基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究苦參抑菌活性成分及其作用機(jī)制

吳雅琳 曹志剛 孫盼盼 張 華 尹 偉 范闊海 孫耀貴 李宏全 孫 娜*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太谷 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心,太谷 030801)

2020年以前,在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中廣泛用抗生素作為飼料添加劑來提高畜禽生長性能、免疫力和預(yù)防細(xì)菌性疾病[1]。據(jù)報(bào)道,每年家禽抗生素銷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人用抗生素,造成抗生素濫用[2]。抗生素的濫用帶來了很多負(fù)面影響,包括產(chǎn)生耐藥性、破壞動(dòng)物腸道微生態(tài)環(huán)境和抗生素藥物污染[3]。為了減少抗生素帶來的負(fù)面影響,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布“禁抗令”。在這個(gè)大背景下,中草藥植物開發(fā)為新型飼料添加劑成為研究熱點(diǎn)。

許多中草藥植物提取物口服利用度低[4],進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)只有少部分能被吸收進(jìn)入血液,而大部分會(huì)與腸道菌群接觸,從而改變腸道菌群的多樣性[5]。中草藥植物提取物作為飼料添加劑添加至飼料中已用于養(yǎng)殖生產(chǎn)上,現(xiàn)國內(nèi)外研究表明,中草藥植物提取物作為飼料添加劑的作用機(jī)制主要集中在增強(qiáng)免疫力、促生長、調(diào)控腸道菌群、緩解應(yīng)激等方面[6]。目前,博落回散、山花黃芩提取物散、裸花紫珠末等中草藥植物提取物已被注冊為新獸藥飼料添加劑,這些飼料添加劑具有抗菌、消炎、開胃、促生長等功能。

苦參,豆科槐屬植物,其性味苦、寒,歸心臟、肝臟、胃、大腸、膀胱經(jīng),具有利尿、殺蟲、清熱燥濕和抗菌等功效。有研究證明,苦參提取物有抑菌及促生長作用[7-8],但苦參具體的抑菌藥效成分及其作用機(jī)制尚未知。所以本研究將從抑菌方面入手,探究苦參提取物的關(guān)鍵抑菌靶點(diǎn)及作用機(jī)制,并為將其開發(fā)為新型飼料添加劑提供理論基礎(chǔ)。本研究使用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)預(yù)測苦參藥效成分及靶點(diǎn),從疾病數(shù)據(jù)庫收集抑菌潛在靶點(diǎn),利用基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析來尋找潛在作用靶點(diǎn)和代謝通路,利用分子對接來驗(yàn)證苦參核心藥效成分與核心靶點(diǎn)之間的相互結(jié)合的穩(wěn)定性,最終確定苦參抑菌的核心成分、核心靶點(diǎn)與通路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫平臺

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究所用數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址見表1。

表1 本研究所用數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苦參藥效成分篩選

苦參的化學(xué)成分通過TCMSP進(jìn)行搜索,依據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18篩選苦參藥效成分,并獲取所篩選苦參藥效成分的潛在靶點(diǎn),苦參藥效成分的關(guān)鍵信息通過PubChem數(shù)據(jù)庫搜索。

1.2.2 苦參藥效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將篩選到的苦參藥效成分的潛在靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為統(tǒng)一的基因名稱,并且利用Cytoscape 3.7.0軟件將苦參藥效成分及其作用靶點(diǎn)構(gòu)建成苦參藥效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.3 抑菌相關(guān)基因檢索

利用GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫篩選抑菌相關(guān)靶點(diǎn),合并2個(gè)數(shù)據(jù)庫中所檢索的基因后,刪除重復(fù)項(xiàng),即完成抑菌相關(guān)基因的收集。

1.2.4 苦參抑菌作用的基因靶點(diǎn)篩選

將抑菌相關(guān)靶點(diǎn)與苦參潛在作用靶點(diǎn)上傳到Venny 2.1軟件分析得到兩者的交叉靶點(diǎn)并繪制成韋恩圖,篩選與苦參抗菌相關(guān)的基因,利用Cytoscape 3.7.0軟件將其可視化構(gòu)建藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.5 苦參抑菌的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將交集的靶點(diǎn)導(dǎo)入至STRING數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行PPI預(yù)測分析,將獲得PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件,進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。以2倍中位數(shù)的度(degree)、節(jié)點(diǎn)緊密度(closeness)與節(jié)點(diǎn)連接度(betweeness)的中位數(shù)作為篩選標(biāo)準(zhǔn),以篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2.6 苦參抑菌作用靶點(diǎn)GO功能和KEGG富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫對苦參抑菌靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG富集分析,調(diào)整篩選標(biāo)準(zhǔn)為P≤0.05,將GO功能富集分析排名前10的條目制成統(tǒng)計(jì)柱狀圖,選取KEGG富集分析排名前20的信號通路繪制富集顯著性氣泡圖,以探討苦參抑菌靶點(diǎn)在基因功能和信號通路中的作用。

