5 酶菌協(xié)同發(fā)酵對(duì)不同來源菜籽餅粕pH的影響

3 討 論

3.1 酶菌協(xié)同發(fā)酵對(duì)菜籽餅pH、化學(xué)成分及氨基酸含量的影響

本試驗(yàn)前期工作中發(fā)現(xiàn),混菌發(fā)酵菜籽餅對(duì)NDF降解作用較小,部分處理出現(xiàn)NDF含量升高的現(xiàn)象,這可能是由于寡糖及Gls含量的降低所形成的“濃縮效應(yīng)”[26];也可能是發(fā)酵后產(chǎn)生中性不溶洗滌物或酸性洗滌不溶物等,使NDF的表征值被高估了[27]。針對(duì)這一結(jié)果,本試驗(yàn)在混菌發(fā)酵體系中加了纖維素酶、果膠酶和α-半乳糖苷酶,采用酶菌協(xié)同發(fā)酵的方式,結(jié)果發(fā)現(xiàn),NDF降解率、TCA-SP增加率及總變化率在纖維素酶、果膠酶和α-半乳糖苷酶添加量分別為60、60和10 U/g時(shí)最高,分別為18.25%、175.72%和60.12%。Zhu等[28]研究發(fā)現(xiàn),用非淀粉多糖酶前處理再進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵,菜籽粕的NDF、ADF及半纖維素含量顯著降低,而乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵后其含量沒有顯著變化。王衛(wèi)衛(wèi)[29]篩選出的可降解羧甲基纖維素鈉的枯草芽孢桿菌,發(fā)酵后對(duì)棕櫚仁粕纖維降解效果較小,在進(jìn)行酶菌協(xié)同發(fā)酵后可顯著降低棕櫚仁粕的纖維含量。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果相近。

表6 酶菌協(xié)同發(fā)酵對(duì)不同來源菜籽餅粕CP和TCA-SP含量的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表7 酶菌協(xié)同發(fā)酵對(duì)不同來源菜籽餅粕NDF含量的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

續(xù)表7項(xiàng)目Items發(fā)酵前Before fermentation發(fā)酵后After fermentation變化幅度Amplitude of variation均值標(biāo)準(zhǔn)誤SEMP值P-value菜籽粕6 RSM628.67a23.25b-18.890.300.01菜籽粕7 RSM733.45a24.75b-26.000.20<0.01菜籽粕8 RSM832.79a24.90b-24.050.620.01菜籽餅9 RSC940.39a34.76b-13.950.06<0.01平均值 Mean32.6126.08

表8 酶菌協(xié)同發(fā)酵對(duì)不同來源菜籽餅粕Gls含量的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

本試驗(yàn)在最優(yōu)配比組合酶菌協(xié)同發(fā)酵條件下進(jìn)行酶菌協(xié)同發(fā)酵菜籽餅后,菜籽餅發(fā)酵后pH顯著低于發(fā)酵前,CP含量顯著高于發(fā)酵前。在菜籽餅發(fā)酵過程中微生物利用底物中的養(yǎng)分并形成菌體蛋白,并將菜籽餅中大分子蛋白質(zhì)分解為小肽,也因“濃縮效應(yīng)”使得發(fā)酵后CP含量升高。酶菌協(xié)同發(fā)酵菜籽餅后TCA-SP增加率為175.72%,TCA-SP主要是由氨基酸殘基組成的寡肽,動(dòng)物吸收寡肽的能力要高于游離的氨基酸[30]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,酶菌協(xié)同發(fā)酵菜籽餅的纖維(NDF、ADF和半纖維素)含量均降低,這與Zhu等[28]的報(bào)道相似。酶菌協(xié)同發(fā)酵后Gls降解率為60.12%,表明所用菌株對(duì)Gls有較強(qiáng)的降解能力。朱曉峰等[11]用乳酸桿菌發(fā)酵后,菜籽粕Gls含量降低了43.43%。郝怡寧等[31]用枯草芽孢桿菌和雅致放射毛霉發(fā)酵后,菜籽粕Gls含量降低了45.26%。本試驗(yàn)所用菌株降解Gls能力高于上述文獻(xiàn)菌株。

與豆粕相比,菜籽餅的氨基酸消化率較差[32]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,菜籽餅總氨基酸含量較發(fā)酵前顯著提高,但各氨基酸組成及含量變動(dòng)較小。在郝怡寧等[31]的報(bào)道中,菜籽粕發(fā)酵3 d時(shí)總氨基酸含量顯著高于未發(fā)酵時(shí),然而,發(fā)酵5 d后各氨基酸及總氨基酸含量出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。本試驗(yàn)中,氨基酸含量的變化可能受到菌株及發(fā)酵時(shí)間的影響,在發(fā)酵過程中的具體變化趨勢(shì)還需要進(jìn)一步進(jìn)行探討。

