噬菌體展示技術(shù)篩選羊小腸上皮細(xì)胞穿透肽

劉思佳 徐曉東 姜 寧 潘春媛 宋 軍 趙 磊 趙芳芳 李沐陽 張愛忠

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北平原農(nóng)業(yè)綠色低碳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大慶 163319)

寄生在細(xì)胞內(nèi)的致病菌被稱為胞內(nèi)菌,胞內(nèi)菌可分為兼性胞內(nèi)菌和專性胞內(nèi)菌[1]。這些胞內(nèi)病原體可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,創(chuàng)造合適的生態(tài)位,并繞過宿主免疫系統(tǒng)的殺傷[2],因此,這些病原體可導(dǎo)致動(dòng)物的腹瀉和高死亡率,是養(yǎng)羊業(yè)面臨的主要問題。隨著飼用抗生素的禁用,抗菌肽成為最有希望的替抗產(chǎn)品之一,然而治療細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是許多抗菌藥物及抗菌肽無法穿越哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜屏障,因此,需要研發(fā)新型高效的替抗產(chǎn)品來殺傷胞內(nèi)致病菌。細(xì)胞穿透肽(cell penetrating peptide,CPP)是一種載體工具,能夠以完整的功能形式攜帶各種外源分子穿過細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞內(nèi),有效地將大分子藥物、納米顆粒、抗菌肽等導(dǎo)入細(xì)胞[3],且穿透肽具有安全、無毒和靶向性的特點(diǎn)。因此,尋找進(jìn)入羊小腸上皮細(xì)胞的穿透肽作為載體,對(duì)于羊腸道胞內(nèi)菌的治療有重要的意義。

利用噬菌體展示技術(shù)篩選細(xì)胞穿透肽,可作為一種穿透載體,使其偶聯(lián)抗菌肽等抗菌藥物以穿透細(xì)胞膜,實(shí)現(xiàn)靶向、精準(zhǔn)殺傷胞內(nèi)致病菌的作用[4]。1985年,Smith[5]首次提出了噬菌體展示技術(shù),是選擇抗體和細(xì)胞結(jié)合肽最常用的方法。噬菌體展示技術(shù)允許不同的肽庫在噬菌體顆粒表面表達(dá),并能選擇與靶標(biāo)特異性結(jié)合的肽,通過對(duì)噬菌體陽性克隆不斷篩選可以確定靶標(biāo)特異性肽,進(jìn)而通過從噬菌體肽庫中富集與靶標(biāo)特異性結(jié)合的肽或蛋白質(zhì),進(jìn)一步得到特異性靶向多肽序列[6]。近幾年,噬菌體展示肽庫在細(xì)胞上的生物淘洗已被證實(shí)可以成功地用于篩選特異性穿透肽[7]。Pandya等[8]以腦腫瘤細(xì)胞為靶細(xì)胞利用噬菌體展示七肽庫篩選,得到了能夠穿過血腦腫瘤屏障,識(shí)別并作用到腫瘤細(xì)胞,可以與腦腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽,可以檢測(cè)和靶向治療腦腫瘤。Wada等[9]利用噬菌體七肽庫篩選前列腺癌細(xì)胞,得到特異性穿透肽LN1,通過與治療多肽的偶聯(lián),可以促進(jìn)治療藥物的靶向前列腺癌細(xì)胞,同時(shí)避免正常組織中的不良反應(yīng)。目前,以噬菌體展示技術(shù)篩選細(xì)胞穿透肽多用在人的疾病治療研究上,而在畜牧業(yè)中的研究鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)旨在以羊小腸上皮細(xì)胞為靶細(xì)胞,利用噬菌體展示技術(shù)篩選出可以特異性穿透羊小腸上皮細(xì)胞的穿透肽,以此作為胞內(nèi)菌抗菌藥物的載體,為致病性胞內(nèi)菌的防治提供新的方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

噬菌體展示七肽庫試劑盒購買于NEW ENGLAND BIOLABS公司,包括:10次獨(dú)立淘選試驗(yàn)的足量肽庫和大腸桿菌(E.coli)ER2738(用于M13噬菌體繁殖)。