1.2.7 分子對接

選取苦參藥效成分中的5個(gè)抑菌關(guān)鍵靶點(diǎn)和5個(gè)苦參關(guān)鍵藥效成分進(jìn)行對接。從PBD數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵抑菌靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)?？鄥⒌年P(guān)鍵藥效成分的分子結(jié)構(gòu)從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載。靶點(diǎn)蛋白和關(guān)鍵藥效成分分子的前期處理利用PyMol 2.4軟件和Autodock Tools 1.5.7軟件完成。之后將關(guān)鍵抑菌靶點(diǎn)和藥效成分結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Autodock Tools 1.5.7軟件中進(jìn)行分子對接驗(yàn)證試驗(yàn),其活性口袋位置取決于原配體位置,結(jié)合能越小代表對接越穩(wěn)定,若結(jié)合能<0 kcal/mol,表示蛋白與小分子能夠自發(fā)地結(jié)合;結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol,則表示結(jié)合活性良好。選取結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol的蛋白-小分子對接,通過PyMol 2.4軟件進(jìn)行對接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦參所含藥效成分

運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索得到113個(gè)化學(xué)成分、以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為前提,篩選出24個(gè)藥效成分,如表2所示。藥效成分主要為黃酮類化合物、生物堿類化合物等。

表2 苦參主要藥效成分

2.2 苦參藥效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

苦參藥效成分的作用靶點(diǎn)利用TCMSP數(shù)據(jù)庫收集并去除重復(fù)項(xiàng),共獲得藥效成分作用靶點(diǎn)197個(gè)?？鄥⑺幮С煞?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建通過Cytoscape 3.7.0軟件完成,如圖1所示。

