蝦青素對IPEC-J2細胞抗氧化、抗炎和抗凋亡能力的影響

張 晶 田 樂 趙 云 房恒通 付玉蓉 王傳奇

(吉林大學動物科學學院,吉林省東北寒區(qū)畜禽飼料與飼養(yǎng)重點實驗室,長春 130062)

蝦青素(AST)作為一種天然的抗氧化劑,因其優(yōu)質(zhì)的生理功能在許多領域中得到應用[1]。AST作為飼料添加劑可以使動物獲得足夠且均衡的營養(yǎng)元素以提高動物的抗病力,還用作著色劑使皮膚和肌肉顯現(xiàn)出健康且鮮艷的顏色[2]。腸道參與體內(nèi)的營養(yǎng)攝取和免疫調(diào)節(jié)等生理過程,然而腸上皮的穩(wěn)態(tài)和屏障功能很容易受到一些刺激而被破壞,從而影響生物體的健康狀態(tài)[3]。研究顯示,在鱸魚基礎飼料中添加不同水平(50、100和150 mg/kg)的AST提高了鱸魚血清總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低了丙二醛(MDA)含量,從而改善鱸魚的生長性能、抗氧化功能和免疫功能[4]。研究表明,飼料中添加AST可提高肉雞的飼料轉(zhuǎn)化率、總增重和最終體重,并且通過增加血清SOD活性和還原型谷胱甘肽(GSH)含量提高肉雞的抗氧化水平,同時AST對禽肉和禽蛋品質(zhì)的提升也有積極的影響[5]。此外,用含0、25、50和100 mg/kg AST的玉米-豆粕型基礎飼糧飼喂老齡種公雞,與對照組相比,AST組精液質(zhì)量顯著提高,且抗氧化能力隨著AST添加量的增多而逐漸增強[6]。在用玻璃化冷凍方法保存未成熟的豬卵母細胞中添加AST,可以顯著提高玻璃化卵母細胞的存活能力,增強線粒體功能,減輕氧化應激,改善玻璃化豬卵母細胞發(fā)育能力[7]。許建春等[8]的研究也得出了相似的結(jié)果,其研究顯示在豬卵母細胞的體外成熟液中添加適量AST可促進第一極體的排出率,并且改善了卵裂率和囊胚發(fā)育率,提高了MⅡ期卵母細胞抗氧化能力,促進了卵母細胞的發(fā)育。但目前關于AST對豬腸道影響的研究較少,尚不明確AST對豬腸道是否具有保護作用。因此,本研究旨在探究AST對IPEC-J2細胞抗氧化、抗炎和抗凋亡能力的影響,為AST保護豬腸道健康和在生豬養(yǎng)殖中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

AST(HPLC≥98%)購買自上海源葉生物科技有限公司,SOD試劑盒由南京建成生物工程研究所提供,RNA提取試劑(TRIZOL)來源于天根公司,反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR試劑盒購于ABM公司,Anti-Nrf2 antibody購于Abcam艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司,Anti-HO-1 antibody、Anti-Bax antibody、Anti-Bcl-2 antibody和Anti-GAPDH antibody購于武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

試驗所使用的IPEC-J2細胞由吉林大學動物科學學院動物營養(yǎng)與飼料科學專業(yè)細胞實驗室保存并進行培養(yǎng)。DMEM/F12培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清(FBS),1%雙抗溶液(100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素),配制成細胞完全生長培養(yǎng)液,將細胞放入完全培養(yǎng)液中,并置于37 ℃、二氧化碳(CO2)體積分數(shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待細胞生長至80%左右時,用胰酶消化傳代。