3.2 酶菌協(xié)同發(fā)酵對(duì)菜籽餅表面結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的影響

掃描電鏡結(jié)果表明,發(fā)酵前菜籽餅顆粒大形態(tài)不規(guī)則,經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵后,顆粒變小,表面粗糙出現(xiàn)凹凸不平的孔狀。這與Shi等[17]利用黑曲霉發(fā)酵菜籽粕的結(jié)果一致。菜籽餅完整細(xì)胞壁上的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)會(huì)保護(hù)其他養(yǎng)分如蛋白質(zhì)和多糖免于被降解或轉(zhuǎn)化[33],當(dāng)對(duì)菜籽餅進(jìn)行堆肥發(fā)酵后,其纖維素網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)大部分被破壞[34]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,酶菌協(xié)同發(fā)酵后菜籽餅表面結(jié)構(gòu)被破壞,使得表面積增加,在畜禽采食后,增加了腸道消化酶接觸飼料的面積,更有利于消化飼料。

菜籽蛋白主要有2種類別,主要是大分子的12S球蛋白(α亞基和β亞基)和小分子的2S白蛋白,其中12S球蛋白的分子質(zhì)量在30～60 ku,2S白蛋白分子質(zhì)量約為6、12和21 ku[18]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,未發(fā)酵菜籽餅主要為30～75 ku的大分子蛋白質(zhì),而酶菌協(xié)同發(fā)酵增加了小分子肽(<15 ku)的分布,這表明酶菌協(xié)同發(fā)酵在一定程度上將大分子蛋白質(zhì)分解為小分子肽,進(jìn)而增加菜籽餅小肽含量,這與Shi等[17]研究結(jié)果相似。與大分子蛋白質(zhì)相比,小分子肽更易被家禽腸道所捕獲吸收[18],有利于提高飼料養(yǎng)分消化率。

3.3 酶菌協(xié)同發(fā)酵對(duì)不同來源菜籽餅粕養(yǎng)分含量的影響

與豆粕相比,菜籽餅粕的纖維含量較高,含有Gls等抗?fàn)I養(yǎng)因子,極大限制了菜籽餅粕在畜禽中的應(yīng)用。而不同菜籽餅粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與養(yǎng)分消化率因來源不同、榨油工藝不同而有差異[35]。油菜籽加工副產(chǎn)物可根據(jù)加工方式的不同分為高溫?zé)嵴ゲ俗扬?、低溫冷榨菜籽餅以及壓餅后浸提的菜籽?不同榨油過程中的溫度處理生產(chǎn)的菜籽餅粕的養(yǎng)分和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量均有所不同[16]。Toghyani等[36]研究發(fā)現(xiàn),菜籽粕NDF含量與肉雞代謝能之間存在極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。Eklund等[37]研究發(fā)現(xiàn),豬的標(biāo)準(zhǔn)回腸氨基酸消化率隨著菜籽粕中NDF等纖維含量的升高而顯著降低。因此,提高菜籽餅粕的可消化蛋白質(zhì)含量,降低Gls及纖維含量,是提高菜籽餅粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要手段。

本試驗(yàn)通過酶菌協(xié)同發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)對(duì)9個(gè)不同來源的菜籽餅粕養(yǎng)分含量均有一定的改善作用。經(jīng)過酶菌協(xié)同發(fā)酵后,菜籽餅粕的pH均顯著降低。pH的降低可提高畜禽腸道內(nèi)胃蛋白酶的活性,從而促進(jìn)對(duì)養(yǎng)分的消化吸收[38]。經(jīng)過酶菌協(xié)同發(fā)酵后,9個(gè)菜籽餅粕的CP含量略有升高,提高的幅度非常有限,在1%左右,說明本試驗(yàn)酶菌協(xié)同發(fā)酵改善菜籽餅粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,對(duì)CP含量的提高并不明顯,而發(fā)酵體系蛋白質(zhì)含量的變化可能與菌體蛋白的產(chǎn)生有關(guān)。菌體蛋白產(chǎn)生量與發(fā)酵菌種有關(guān),Wang等[18]利用乳酸菌和地衣芽孢桿菌發(fā)酵菜籽粕,CP含量提高了12.09%;Shi等[17]用黑曲霉發(fā)酵菜籽粕后,CP含量提高了16.90%。本試驗(yàn)采用的枯草芽孢桿菌具有分泌酸性蛋白酶的活性,可促進(jìn)飼料大分子蛋白質(zhì)的進(jìn)一步降解,這與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的結(jié)果相一致的。本試驗(yàn)測(cè)定的9個(gè)菜籽餅粕的TCA-SP含量均有大幅度的提高,表明酶菌協(xié)同發(fā)酵對(duì)TCA-SP含量有明顯的提高作用。如前所述,TCA-SP主要是由氨基酸殘基組成的寡肽,動(dòng)物吸收寡肽的能力要高于游離的氨基酸[30]。Tie等[20]研究發(fā)現(xiàn),菜籽粕經(jīng)蛋白酶酶解及黑曲霉發(fā)酵后TCA-SP含量增加了629.66%。本試驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果相似。