PSMD3:蛋白酶體26S非腺嘌呤核苷三磷酸酶調(diào)節(jié)亞基3 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 3;HSD3B1:3β羥基類固醇脫氫酶/δ5-4異構(gòu)酶1型 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-4-isomerase type 1;HSD3B2:3β羥基類固醇脫氫酶/δ5-4異構(gòu)酶2型 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-4-isomerase type 2;HTR3A:5-羥色胺受體3A 5-hydroxytryptamine receptor 3A;MMP2:基質(zhì)金屬蛋白酶2 matrix metalloproteinase 2;HSPA5:熱休克蛋白5 heat shock protein 5;ACHE:乙酰膽堿酯酶 acetylcholinesterase;ACACA:乙酰輔酶A羧化酶 acetyl-CoA carboxylase;AHSA1:熱休克90 kDa蛋白ATP酶同源物1(酵母)激活因子 activator of 90 kDa heat shock protein ATPase homolog 1;APC2:腺瘤性多發(fā)性大腸桿菌蛋白2 adenomatous polyposis coli protein 2;ADCY2:腺苷酸環(huán)化酶2 adenylate cyclase type 2;AKR1C3:醛固酮類還原酶家族1成員C3 Aldo-keto reductase family 1 member C3;AKR1B1:醛糖還原酶 aldose reductase;AAGAB:α-γ銜接蛋白p34 alpha- and gamma-adapt in-binding protein p34;ADRA1A:α-1A腎上腺素能受體 alpha-1A adrenergic receptor;ADRA1B:α-1B腎上腺素能受體 alpha-1B adrenergic receptor;ADRA1D:α-1D腎上腺素能受體 alpha-1D adrenergic receptor;ADRA2A:α-2A腎上腺素能受體 alpha-2A adrenergic receptor;ADRA2B:α-2B腎上腺素能受體 alpha-2B adrenergic receptor;ADRA2C:α-2C腎上腺素能受體 alpha-2C adrenergic receptor;MAOA:胺氧化酶A amine oxidase [flavin-containing] A;MAOB:胺氧化酶B amine oxidase [flavin-containing] B;APP:β淀粉樣蛋白A4 amyloid beta A4 protein;AR:雄激素受體 androgen receptor;BAX:細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子 apoptosis regulator;BCL2:細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子2 apoptosis regulatory factor 2;ALOX5:花生四烯酸5-脂氧合酶 arachidonate 5-lipoxygenase;AHR:芳香烴受體 aryl hydrocarbon receptor;ATP5F1B:ATP合酶β,線粒體 ATP synthase subunit beta, mitochondrial;ABCG2:腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2 ATP-binding cassette sub-family G member 2;XIAP:抑制細(xì)胞凋亡樣蛋白 baculoviral IAP repeat-containing protein;BIRC5:抑制細(xì)胞凋亡樣蛋白5 baculoviral IAP repeat-containing protein 5;BAD:BCL2細(xì)胞死亡拮抗劑 BCL2 antagonist of cell death;BCL2L1:BCL-2樣蛋白1 BCL-2-like protein 1;ADRB1:腎上腺素β1受體 beta-1 adrenergic receptor;ADRB2:腎上腺素β2受體 beta-2 adrenergic receptor;KCNMA1:鈣激活鉀通道蛋白α1 calcium-activated potassium channel subunit alpha 1;PKIA:cAMP環(huán)磷酸腺苷依賴的蛋白激酶抑制因子α cAMP-dependent protein kinase inhibitor alpha;CA2:碳酸酐酶2 carbonic anhydrase 2;CASP3:半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3 caspase 3;CASP7:半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶7 caspase 7;CASP8:半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶8 caspase 8;CASP9:半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶9 caspase 9;CTSD:組織蛋白酶D cathepsin D;CAV1:微囊蛋白1 caveolin 1;CCL2:CC基序趨化因子配體2 CC motif chemokine 2;CD40LG:CD40配體 CD40 ligand;CD44:CD44抗原 CD44 antigen;CDK2:細(xì)胞分裂蛋白激酶2 cell division protein kinase 2;CDK4:細(xì)胞分裂蛋白激酶4 cell division protein kinase 4;CDK6:細(xì)胞分裂蛋白激酶6 cell division protein kinase 6;TP53:腫瘤蛋白p53 cellular tumor antigen p53;CTRB1:胰凝乳蛋白酶B1 chymotrypsinogen B1;CLDN4:緊密鏈接蛋白4 claudin 4;F7:凝血因子7 coagulation factor Ⅶ;COL1A1:1型α-1膠原蛋白鏈 collagen alpha-1(I) chain;COL3A1:3型α-1膠原蛋白鏈 collagen alpha-1(Ⅲ) chain;CRP:C反應(yīng)蛋白 C-reactive protein;CXCL10:趨化因子10(C-X-C基序) C-X-C motif chemokine 10;CXCL11:趨化因子11(C-X-C基序) C-X-C motif chemokine 11;CXCL2:趨化因子2(C-X-C基序) C-X-C motif chemokine 2;CCNA2:周期蛋白A2 cyclin-A2;CDKN1A:細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A cyclin-dependent kinase inhibitor 1A;CDKN2A:細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A cyclin-dependent kinase inhibitor 2A;CYCS:細(xì)胞色素C cytochrome C;CYP19A1:細(xì)胞色素P450家族19亞族A多肽1 cytochrome P450 19A1;CYP1A1:細(xì)胞色素P450家族1亞族A多肽1 cytochrome P450 1A1;CYP1A2:細(xì)胞色素P450家族1亞族A多肽2 cytochrome P450 1A2;CYP1B1:細(xì)胞色素P450家族1亞族B多肽1 cytochrome P450 1B1;CYP3A4:細(xì)胞色素P450家族3亞族A多肽4 cytochrome P450 3A4;DCAF5:DDB1與CUL4蛋白鏈接因子5 DDB1- and CUL4-associated factor 5;DPP4:二肽激肽酶-4 dipeptidyl peptidase