基于本課題組前期研究得出的5、10、20、40、80和100 μmol/L AST對IPEC-J2細胞活力無顯著影響[9],因此本試驗沿用AST的上述濃度進行試驗。將AST用二甲基亞砜(DMSO)充分溶解成濃度為100 mmol/L的AST母液進行儲存。用DMEM/F12細胞完全生長培養(yǎng)液稀釋AST母液,配制成濃度分別為5、10、20、40、80和100 μmol/L的AST工作液用于后續(xù)細胞處理,終溶液中DMSO的最終濃度不超過0.1%。

根據(jù)不同的試驗目的,將細胞移入6孔細胞板中用不同濃度的AST工作液繼續(xù)培養(yǎng),試驗分為7組,培養(yǎng)液中AST濃度分別為0(對照組,未添加AST)、5、10、20、40、80和100 μmol/L。

1.3 SOD活性檢測

不同濃度的AST工作液處理細胞24 h后,收集上清到離心管中,3 500 r/min離心15 min,取上清,置冰上待測。450 nm處測定吸光度,計算細胞培養(yǎng)液中SOD活性。

1.4 實時熒光定量PCR檢測抗氧化、炎癥和凋亡相關基因以及核因子E2相關因子2(Nrf2)信號通路及其下游基因的表達

將細胞以2×105個/mL接到6孔細胞板中,使用不同濃度的AST工作液處理細胞24 h后棄掉細胞培養(yǎng)液,預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)輕柔沖洗2次,每孔加入1 mL TRIZOL裂解液,輕輕吹打,待孔內(nèi)液體清澈不黏稠、孔底干凈時,將液體移入1.5 mL離心管中,參照TRIZOL裂解液說明書提取細胞總RNA。使用微量分光光度計測定RNA質(zhì)量和濃度,使用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性后。根據(jù)cDNA說明書將1 μg RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA,得到的cDNA采用20 μL的反應體系進行實時熒光定量PCR,引物序列見表1。準備八連管,依次加入10 μL SYBR Green、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、7 μL ddH2O、2 μL cDNA,輕微振蕩混合均勻。反應條件設置成95 ℃預變性3 min,95 ℃退火15 s,60 ℃延伸1 min,循環(huán)數(shù)為40。設置甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)基因作為內(nèi)參基因,采用2-△△Ct法計算目的基因的mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)檢測凋亡相關蛋白B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)和Nrf2信號通路標志性蛋白Nrf2、血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達

細胞經(jīng)AST(80 μmol/L)培養(yǎng)24 h后,棄掉培養(yǎng)液,PBS沖洗2遍,向每孔加入RIPA蛋白裂解液200 μL(含有PMSF蛋白酶抑制劑),4 ℃靜置15 min后,14 000×g離心15 min,吸取上清液到全新離心管中,并按照BCA法測定樣品蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)變性結(jié)束后,使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)配制分離膠和濃縮膠。在每個上樣孔中加入20 μg的總蛋白和5 μL的預染彩虹蛋白Marker,80 V下電泳約40 min,隨后將電壓調(diào)節(jié)至120 V,當溴酚藍條帶跑到凝膠底部時電泳結(jié)束。電泳后,取出預制膠,將轉(zhuǎn)膜濾紙和聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)平鋪在半干式轉(zhuǎn)移電泳槽上,從下至上順序依次是3張濾紙、PVDF膜、凝膠和3張濾紙,接通電源,200～300 mA恒流轉(zhuǎn)膜24 min左右。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,將PVDF膜放在用TBST制備的5%的脫脂奶粉溶液中,在搖床上室溫封閉1 h。配制一抗工作液,裁剪PVDF膜上所需的目的蛋白Nrf2、HO-1、Bax、Bcl-2和內(nèi)參蛋白GAPDH,4 ℃孵育過夜。棄去一抗工作液,用TBST洗滌。用5%的脫脂奶粉溶液和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)制備二抗工作液。在振蕩器上室溫孵育2 h。棄去二抗工作液,用TBST沖洗。配制ECL混合液,將PVDF膜置于化學發(fā)光成像分析儀中,滴加ECL混合液,曝光顯影,保存曝光后的圖片,并使用ImageJ v1.8軟件進行蛋白質(zhì)條帶的灰度值分析,然后進行統(tǒng)計分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用ImageJ v1.8軟件對熒光照片進行熒光強度分析,使用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,使用GraphPad Prism 8.0軟件制圖。所有試驗至少重復3次。對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA),并采用LSD法進行多重比較,并表示為平均值±標準誤。當P>0.05時,判定差異不顯著;當P<0.05時,判定差異顯著;當P<0.01時,判定差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 AST對IPEC-J2細胞抗氧化能力的影響