羊小腸上皮細(xì)胞(SJECs)參考張博夫[10]的方法培養(yǎng)和提取。豬小腸上皮細(xì)胞系(IPEC-J2)為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物生化實(shí)驗(yàn)室保存。鼠小腸上皮細(xì)胞系(Modek)為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室保存。動(dòng)物小腸均選自空腸段。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將羊小腸上皮細(xì)胞、豬小腸上皮細(xì)胞系和鼠小腸上皮細(xì)胞系分別在含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM-F12或DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。所有細(xì)胞系均在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 體外減數(shù)生物淘洗篩選羊小腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞穿透肽

生長(zhǎng)良好的羊小腸上皮細(xì)胞在貼壁生長(zhǎng)成單層后,在含有1% BSA的DMEM-F12中培養(yǎng)1 h后進(jìn)行淘洗。隨機(jī)展示七肽的噬菌體文庫體外減數(shù)篩選羊小腸上皮細(xì)胞,將2×1011PFU(斑塊單位)的噬菌體文庫加入到羊小腸上皮細(xì)胞中,在室溫下微搖孵育1 h。孵育后,將未與羊小腸上皮細(xì)胞結(jié)合的噬菌體收集做未結(jié)合的陰性對(duì)照組。1 mL洗脫液(0.2 mol/L Glycine-HCl,pH 2.2)洗脫孵育后的羊小腸上皮細(xì)胞,在室溫下微搖孵育10 min,洗脫掉未結(jié)和的噬菌體,在洗脫結(jié)束時(shí)加入中和緩沖液(1 mol/L Tris-HCl,pH 9.2)。

使用E.coliER2738將洗脫得到的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增、純化和滴定,使用1×1011PFU噬菌體進(jìn)行下一輪生物淘洗。經(jīng)過第4輪生物淘洗后,從長(zhǎng)滿噬菌斑(不足100個(gè))的平板上隨機(jī)挑選出噬菌體克隆30個(gè),通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)與羊小腸上皮細(xì)胞的親和力。

1.2.3 噬菌體滴度測(cè)定

將上述洗脫液取10 μL加入20 mLE.coli中,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[吸光度(OD)=0.6]。10 000 r/min離心10 min。取上清液,同等條件再次離心。80%上清液轉(zhuǎn)移至新試管中,加入1/6體積的聚乙二醇/氯化鈉溶液(PEG/NaCl)后4 ℃下過夜沉淀。第2天,10 000 r/min離心15 min,棄上清,10 000 r/min離心5 min,棄上清,使用1 mL的三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)重懸沉淀。12 000 r/min離心10 min,取80%上清液放入新試管中,第2次沉淀加入1/6體積的PEG/NaCl,冰上孵育1 h。在12 000 r/min下離心10 min,回收噬菌體,棄上清,12 000 r/min離心5 min。200 μL TBS溶解沉淀,用于下一步的體外篩選。稀釋噬菌體(107～1011倍體積稀釋擴(kuò)增的噬菌體上清液,101～104倍體積稀釋非擴(kuò)增的洗脫液)。取噬菌體稀釋液的10 μL加入到200 μLE.coli中,混合均勻并在室溫下放置3 min。混合后的噬菌體倒在肉湯培養(yǎng)基/異丙基-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖甘(LB/IPTG/X-GAL)平板。在37 ℃下孵育過夜,通過計(jì)算培養(yǎng)板上PFU數(shù)量來計(jì)算滴度,計(jì)算公式如下:

滴度=PFU數(shù)量×稀釋倍數(shù)。

通過計(jì)算每輪洗脫噬菌體數(shù)量的滴度,計(jì)算噬菌體回收率,計(jì)算公式如下:

噬菌體回收率=洗脫噬菌體數(shù)量/

投入噬菌體數(shù)量。

1.2.4 ELISA鑒定陽性噬菌體克隆的親和力

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌以1∶100的比例混勻在LB培養(yǎng)基中。將第4輪LB/IPTG/X-GAL平板上的噬菌斑隨機(jī)挑選30個(gè)加入到LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,10 000 r/min離心10 min,取上清,4 ℃貯存?zhèn)溆?。羊小腸上皮細(xì)胞接種于96孔板(2×104個(gè)細(xì)胞/孔),待細(xì)胞長(zhǎng)滿后,清洗細(xì)胞,0.25%戊二醛溶液固定細(xì)胞15 min,加入3%過氧化氫溶液(100 μL/孔),培養(yǎng)30 min,清洗細(xì)胞,1% BSA封閉60 min,加入1×1010PFU單克隆噬菌體擴(kuò)增液孵育1.5 h,清洗細(xì)胞,空白對(duì)照:磷酸鹽緩沖液(PBS),陰性對(duì)照:第1輪未結(jié)合的噬菌體,1∶5 000稀釋的M13 antibody (HRP)抗體(HRP/Anti-M13抗體)(100 μL/孔),孵育1 h,清洗細(xì)胞,加入TMB顯色液10～30 min,全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的OD值。

S為將擴(kuò)增噬菌體與羊小腸上皮細(xì)胞共孵育的OD值,P為未結(jié)合噬菌體與羊小腸上皮細(xì)胞共孵育的OD值,親和力計(jì)算公式如下:

S/P=相應(yīng)的OD值-PBS空白對(duì)照的OD值。

經(jīng)全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)親和力≥2為陽性克隆。

1.2.5 測(cè)序及多肽合成

按M13噬菌體單鏈基因組DNA提取試劑盒的說明提取高親和力的陽性克隆的DNA,將DNA提取液送到江蘇艾伯森生物技術(shù)有限公司進(jìn)行核苷酸測(cè)序。選取重復(fù)次數(shù)多的序列,由上海吉爾生化(上海)有限公司合成帶有FITC標(biāo)簽的細(xì)胞穿透肽及與細(xì)胞穿透肽的氨基酸序列結(jié)構(gòu)相同但順序不同的多肽做對(duì)照多肽。

1.2.6 多肽對(duì)細(xì)胞活力的影響

在長(zhǎng)滿羊小腸上皮細(xì)胞的96孔板,加入100 μL不同終濃度(256、128、64、32、16 μmol/mL)的多肽,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,棄上清,清洗細(xì)胞。取10 μL CCK8溶液加入細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)1～3 h,全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的OD值。陰性對(duì)照組:只有細(xì)胞沒有多肽;空白對(duì)照組:沒有細(xì)胞和多肽,細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下:

細(xì)胞存活率(%)=100×[OD(試驗(yàn)組)值-
OD(空白對(duì)照組)值]/[OD(陰性對(duì)照組)值-
OD(空白對(duì)照組)值]。

1.2.7 熒光顯微鏡觀察多肽的細(xì)胞特異性穿透能力

將羊小腸上皮細(xì)胞、豬小腸上皮細(xì)胞、鼠小腸上皮細(xì)胞的濃度經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法調(diào)整至1×105個(gè)細(xì)胞/mL分別加入培養(yǎng)皿中,37 ℃過夜培養(yǎng)。將含有FITC標(biāo)簽的多肽(16 μmol/mL)與細(xì)胞共孵育2 h,清洗細(xì)胞。使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min后,清洗細(xì)胞,加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料(染色細(xì)胞核),染色5 min,清洗細(xì)胞,再加入1,1′-二十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基氨基氰高氯酸鹽(DiL)染料(染色細(xì)胞膜),染色10 min,清洗細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察多肽的穿透能力。

1.2.8 激光共聚焦顯微鏡確定多肽的細(xì)胞內(nèi)定位

將羊小腸上皮細(xì)胞接種于激光共聚焦皿(1×105個(gè)細(xì)胞/孔),培養(yǎng)過夜,在細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好后,無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h。然后更換含有FITC標(biāo)簽的多肽濃度為16 μmol/mL,孵育2 h,清洗細(xì)胞,使用4%多聚甲醛固定羊小腸上皮細(xì)胞15 min后,清洗細(xì)胞,加入DAPI染料(染色細(xì)胞核),染色5 min,清洗細(xì)胞,再加入DiL染料(染色細(xì)胞膜),染色10 min,清洗細(xì)胞,激光共聚焦顯微鏡下觀察多肽的細(xì)胞內(nèi)定位。