菜籽餅粕的纖維含量高于豆粕3倍以上[39],且飼料原料纖維含量與代謝能存在負(fù)相關(guān)[36]。與飼喂玉米-豆粕基礎(chǔ)飼糧相比,飼喂菜籽餅粕原料的肉雞代謝能呈線性下降。相對(duì)較低的代謝能是限制菜籽餅粕在肉雞中飼喂效果的主要因素,這通常與纖維含量高有關(guān)。本試驗(yàn)中,經(jīng)過酶菌協(xié)同發(fā)酵后,9個(gè)菜籽餅粕的NDF含量均顯著降低,表明本試驗(yàn)選用混合微生物并聯(lián)合使用適宜的非淀粉多糖酶,均有一定降解9個(gè)不同來源菜籽餅粕NDF的效果。植物源性細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)錯(cuò)綜復(fù)雜,纖維互相纏繞形成堅(jiān)固的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[4],而菜籽餅粕纖維主要是難以被家禽利用的結(jié)構(gòu)性多糖[40],這種纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)會(huì)將蛋白質(zhì)及淀粉等可消化養(yǎng)分進(jìn)行包裹,不容易被分解利用[34]。而非淀粉多糖酶結(jié)合微生物進(jìn)行酶菌協(xié)同發(fā)酵可對(duì)菜籽餅粕中纖維等抗?fàn)I養(yǎng)因子或大分子結(jié)構(gòu)更具針對(duì)性和特異性,這種策略延長(zhǎng)了酶與底物的接觸與作用時(shí)間,能同時(shí)提高微生物發(fā)酵效果和酶解的效率。有研究表明,細(xì)胞壁的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)在纖維素酶、果膠酶的相互作用下得以打開并降解[41],此時(shí)微生物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用,將大分子化合物轉(zhuǎn)變?yōu)樾‰牡刃》肿踊衔?并利用纖維降解產(chǎn)生的可溶性糖轉(zhuǎn)化為乳酸等代謝產(chǎn)物[42]。朱曉峰等[11]報(bào)道了在纖維素酶及果膠酶的酶解作用下,菜籽粕的NDF含量由38.12%降至18.68%;王衛(wèi)衛(wèi)[29]研究發(fā)現(xiàn),用甘露聚糖、α-半乳糖苷酶協(xié)同植物乳桿菌和酵母菌發(fā)酵可顯著降低棕櫚仁粕的NDF含量,本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。

菜籽餅粕中的Gls可在芥子酶作用下分解為硫氰酸酯、異硫氰酸酯、噁唑烷硫酮及氰類化合物,可引起甲狀腺腫,導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩,故降低了畜禽生長(zhǎng)性能[7]。本試驗(yàn)中,經(jīng)過酶菌協(xié)同發(fā)酵后,9個(gè)菜籽餅粕的Gls含量顯著降低。降低菜籽餅粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子Gls的含量,是雙低菜籽餅粕育種技術(shù)的目標(biāo)[39],也是采用發(fā)酵技術(shù)改善菜籽餅粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的主要目標(biāo)之一[8],如利用枯草芽孢桿菌與毛菌混合發(fā)酵降解Gls[31],利用乳酸菌、酵母菌、地衣芽孢桿菌混合發(fā)降解Gls[18]。Gls含量的降低緩解了其對(duì)畜禽腸道、肝臟及甲狀腺的損傷,進(jìn)而提高畜禽對(duì)養(yǎng)分的消化吸收能力。此外,Gls含量的高低與生物發(fā)酵菌種有關(guān),本試驗(yàn)結(jié)果表明選用酶菌協(xié)同發(fā)酵不同來源的菜籽餅粕,均可以起到降解Gls的效果。

4 結(jié) 論

① 在混菌固態(tài)發(fā)酵體系中加入纖維素酶、果膠酶和α-半乳糖苷酶,添加量分別為60、60、10 U/g,發(fā)酵體系菜籽餅Gls降解率為60.12%,TCA-SP增加率為175.72%,NDF降解率為18.25%,總變化率為48.15%。

② 酶菌協(xié)同發(fā)酵改變了菜籽餅的表面結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),使蛋白質(zhì)分子質(zhì)量變小。

③ 酶菌協(xié)同發(fā)酵降低了不同來源菜籽餅粕中NDF、Gls含量,增加了TCA-SP含量,改善了菜籽餅粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。