圖1-A顯示,與對照組相比,10～80 μmol/L的AST可以極顯著提高細胞中SOD的活性(P<0.01),而5和100 μmol/L的AST對細胞中SOD活性無顯著影響(P>0.05)。圖1-B顯示,與對照組相比,10～100 μmol/L AST可以顯著或極顯著提高細胞中總超氧化物歧化酶(T-SOD)的mRNA相對表達量(P<0.05或P<0.01)。圖1-C顯示,與對照組相比,40～100 μmol/L AST可以顯著或極顯著提高細胞中過氧化氫酶(CAT)的mRNA相對表達量(P<0.05或P<0.01)),并且在AST為40 μmol/L時提升效果最好?？傮w來說,IPEC-J2細胞的抗氧化能力隨著AST濃度的增加先提升后有所降低。

2.2 AST對IPEC-J2細胞抗炎能力的影響

圖2-A顯示,與對照組相比,5～100 μmol/L的AST對細胞中核轉(zhuǎn)錄因子-κB p50(NF-κBp50)的mRNA相對表達量無顯著影響(P>0.05),但隨著AST濃度的增加而在整體上呈現(xiàn)降低趨勢。圖2-B顯示,與對照組相比,5～80 μmol/L的AST對細胞中核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(NF-κBp65)的mRNA相對表達量無顯著影響(P>0.05),但100 μmol/L的AST極顯著降低細胞中NF-κBp65的mRNA相對表達量(P<0.01)。相較于對照組,細胞中其他炎癥因子包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、髓樣分化因子88(MyD88)和白細胞介素-1β(IL-1β)的mRNA相對表達量在AST濃度達到10 μmol/L后即開始出現(xiàn)顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)(圖2-C、圖2-D、圖2-E),說明一定濃度的AST可以提高IPEC-J2細胞的抗炎能力。

2.3 AST對IPEC-J2細胞抗凋亡能力的影響

圖3-A、圖3-B、圖3-C顯示,與對照組相比,40～100 μmol/L的AST顯著或極顯著降低了細胞中促凋亡基因Bax的mRNA相對表達量(P<0.05或P<0.01),80～100 μmol/L的AST極顯著增加了細胞中抗凋亡基因Bcl-2的mRNA相對表達量(P<0.01),并且20～100 μmol/L的AST促使Bax/Bcl-2基因比值顯著或極顯著下降(P<0.05或P<0.01),且在AST濃度為80 μmol/L時Bax/Bcl-2基因比值最低。圖3-D、圖3-E顯示,與對照組相比,細胞中半胱天冬蛋白酶-9(Caspase-9)的mRNA相對表達量隨著AST濃度的增加而下降,并且在AST濃度達到20 μmol/L后即開始顯著或極顯著下降(P<0.05或P<0.01);半胱天冬蛋白酶-3(Caspase-3)的mRNA相對表達量隨著AST濃度的增加雖然沒有顯著差異(P>0.05),但也表現(xiàn)出了一定的下降趨勢。綜合來看,80 μmol/L的AST對IPEC-J2細胞的抗凋亡效果提升較好,且作用比較穩(wěn)定。通過Western Blot驗證了AST(80μmol/L)對抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的蛋白相對表達量的影響,結(jié)果(圖3-F)顯示,80 μmol/L的AST極顯著降低了細胞中Bax的蛋白相對表達量和Bax/Bcl-2蛋白比值(P<0.01)。上述結(jié)果說明AST有助于IPEC-J2細胞抗凋亡能力的提升。