1.2.9 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞穿透肽的穿膜效率

將羊小腸上皮細(xì)胞接種于6孔板(1×105個(gè)細(xì)胞/孔),細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí),更換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h。試驗(yàn)組加入終濃度為32、16 μmol/mL的細(xì)胞穿透肽(SCPPP1、SCPP2),繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2、12 h,對(duì)照組加入無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)。棄上清,清洗細(xì)胞。在6孔板中加入適量的胰蛋白酶,室溫消化10 min,直至肉眼觀察到細(xì)胞完全脫落,PBS將細(xì)胞全部吹起并收集至15 mL離心管中。3 000 r/min離心3 min,棄上清,加300 μL PBS制成細(xì)胞懸液,上流式細(xì)胞儀器檢測(cè)羊小腸上皮細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,通過SPSS 26.0軟件進(jìn)行方差分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,并用GraphPad Prism 8.0.2軟件做出相應(yīng)的柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊小腸上皮細(xì)胞特異性結(jié)合噬菌體的富集

本研究以羊小腸上皮細(xì)胞為靶細(xì)胞,通過噬菌體肽庫與羊小腸上皮細(xì)胞的4輪體外減數(shù)生物淘洗,鑒定出與羊小腸上皮細(xì)胞特異結(jié)合的噬菌體。從結(jié)果可以看出,噬菌體回收率在篩選過程中逐漸增加,與1輪相比,在最后1輪中增加約226倍(表1),表明噬菌體得到了有效的富集。

2.2 ELISA檢測(cè)羊小腸上皮細(xì)胞與陽性噬菌體克隆親和力

從最后1輪篩選后隨機(jī)選取30個(gè)噬菌斑進(jìn)行親和力檢測(cè),經(jīng)ELISA鑒定親和力≥2的有21個(gè)(圖1),可作為陽性克隆噬菌體用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1 每輪減數(shù)篩選噬菌體的回收率

圖1 ELISA檢測(cè)羊小腸上皮細(xì)胞與單克隆噬菌體親和力

2.3 陽性單克隆噬菌體DNA測(cè)序及多肽的合成

將上述21個(gè)高親和力的陽性單克隆噬菌體進(jìn)行單鏈提取并進(jìn)行測(cè)序,根據(jù)序列結(jié)果發(fā)現(xiàn),VLNSLID和HSTTAQF序列出現(xiàn)頻次最高,均為3次,SDYQTRY序列出現(xiàn)2次,其余序列出現(xiàn)1次,將出現(xiàn)頻率最高的2個(gè)序列分別命名為SCPP1和SCPP2,說明這2個(gè)序列可能與羊小腸上皮細(xì)胞特異性結(jié)合有密切的關(guān)系。

進(jìn)一步合成含有FITC標(biāo)簽的SCPP1與SCPP2,同時(shí)按照與SCPP1和SCPP2的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)相同,但組合順序不同的多肽的原則,合成含有FITC標(biāo)簽的對(duì)照多肽svSCPP1和svSCPP2用于后續(xù)驗(yàn)證。

2.4 CCK8法檢測(cè)多肽對(duì)羊小腸上皮細(xì)胞的毒性

SCPP1、SCPP2、svSCPP1、svSCPP2的羊小腸上皮細(xì)胞毒性如圖2所示,從圖中可以看出,在多肽濃度為64 μmol/mL時(shí),SCPP2組的細(xì)胞存活率顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05),SCPP1、svSCPP1,svSCPP2組的細(xì)胞存活率極顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01),但細(xì)胞存活率仍在95%以上,未達(dá)到存在細(xì)胞毒性程度;在多肽濃度為128 μmol/mL以下,4個(gè)多肽組的細(xì)胞存活率均極顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01),但細(xì)胞存活率仍在90%以上;在多肽濃度為256 μmol/mL以下,4組的細(xì)胞存活率差異極顯著(P<0.01),SCPP1、svSCPP2組的細(xì)胞存活率低于90%,表現(xiàn)出具有細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示,在多肽濃度低于256 μmol/mL時(shí),4條多肽的細(xì)胞存活率均在90%以上,說明多肽對(duì)細(xì)胞的毒性很小,表明該多肽安全無毒。