IV;TOP1:DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶1 DNA topoisomerase 1;TOP2A:DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶2α DNA topoisomerase 2-alpha;ALG5:多萜基磷酸β-葡糖基轉(zhuǎn)移酶5 dolichyl-phosphate beta-glucosyltransferase 5;DUOX2:雙氧化酶2 dual oxidase 2;EGFR:表皮生長因子受體 epidermal growth factor receptor;SELE:選擇素E E-selectin;ESR1:雌激素受體1 estrogen receptor 1;ESR2:雌激素受體β2 estrogen receptor beta 2;SULT1E1:類固醇硫酸酯酶 estrogen sulfotransferase;ELK1:轉(zhuǎn)錄激活因子ETS樣蛋白Elk-1 ETS domain-containing protein Elk-1;EEF1E1:真核翻譯延伸因子1 eukaryotic translation elongation factor 1 epsilon-1;EIF6:真核翻譯起始因子6 eukaryotic translation initiation factor 6;CCND1:周期蛋白D1 G1/S-specific cyclin-D1;CCND2:周期蛋白D2 G1/S-specific cyclin-D2;CCNB1:周期蛋白B1 G2/mitotic-specific cyclin-B1;GABRA1:γ氨基丁酸亞基受體α1 gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-1;GABRA2:γ氨基丁酸亞基受體α2 gamma-aminobutyric-acid receptor alpha-2 subunit;NR3C1:糖皮質(zhì)激素受體 glucocorticoid receptor;G6PC2:葡萄糖-6-磷酸酶 glucose-6-phosphatase;GSTM1:谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶Mu 1 glutathione S-transferase Mu 1;GSTM2:谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶Mu 2 glutathione S-transferase Mu 2;GSTP1:谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P glutathione S-transferase P;PYGM:肌肉糖原磷酸化酶 glycogen phosphorylase muscle form;GSK3B:糖原合酶激酶3β glycogen synthase kinase 3 beta;HSF1:熱休克因子蛋白1 heat shock factor protein 1;HSPB1:熱休克蛋白β1 heat shock protein beta 1;HMOX1:血紅素氧合酶1 heme oxygenase 1;HPSE:乙酰肝素酶 heparanase;MET:肝細(xì)胞生長因子受體 hepatocyte growth factor receptor;HK2:己糖激酶2 hexokinase 2;MS4A2:高親和力免疫球蛋白ε受體亞基β high affinity immunoglobulin epsilon receptor subunit beta;HAS2:透明質(zhì)酸合成酶2 hyaluronan synthase 2;HIF1A:缺氧誘導(dǎo)因子1α hypoxia-inducible factor 1 alpha;IER3IP1:即早反應(yīng)蛋白3相互作用蛋白1 immediate early response 3-interacting protein 1;MCL1:誘導(dǎo)骨髓白血病細(xì)胞分化蛋白1 induced myeloid leukemia cell differentiation protein 1;CHUK:核因子抑制劑kappa-B激酶亞基α inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit alpha;INS:胰島素 insulin;INSR:胰島素受體 insulin receptor;IGF1R:胰島素樣生長因子受體1 insulin-like growth factor 1 receptor;IGF2:胰島素樣生長因子2 insulin-like growth factor 2;IGFBP3:胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3 insulin-like growth factor-binding protein 3;ICAM1:細(xì)胞間黏附分子1 intercellular adhesion molecule 1;IFNG:干擾素γ interferon gamma;IRF1:干擾素調(diào)節(jié)因子1 interferon regulatory factor 1;IL-1α:白細(xì)胞介素-1α interleukin-1 alpha;IL-1β:白細(xì)胞介素-1β interleukin-1 beta;IL-10:白細(xì)胞介素-10 interleukin-10;IL-13:白細(xì)胞介素-13 interleukin-13;IL-2:白細(xì)胞介素-2 interleukin-2;IL-4:白細(xì)胞介素-4 interleukin-4;IL-6:白細(xì)胞介素-6 interleukin-6;IL-8:白細(xì)胞介素-8 interleukin-8;MMP1:間質(zhì)膠原酶1 interstitial collagenase 1;ALPI:腸道堿性磷酸酶 intestinal-type alkaline phosphatase;FCER2:低親和力免疫球蛋白εFc受體2 low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor 2;MMP9:基質(zhì)金屬蛋白酶9 matrix metalloproteinase 9;NR3C2:鹽皮質(zhì)激素受體 mineralocorticoid receptor;MAPK1:絲裂原活化蛋白激酶1 mitogen-activated protein kinase 1;MAPK14:絲裂原活化蛋白激酶14 mitogen-activated protein kinase 14;CHRM1:毒蕈堿型乙酰膽堿受體M1 muscarinic acetylcholine receptor M1;CHRM2:毒蕈堿型乙酰膽堿受體M2 muscarinic acetylcholine receptor M2;CHRM3:毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3 muscarinic acetylcholine receptor M3;MPO:過氧化酶 myeloperoxidase;NQO1:NAD(P)H醌脫氫酶1 NAD(P)H dehydrogenase [quinone] 1;MT-ND6:NADH復(fù)合體6 NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 6;POR:NADPH細(xì)胞色素P450還原酶 NADPH-cytochrome P450 reductase;NCF1:中性粒細(xì)胞胞質(zhì)因子1 neutrophil cytosol factor 1;IKBKG:NF-kappa-B基本調(diào)節(jié)劑 NF-kappa-B essential modulator;NFKBIA:NF-kappa-B抑制劑α NF-kappa-B inhibitor alpha;NOS3:一氧化氮合酶3 nitric oxide synthase 3;NOS2:一氧化氮合酶2 nitric oxide synthase 2;NFE2L2:核因子相關(guān)因子2 nuclear factor erythroid 2-related factor 2;NCOA1:核受體共激活因子1 nuclear receptor coactivator 1;NCOA2:核受體共激活因子2 