“*”表示與對照組相比差異顯著(P<0.05),“**”表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.4 AST對IPEC-J2細胞Nrf2信號通路的影響

圖4-A顯示,隨著AST濃度的增加,細胞中Nrf2的mRNA相對表達量逐漸升高,在AST濃度為100 μmol/L時與對照組相比表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)。圖4-B顯示,與對照組相比,5～80 μmol/L的AST對細胞中柯爾奇樣ECH相關蛋白1(Keap1)的mRNA相對表達量無顯著影響(P>0.05)。在經(jīng)不同濃度AST處理后,細胞中Nrf2信號通路下游基因HO-1、NADPH:醌氧化還原酶1(NQO1)、熱應激蛋白70(HSP70)和超氧化物歧化酶2(SOD2)的mRNA相對表達量表現(xiàn)出一致的上升趨勢。與對照組相比,10～100 μmol/L的AST顯著或極顯著升高細胞中HO-1的mRNA相對表達量(P<0.05或P<0.01,圖4-C);20、80和100 μmol/L的AST顯著或極顯著提升細胞中NQO1和HSP70的mRNA相對表達量(P<0.05或P<0.01,圖4-D和圖4-E);20和80 μmol/L的AST顯著或極顯著提升細胞中SOD2的mRNA相對表達量(P<0.05或P<0.01,圖4-F)。通過Western Blot驗證了AST(80 μmol/L)對Nrf2信號通路上的標志性蛋白Nrf2和HO-1的蛋白相對表達量的影響,結(jié)果(圖4-G)顯示,80 μmol/L的AST顯著提升了細胞中Nrf2和HO-1的蛋白相對表達量(P<0.05),這表明AST成功激活了IPEC-J2細胞內(nèi)的Nrf2信號通路。

圖2 AST對IPEC-J2細胞抗炎能力的影響

3 討 論

長期過度氧化應激是引發(fā)胃腸道疾病的主要危險因素,AST通過多種機制表現(xiàn)出對胃腸道疾病的保護作用。AST具有強效抗氧化和抗炎活性,其位于細胞膜的內(nèi)部和表面,能夠直接中和活性氧(ROS)和脂質(zhì)過氧化物,增強抗氧化酶的活性,并抑制促炎轉(zhuǎn)錄因子和細胞因子的產(chǎn)生[10]?；贏ST的多種優(yōu)質(zhì)生理功能,目前已經(jīng)作為飼料添加劑被廣泛應用。據(jù)報道,AST能夠改善虹鱒魚腸道健康,增加腸道絨毛長度,有助于提高虹鱒魚對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用,從而促進虹鱒魚更好的生長[11]。紅法夫酵母富含AST,是天然AST的主要來源之一,將不同水平的紅發(fā)夫酵母(0、0.1%和0.2%)添加到以玉米、豆粕作為基礎的育肥豬飼糧中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅發(fā)夫酵母提高了育肥豬的干物質(zhì)消化率、白細胞數(shù),并使肉質(zhì)得到改善[12]。Karimian等[13]用AST(1～100 μmol/L)處理非腫瘤性乳腺細胞系MCF 10A后,對細胞活力的影響很小。此外,朱凌羽等[14]采用MTT法測定了不同濃度AST(10～200 μmol/L)處理IPEC-J2細胞1、3和6 h后的細胞活力,結(jié)果顯示,隨著AST濃度的增加,細胞活力呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,相同濃度下按處理時間比較細胞活力的順序是3 h>6 h>1 h,但與對照組相比,AST對細胞活力的影響無消極作用。SOD和CAT是內(nèi)源性酶抗氧化劑,可以抵抗氧化應激的過度產(chǎn)生,起到保護細胞的作用。研究顯示,給小鼠補充SOD可以減少脂質(zhì)過氧化,防止氧化應激誘導的神經(jīng)細胞認知能力下降[15]。本試驗結(jié)果顯示,AST可以在一定程度上提高IPEC-J2細胞的抗氧化能力,在濃度達到10 μmol/L后即可顯著提高細胞中SOD活性并提高T-SOD的mRNA相對表達量;與對照組相比,細胞中CAT的mRNA相對表達量在AST濃度達到40 μmol/L后得到顯著改善。與本研究結(jié)果相似,Yin等[16]的研究結(jié)果顯示,AST能夠抑制脂多糖(LPS)誘導的樹突狀細胞(DC)抗氧化能力下降,減少一氧化氮(NO)和ROS的產(chǎn)生;此外,GSH-Px、SOD和CAT等抗氧化酶的活性被AST顯著上調(diào)。冷凍保存的胚胎容易受到氧化應激的影響,從而降低胚胎發(fā)育。有研究表明,玻璃化豬卵母細胞體外培養(yǎng)時,補充AST可以降低ROS積累量,改善GSH含量,減輕氧化應激對胚胎發(fā)育的影響[17]。