*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.5 熒光顯微鏡觀察多肽的特異性穿透

為了直接觀察穿透肽對(duì)羊小腸上皮細(xì)胞的特異性,在熒光顯微鏡下觀察多肽在羊、鼠、豬小腸上皮細(xì)胞的穿透情況。由圖3-A可以看出,SCPP1、SCPP2可以穿透羊小腸上皮細(xì)胞,而對(duì)照多肽不可以穿透羊小腸上皮細(xì)胞,且SCPP1的穿透能力明顯高于SCPP2。圖3-B、圖3-C可以看出,SCPP1、SCPP2、svSCPP1、svSCPP2均不能穿透鼠小腸上皮細(xì)胞和豬小腸上皮細(xì)胞。這表明經(jīng)過噬菌體展示技術(shù)篩選出的2條多肽SCPP1、SCPP2具有穿透性和特異性,且只能特異性穿透羊小腸上皮細(xì)胞。

2.6 激光共聚焦顯微鏡確定穿透肽的細(xì)胞內(nèi)定位

細(xì)胞穿透肽的羊小腸原代上皮細(xì)胞內(nèi)定位如圖4所示,從圖中可以看出,SCPP2主要聚集在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),所以這種多肽在細(xì)胞內(nèi)定位在細(xì)胞質(zhì),而SCPP1在細(xì)胞核處發(fā)生了明顯的聚集,所以這種多肽在細(xì)胞內(nèi)還可定位在細(xì)胞核,結(jié)果表明2種多肽均可以穿透細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞。

2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)穿透肽在羊小腸上皮細(xì)胞內(nèi)熒光含量

穿透肽在羊小腸原代上皮細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度如圖5所示,可以看出,在相同的時(shí)間和濃度條件下,SCPP1的胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度明顯高于SCPP2,且胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度受時(shí)間和濃度的影響,隨著時(shí)間和濃度的增加其胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度也增加,呈時(shí)間劑量依賴性。結(jié)果表明,SCPP1、SCPP2均可穿透羊小腸上皮細(xì)胞,且SCPP1的穿透能力更強(qiáng)。

3 討 論

噬菌體展示技術(shù)是一種通過對(duì)噬菌體DNA進(jìn)行基因改造,從而在噬菌體表面展示的分子技術(shù),其包含的遺傳序列可將表型與基因型相連[11]。噬菌體展示技術(shù)通過與噬菌體外殼蛋白融合,在噬菌體表面展示多種多樣的肽或蛋白質(zhì)文庫,與衣殼蛋白融合的配體將整合到成熟的噬菌體外殼中,并展示在噬菌體表面,而編碼的遺傳物質(zhì)存在于噬菌體內(nèi),因其可在絲狀噬菌體表面呈遞大量肽和蛋白質(zhì)文庫,所以對(duì)于幾乎任何靶標(biāo)都具有高親和力和特異性。通過豐富高親和力的特異性結(jié)合克隆,可得到高親和力配體,并通過DNA測(cè)序鑒定其編碼序列[12],是一種可系統(tǒng)性篩選鑒定與靶標(biāo)高親和力多肽或蛋白質(zhì)的高效工具。通過對(duì)噬菌體文庫的篩選,與靶標(biāo)具有高親合力的噬菌體從噬菌體文庫中分離,通過對(duì)陽性噬菌體的外源基因序列進(jìn)行分析,獲得與靶標(biāo)特異性結(jié)合的肽[13]。通過噬菌體展示技術(shù)篩選得到的多肽,具有較高的細(xì)胞膜穿透性,具有較低的免疫原性。因此其既可用于腫瘤的早期診斷[14],也可通過連接藥物在不損傷其他正常細(xì)胞的情況下實(shí)現(xiàn)靶向治療[15]。

FITC: 異硫氰酸熒光素 fluorescein isothiocyanate;DiL: 1,1’-雙十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚菁高氯酸鹽 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocyanine perchlorate;DAPI: 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚 4’, 6-diaminyl-2-phenylindole;Merge:合并。圖4同 the same as Fig.4。