nuclear receptor coactivator 2;ODC1:鳥氨酸脫羧酶1 ornithine decarboxylase 1;SPP1:骨橋蛋白1 osteopontin 1;PPARG:過氧化物酶體增值物活化受體γ peroxisome proliferator activated receptor gamma;PPARA:過氧化物酶體增值物活化受體α peroxisome proliferator-activated receptor alpha;PPARD:過氧化物酶體增值物活化受體δ peroxisome proliferator-activated receptor delta;SERPINE1:纖溶酶原激活物抑制劑1 plasminogen activator inhibitor 1;PARP1:多聚ADP核糖聚合酶1 poly [ADP-ribose] polymerase 1;PCOLCE1:前膠原C內(nèi)肽酶增強(qiáng)子1 procollagen C-endopeptidase enhancer 1;EGF:表皮生長因子 pro-epidermal growth factor;PGR:孕激素受體 progesterone receptor;PCNA:增殖細(xì)胞核抗原 proliferating cell nuclear antigen;PTGES:前列腺素E合成酶 prostaglandin E synthase;PTGER3:前列腺素E2受體EP3 prostaglandin E2 receptor EP3 subtype;PTGS1:前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1 prostaglandin G/H synthase 1;PTGS2:前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2 prostaglandin G/H synthase 2;ACP3:前列腺酸性磷酸酶3 prostatic acid phosphatase 3;PSME3:蛋白酶體激活因子復(fù)合體亞基3 proteasome activator complex subunit 3;PRKCA:蛋白激酶C-α protein kinase C alpha type;PRKCB:蛋白激酶C-β protein kinase C beta type;FOS:轉(zhuǎn)錄因子c-Fos proto-oncogene c-Fos;NPEPPS:嘌呤霉素敏感性氨肽酶 puromycin-sensitive aminopeptidase;AKT1:絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1 serine/threonine-protein kinase 1;RAF1:原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase;RASSF1:包含Ras關(guān)聯(lián)域的蛋白1 Ras association domain-containing protein 1;RASA1:GTP酶活化蛋白1 Ras GTPase-activating protein 1;ERBB2:受體酪氨酸蛋白激酶2 receptor tyrosine-protein kinase 2;ERBB3:受體酪氨酸蛋白激酶3 receptor tyrosine-protein kinase 3;RB1:視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1 retinoblastoma-associated protein 1;RXRA:維甲酸X受體α retinoic acid receptor RXR-alpha;RXRB:維甲酸X受體β retinoic acid receptor RXR-beta;RUNX2:Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 Runt-related transcription factor 2;CHEK1:絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1 serine/threonine-protein kinase 1;CHEK2:絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2 serine/threonine-protein kinase 2;PON1:對氧磷酸1 serum paraoxonase/arylesterase 1;STAT1:信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子1 signal transducer and activator of transcription 1;SCN10A:鈉通道蛋白10亞基α sodium channel protein type 10 subunit alpha;SCN5A:鈉通道蛋白5亞基α sodium channel protein type 5 subunit alpha;SLC5A5:鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5 sodium/iodide cotransporter 5;FXYD2:鈉/鉀轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶亞基γ 2 sodium/potassium-transporting ATPase subunit gamma 2;SLC6A3:鈉依賴性多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 sodium-dependent dopamine transporter;SLC6A2:鈉依賴性去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 sodium-dependent noradrenaline transporter;SLC6A4:鈉依賴性5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體 sodium-dependent serotonin transporter;SOD1:超氧化物歧化酶1 superoxide dismutase 1;THBD:血栓調(diào)節(jié)蛋白 thrombomodulin;F3:組織因子 tissue factor;PLAT:組織型纖溶酶原激活劑 tissue-type plasminogen activator;JUN:轉(zhuǎn)錄因子AP-1 transcription factor AP-1;E2F1:轉(zhuǎn)錄因子E2F1 transcription factor E2F1;E2F2:轉(zhuǎn)錄因子E2F2 transcription factor E2F2;RELA:轉(zhuǎn)錄因子p65 transcription factor p65;TGFB1:轉(zhuǎn)化生長因子β1 transforming growth factor beta-1;TRPM2:瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族M成員2 transient receptor potential cation channel subfamily M member 2;PRSS1:胰蛋白酶1 trypsin-1;TNF:腫瘤壞死因子 tumor necrosis factor;DIO1:Ⅰ型碘甲狀腺原氨酸脫碘酶 type I iodothyronine deiodinase;TYR:酪氨酸酶 tyrosinase;PLAU:尿激酶型纖溶酶原激活物 urokinase-type plasminogen activator;VCAM1:血管細(xì)胞黏附蛋白1 vascular cell adhesion protein 1;VEGFA:血管內(nèi)皮生長因子A vascular endothelial growth factor A;KDR:血管內(nèi)皮生長因子受體 vascular endothelial growth factor receptor;XDH:黃嘌呤脫氫酶 xanthine dehydrogenase/oxidase。下同 the same as below。