圖3 AST對IPEC-J2細胞抗凋亡能力的影響

細胞因子分為促炎細胞因子和抗炎細胞因子,促炎細胞因子[IL-1β、白細胞介素-6(IL-6)和TNF-α)]和抗炎細胞因子[白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-4(IL-4)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)]之間的不平衡是許多疾病發(fā)生的基礎[18]。AST的抗炎、抗凋亡作用也在大量研究中得到證實,阻斷核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路是AST發(fā)揮其抗炎作用的機制之一,AST通過抑制NF-κB信號通路而阻礙下游炎癥基因(IL-1β和TNF-α等)的表達[19]。AST可以有效緩解脂肪移植所面臨的壓力,脂肪移植物在受體中能否存活取決于脂肪來源的干細胞,而干細胞很容易受到氧化應激的影響而降低細胞周期蛋白和膠原蛋白的表達水平,此外,還會增加了Caspase-3、IL-6和TNF-α的表達,導致移植失敗;AST預處理則通過Nrf2途徑顯著緩解氧化應激和炎癥,促進脂肪細胞外基質(zhì)的合成[20]。在本研究中,AST降低了IPEC-J2細胞炎癥因子的基因表達。與對照組相比,AST濃度達到10 μmol/L后即可顯著降低細胞中IL-1β、TNF-α和MyD88的表達; 5～100 μmol/L的AST對細胞中NF-κBp50的mRNA相對表達量無顯著影響;隨著AST濃度的增加,NF-κB p65的表達逐漸降低,100 μmol/L的AST能顯著降低NF-κBp65的mRNA相對表達量。豬近端腎小管上皮細胞暴露于高葡萄糖會導致NF-κB核異位、炎癥蛋白表達量和Bax/Bcl-2蛋白比值增加,誘導細胞炎癥和凋亡的發(fā)生,而AST的添加則改變了這種趨勢,減輕了細胞損傷[21]。