2018年,Sahin等[16]以胃癌細(xì)胞為靶細(xì)胞利用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行篩選,得到線性多肽DE532,體外試驗(yàn)證實(shí)DE532不僅具有穿膜功能,而且特異性靶向人胃癌細(xì)胞,不與正常的人胃上皮細(xì)胞結(jié)合,因此不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷。鄭磊[17]利用噬菌體展示肽庫的減數(shù)體外篩選法,成功篩選出了可以靶向胰腺的多肽,并利用其可以與藥物結(jié)合的特性,得到了可以診斷治療胰腺癌的多肽。

圖4 穿透肽在細(xì)胞內(nèi)的定位

圖5 穿透肽的胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度檢測(cè)

這些研究為尋找新的羊小腸上皮細(xì)胞穿透肽打下了基礎(chǔ),本試驗(yàn)以羊小腸上皮細(xì)胞為靶細(xì)胞,利用噬菌體展示技術(shù)4輪體外減數(shù)篩選,得到了與羊小腸上皮細(xì)胞特異性結(jié)合的噬菌體,在含有不到100個(gè)噬菌斑的噬菌體平板中隨機(jī)挑選30株進(jìn)行陽性克隆檢測(cè),通過ELISA及DNA測(cè)序分析初步鑒定有2種噬菌體序列出現(xiàn)頻率最高:VLNSLID(SCPP1)和HSTTAQF(SCPP2)。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)多肽安全無毒性,對(duì)羊小腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)無顯著影響,熒光顯微鏡結(jié)果表明,對(duì)照多肽不能穿透羊小腸上皮細(xì)胞,SCPP1和SCPP2可以穿透羊小腸上皮細(xì)胞,但不能穿透豬小腸上皮細(xì)胞及鼠小腸上皮細(xì)胞,結(jié)果證明篩選出的多肽具有特異穿透性。這是因?yàn)樵诤Y選過程中淘汰了沒有與靶分子或者靶細(xì)胞結(jié)合的噬菌體、結(jié)合力弱的噬菌體和沒有特異性結(jié)合的噬菌體,只留下那些與靶分子或者靶細(xì)胞特異性結(jié)合的噬菌體。隨著篩選次數(shù)的增加和固定時(shí)間的減少,獲得的數(shù)量也在增加,最終達(dá)到飽和。因此,在篩選后,回收量的顯著增加表明存在與目標(biāo)細(xì)胞特異性結(jié)合的噬菌體[17]。如果在篩選過程中沒有特異性的噬菌體與羊小腸上皮細(xì)胞結(jié)合,則不會(huì)觀察到噬菌體回收量的明顯增加。激光共聚焦結(jié)果表明,SCPP1和SCPP2可以穿透羊小腸上皮細(xì)胞膜,且SCPP1的一部分可以穿透細(xì)胞核表現(xiàn)出比SCPP2更強(qiáng)的穿透性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示,穿透肽SCPP1的胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度明顯高于SCPP2,且隨著時(shí)間和濃度的增加其胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度也增加。其原因可能是因?yàn)镾CPP1序列中含有比SCPP2更多的疏水性氨基酸,疏水性氨基酸可以通過提高穿透肽的內(nèi)化效率進(jìn)一步提高穿透肽的穿透能力[18]。試驗(yàn)結(jié)果表明,SCPP1多肽對(duì)羊小腸上皮細(xì)胞具有穿透性,在羊小腸上皮細(xì)胞中能夠明顯富集。使用NCBI-BLAST網(wǎng)站,分析氨基酸序列,結(jié)果顯示,VLNSLID是以前未報(bào)道的序列。

目前,我們只驗(yàn)證了VLNSLID多肽對(duì)羊小腸上皮細(xì)胞的靶向性和特異性,尚需在體外、體內(nèi)用多種方法進(jìn)一步研究其偶聯(lián)抗菌肽后的生物特性及穿透性。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建2條能夠穿過羊小腸上皮細(xì)胞的穿透肽序列VLNSLID(SCPP1)和HSTTAQF(SCPP2),其中SCPP1具有穿透細(xì)胞核的效果,其穿透作用更強(qiáng)且穿透肽在濃度低于256 μmol/mL時(shí)安全無毒,可作為穿過羊小腸上皮細(xì)胞治療胞內(nèi)致病菌的抗菌肽遞送系統(tǒng)的有用載體。