2.3 苦參藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

利用GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫篩選抑菌相關(guān)靶點(diǎn)去除重復(fù)靶點(diǎn)后得到907個(gè)靶點(diǎn)?？鄥撛谧饔冒悬c(diǎn)與抑菌相關(guān)靶點(diǎn)取交集后得到75個(gè)交集靶點(diǎn),如圖2所示。通過Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。作用靶點(diǎn)越多的藥效成分,其在生理生化作用中越關(guān)鍵(表3)。篩選出排名前5位的關(guān)鍵藥效成分,分別為槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素、8-異戊烯基山奈酚、菜豆素。

2.4 苦參抑菌的PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

利用STRING數(shù)據(jù)庫將75個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析,其中1個(gè)靶點(diǎn)蛋白上的連線越多,說明與其相互作用的蛋白也越多,該蛋白的等級越高。將構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件中并進(jìn)行拓?fù)浞治?。如圖4所示,此網(wǎng)絡(luò)圖包括30個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 070條相互關(guān)系,等級越高的靶點(diǎn)顏色越深,節(jié)點(diǎn)越大。根據(jù)靶點(diǎn)的degree值排名(表4)可知,篩選排名前5的關(guān)鍵靶點(diǎn)用于后續(xù)分子對接。

圖2 苦參與抑菌靶點(diǎn)韋恩圖

表3 苦參藥效成分對應(yīng)的抑菌靶點(diǎn)

2.5 苦參GO功能富集分析

75個(gè)苦參關(guān)鍵抑菌靶點(diǎn)利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析,共獲取616條GO條目,分別選取前10個(gè)分析條目繪制柱狀圖,結(jié)果如圖5所示?？鄥⒁志悬c(diǎn)的功能通過生物過程(biological process)、分子功能(molecular function)和細(xì)胞組分(cellular component)3個(gè)部分呈現(xiàn)。生物過程主要涉及細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路(cytokine-mediated signaling pathway)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)、對藥物的反應(yīng)(response to drug)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)、對異物刺激的反應(yīng)(response to xenobiotic stimulus)、缺乏配體的外源性凋亡信號通路(extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand)、基因表達(dá)的正向調(diào)控(positive regulation of gene expression)、凋亡過程的正向調(diào)控(positive regulation of apoptotic process)等496個(gè);細(xì)胞組分主要分布于細(xì)胞外空間(extracellular space)、核質(zhì)(nucleoplasm)、大分子復(fù)合物(macromolecular complex)、細(xì)胞外區(qū)(extracellular region)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)、胞質(zhì)溶膠(cytosol)、染色質(zhì)(chromatin)、線粒體(mitochondrion)等40個(gè);分子功能主要體現(xiàn)在酶結(jié)合(enzyme binding)、蛋白結(jié)合(protein binding)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(transcriptionfactor binding)、蛋白質(zhì)同源二聚化活性(protein homodimerization activity)、BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合(BH3 domain binding)、序列特異性 DNA 結(jié)合(sequence-specific DNA binding)等80個(gè)。

通過拓?fù)浞治?確定苦參抑菌相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò),顏色越深,圓圈越大,其度值越高。

表4 苦參抑菌STRING網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵抑菌靶點(diǎn)

續(xù)表4序號No.基因名稱 Gene name度 Degree序號No.基因名稱 Gene name度 Degree19IL-24057CYP3A41420STAT14058TOP2A1421IL-43959BCL21322MMP23960NR1I21223PTEN3961PRKCB1224BCL2L13762TOP11225SIRT13563PTGS11026IL-1α3364DUOX2927TGFB13365GSTM1928CXCL103266ODC1729MAPK13267XDH730MAPK143268SLC6A4631MPO3269SULT1E1432CRP3170HTR3A333NFE2L23171ADRA1D234NOS23172KCNH2235SERPINE13173KCNMA1236MCL13074CHRM3137MMP12975DPEP1138PARP129

2.6 KEGG通路富集分析

為了深入探討苦參抑菌的潛在機(jī)制,75個(gè)苦參抑菌靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行,獲得156條通路抑菌相關(guān)通路,選取前20條通路繪制氣泡圖(圖6)。結(jié)果顯示,苦參抑菌靶點(diǎn)涉及多條與抑菌密切相關(guān)的信號通路,主要涉及腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、白細(xì)胞介素-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、C型凝集素受體信號通路(C-type lectin receptor signaling pathway)、晚期糖基化終末化產(chǎn)物信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等。

2.7 分子對接

將關(guān)鍵苦參藥效成分槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素、8-異戊烯基山奈酚、菜豆素與關(guān)鍵抑菌靶點(diǎn)AKT1、IL-6、TNF、IL-1β、TP53編碼的蛋白分子進(jìn)行對接,結(jié)果見表5,所有組合對接結(jié)合能均小于0 kcal/mol,表明蛋白與小分子能夠自發(fā)結(jié)合。其中結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol的蛋白-小分子對接結(jié)果3D示意圖見圖7～圖11,AKT1、TNF、TP53與槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、刺芒柄花素(formononetin)、8-異戊烯基山奈酚(8-isopentenyl-kaempferol)、菜豆素(phaseolin)對接結(jié)合能較低,可形成穩(wěn)定的復(fù)合物。因此,AKT1、TNF、TP53為苦參較好的結(jié)合靶點(diǎn)。

3 討 論

苦參是清熱燥濕代表藥物之一,具有治療濕熱瀉痢、黃疸、尿閉、疥癬等功效。有研究發(fā)現(xiàn),苦參對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等有抑制作用[7-8]。但苦參具體的抗菌藥效成分及其作用機(jī)制尚未知。目前,有許多藥物通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來預(yù)測其作用靶點(diǎn)及機(jī)制,并取得良好成效。Li等[9]在研究維生素C對治療肺炎作用機(jī)制中,運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫、GeneCard數(shù)據(jù)庫、STRING數(shù)據(jù)庫等預(yù)測關(guān)鍵蛋白,發(fā)現(xiàn)維生素C對治療肺炎作用的靶點(diǎn)主要有絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、血管緊張素-2(AT-2)、促醛固酮激素2(AGTR2)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3),其抗肺炎作用與抑制炎癥作用和增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。Pan等[10]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究桂枝少瑤對治療慢性疼痛相關(guān)有效成分和潛在靶點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測,發(fā)現(xiàn)桂枝少瑤對治療慢性疼痛的潛在機(jī)制主要與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù),預(yù)測苦參藥效成分及其抑菌的潛在作用機(jī)制和靶點(diǎn)。

Biological process:生物過程;cytokine-mediated signaling pathway:細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路;inflammatory response:炎癥反應(yīng);response to drug:對藥物的反應(yīng);negative regulation of apoptotic process:凋亡過程的負(fù)調(diào)控;response to xenobiotic stimulus:對異物刺激的反應(yīng);extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand:缺乏配體的外源性凋亡信號通路;positive regulation of gene expression:基因表達(dá)的正向調(diào)控;positive regulation of apoptotic process:凋亡過程的正調(diào)控; positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter:RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子對pri-miRNA轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控;positive regulation of transcription, DNA-template:轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控,DNA模板;cellular component:細(xì)胞組分;extracellular space:細(xì)胞外空間;nucleoplasm:核質(zhì);macromolecular complex:大分子復(fù)合物;extracellular region:細(xì)胞外區(qū);cytoplasm:細(xì)胞質(zhì);cytosol:胞質(zhì)溶膠;chromatin:染色質(zhì);mitochondrion:線粒體;transcription factor complex:轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物;nuclear membrane:核膜;molecular function:分子功能;enzyme binding:酶結(jié)合;protein binding:蛋白結(jié)合;cytokine activity:細(xì)胞因子活性;transcription factor binding:轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合;protein homodimerization activity:蛋白質(zhì)同源二聚化活性;BH3 domain binding: BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合;sequence-specific DNA binding:序列特異性DNA結(jié)合;identical protein binding:相同蛋白結(jié)合;RNA polymerase Ⅱ transcription factor activity, ligand-activated sequence-specific DNA binding:RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性,配體激活特殊DNA結(jié)合序列;steroid binding:膽固醇結(jié)合。

TNF signaling pathway:腫瘤壞死因子信號通路;IL-17 signaling pathway:白細(xì)胞介素-17信號通路;C-type lectin receptor signaling pathway:C型凝集素受體信號通路;AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications:晚期糖基化終末化產(chǎn)物信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用;Pathways in cancer:癌癥途徑;Lipid and atherosclerosis:血脂和動(dòng)脈粥樣硬化;Leishmaniasis:利什曼病;Toxoplasmosis:弓形蟲病;Hepatitis B:乙型肝炎;Small cell lung cancer:肺小細(xì)胞癌;Fluid shear stress and atherosclerosis:流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化;Chagas disease:美洲錐蟲病;Measles:麻疹;Influenza A:甲型流感;Endocrine resistance:抵抗內(nèi)分泌;Human T-cell leukemia virus 1 infection:人類T細(xì)胞白血病;Human cytomegalovirus infection:人類巨細(xì)胞病毒感染;Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection:卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒;Epstein-Barr virus infection:EB病毒感染;Hepatitis C:丙型肝炎。

表5 苦參核心藥效成分與關(guān)鍵抑菌靶點(diǎn)的結(jié)合能

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)篩選出的苦參藥效成分主要是生物堿類化合物和黃酮類化合物。文獻(xiàn)中也報(bào)道了黃酮類化合物、生物堿類化合物是苦參的主要藥效成分[11-12]。其中槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素、菜豆素、高麗槐素等黃酮類化合物有抑菌多種病原微生物生長的傾向[13]。槲皮素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有良好的抑制作用,槲皮素的抗菌機(jī)制主要包括破壞細(xì)菌細(xì)胞壁,改變細(xì)胞通透性,影響蛋白質(zhì)合成和表達(dá),降低酶活性,抑制核酸合成[14]。有研究發(fā)現(xiàn),木犀草素對幽門螺旋桿菌有抑制作用[15]。苦參堿、槐定堿等生物堿類化合物對細(xì)菌也有抑制作用[16],其中苦參堿灌胃給藥的生物利用度僅為(17.1±5.4)%[17],因此其適用于調(diào)控腸道菌群。實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果顯示,苦參堿顯著增加了擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、擬桿菌目(Bacteroiidales)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)的豐度,而顯著減少了厚壁菌門(Firmicutes)、梭菌綱(Clostridia)、梭菌目(Clostridiales)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)的豐度[18],其中嗜酸乳桿菌添加到肉雞飼糧中,能提高肉雞生長性能和免疫性能,降低大腸桿菌感染組肉雞死亡率[19]?；诖?推測苦參可通過這24個(gè)藥效成分發(fā)揮抑菌作用。

圖7 AKT1與苦參核心藥效成分分子對接3D圖(結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol)

圖8 IL-6與苦參核心藥效成分分子對接3D圖(結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol)

PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明,苦參抑菌作用核心靶點(diǎn)AKT1、IL-6、TNF、、IL-1β、TP53等互作頻率較大,為苦參關(guān)鍵抑菌靶點(diǎn)。AKT1與TP53均參與細(xì)胞凋亡與葡萄糖代謝作用,影響細(xì)胞的增殖和生長[20]。AKT1可以通過抑制肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)過程、吞噬小體與溶酶體融合,來抑制細(xì)菌的殺滅和促進(jìn)細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)生長[21]。研究表明,TP53具有控制細(xì)菌感染的作用,抑制TP53可能賦予細(xì)菌一定的生長優(yōu)勢[22]。IL-1β與IL-6是多功能的細(xì)胞因子,能夠引起T細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞在炎癥局部聚集和促進(jìn)抗體的產(chǎn)生[23-24]。TNF是一種多效應(yīng)細(xì)胞因子,在免疫系統(tǒng)中能上調(diào)炎癥因子IL-8的表達(dá),刺激炎癥的發(fā)生[25]。有研究表明,感染病原體的宿主細(xì)胞產(chǎn)生一系列促炎細(xì)胞因子,包括IL-1β、IL-6和TNF[26],在促進(jìn)和調(diào)節(jié)細(xì)菌病原體的免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[27]。

圖11 TP53與苦參核心藥效成分分子對接3D圖(結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol)

本研究中,GO富集分析表明苦參活性成分可在細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)、線粒體、染色質(zhì)等細(xì)胞的不同部位,通過發(fā)揮酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等分子功能,在細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、炎癥反應(yīng)、凋亡過程的正負(fù)調(diào)控、對藥物的反應(yīng)等不同的生物過程中發(fā)揮作用,從而在抑菌中起作用。同時(shí)KEGG通路富集分析顯示與苦參作用于抑菌作用相關(guān)性較大發(fā)代謝通路有IL-17信號通路、TNF信號通路、C型凝集素受體信號通路、AGE-RAGE信號通路、在糖尿病并發(fā)癥中的作用等,這說明苦參可能通過多靶點(diǎn)多通路來抑制細(xì)菌。TNF廣泛存在于抗病毒、抗細(xì)菌及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程[28-29]。IL-17主要由免疫細(xì)胞產(chǎn)生,具有強(qiáng)大的促炎特性[30]。它通常通過結(jié)合它們的特定受體(IL-17受體)發(fā)揮作用,并在保護(hù)宿主免受病原體侵襲方面發(fā)揮重要作用[31]。C型凝集素是一個(gè)含有鈣離子(Ca2+)依賴性碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域(CRD)的蛋白質(zhì)家族[32]。有研究表明,細(xì)菌可以通過Toll樣受體(TLR)、NOD樣受體(NLR)和C型凝集素受體(CLR)刺激Th17反應(yīng)。當(dāng)激活時(shí),Th17淋巴細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生幾種細(xì)胞因子,主要是IL-17和趨化因子,它們進(jìn)一步吸引和激活吞噬細(xì)胞以介導(dǎo)細(xì)菌清除[33]。

分子對接結(jié)果表明,苦參核心藥效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的所有組合均能自發(fā)對接,并且結(jié)合能均<-5.0 kcal/mol。這表明了苦參藥效成分能夠通過AKT1、IL-6、TNF、IL-1β、TP53靶點(diǎn)蛋白起到抑菌作用,驗(yàn)證了上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果的可靠性。其中AKT1、TNF、TP53與苦參藥效成分結(jié)合能較其他靶點(diǎn)低,因此,AKT1、TNF、TP53可能是苦參發(fā)揮抑菌作用的主要靶點(diǎn)。為接下來將驗(yàn)證苦參是否通過這些重要靶點(diǎn)來抑制有害菌,改變腸道菌群多樣性以及提高免疫力,從而開發(fā)為飼料添加劑提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)預(yù)測和分析苦參發(fā)揮抑菌作用的核心靶點(diǎn)和通路結(jié)果表明,苦參抑菌的分子機(jī)制可能通過槲皮素、木犀草素、刺芒柄花素等調(diào)控AKT1、TNF、TP53等靶點(diǎn),參與IL-17信號通路、TNF信號通路等通路來達(dá)到,通過分子對接初步驗(yàn)證了苦參關(guān)鍵藥效成分與抑菌靶點(diǎn)的相互作用模式,為進(jìn)一步研究苦參抑菌的作用機(jī)制和將其研發(fā)為新型飼料添加劑提供一定的理論基礎(chǔ)。