圖4 AST對IPEC-J2細胞Nrf2信號通路的影響

當細胞受到內(nèi)部或外部信號刺激時,Bcl-2家族成員Bax和Bak在線粒體外膜上寡聚,導致線粒體膜通透性增加,細胞色素C(Cyt-C)釋放到細胞質(zhì)中,進而導致Capase-9和Capase-3的激活,觸發(fā)細胞凋亡[9]。生姜提取物能夠降低人膠質(zhì)母細胞瘤細胞(U251)的活力,誘導Cyt-C從線粒體釋放介導的細胞凋亡,增加Bax/Bcl-2蛋白比值和Capase-3活性[22]。在本研究中,與對照組相比,AST(20～100 μmol/L)顯著降低IPEC-J2細胞中Bax/Bcl-2基因比值,并在AST濃度達到20 μmol/L后開始顯著降低Capase-9的mRNA相對表達量,80 μmol/L的AST顯著降低細胞中Bax的蛋白相對表達量和Bax/Bcl-2蛋白比值,表明AST可以增強IPEC-J2細胞的抗凋亡能力。AST的抗凋亡作用在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中也有著相似的發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜具有高含量的多不飽和脂肪酸,這使視網(wǎng)膜更容易受到氧化應激的影響。氧化應激在糖尿病并發(fā)癥中起重要作用,過度的氧化應激則會誘導視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡,進而導致糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生。用過氧化氫(H2O2)誘導大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞系RGC-5,結(jié)果顯示Bcl-2的蛋白表達量顯著降低,Bcl-2家族成員促凋亡蛋白Bad和Caspase-3的蛋白表達量顯著增加,而AST的補充逆轉(zhuǎn)了上述蛋白的表達情況,這表明AST能夠保護視網(wǎng)膜細胞免受氧化應激,從而抑制細胞凋亡[23]。

據(jù)報道,Nrf2是AST發(fā)揮其抗氧化、抗炎、抗凋亡等特性的分子靶點[24]。Nrf2在維持機體氧化還原平衡方面起著至關重要的作用,一般來說,Nrf2和Keap-1是在細胞質(zhì)中結(jié)合的,一旦Keap-1被親電試劑和氧化劑(如ROS)修飾后,Keap-1就會與Nrf2解離,Nrf2轉(zhuǎn)移到核內(nèi),與抗氧化響應元件(ARE)結(jié)合,并激活下游抗氧化因子(HO-1、NQO1和SOD等)以消除ROS等[25]。AST通過Nrf2/HO-1信號通路保護LPS誘導的樹突狀細胞和小鼠的損傷,減少NO和ROS的產(chǎn)生,增加抗氧化酶GSH-Px和SOD的活性,在抑制氧化應激中起重要作用[15]。AST通過Nrf2信號通路調(diào)節(jié)炎癥的發(fā)生,用阿霉素誘導小鼠局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)模型,FSGS模型屬于慢性腎損傷的一種類型,與FSGS模型小鼠接受鹽水治療組相比,暴露于AST的FSGS模型小鼠在腎功能參數(shù)以及腎小球和間質(zhì)纖維化方面表現(xiàn)出顯著改善,AST通過抑制NOD樣受體熱蛋白結(jié)構域相關蛋白3(NLRP3)炎癥小體活化,減少IL-1β分泌以及上調(diào)Nrf2表達來預防阿霉素誘導的慢性腎損傷,這表明AST通過活化Nrf2保護腎臟免受炎癥損傷[26]。研究證實,AST能夠通過Nrf2信號通路發(fā)揮抗凋亡作用,赭曲霉毒素A(OTA)誘導小鼠心率降低,降低組織中SOD、CAT活性和GSH含量,同時增加乳酸脫氫酶(LDH)活性和MDA含量,且AST改善了小鼠的心率和抗氧化水平;此外,OTA上調(diào)Keap1、Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表達,同時下調(diào)Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白表達,表明OTA可誘導心肌細胞線粒體凋亡,抑制Nrf2信號通路,而AST改變上述蛋白的表達情況,激活Nrf2信號通路,增強心肌抗凋亡能力,從而發(fā)揮對心肌的保護作用[27]。在本研究中,IPEC-J2細胞中Nrf2的mRNA相對表達量隨AST濃度的增加而升高,并且100 μmol/L的AST能夠顯著提升細胞中Nrf2的mRNA相對表達量;IPEC-J2細胞中Keap1的mRNA相對表達量與Nrf2趨勢一致,但5～100 μmol/L的AST與對照組相比均未達到統(tǒng)計學差異。Nrf2信號通路的下游基因HO-1、NQO1、HSP70和SOD2都是與抗氧化相關的,AST處理IPEC-J2細胞后,成功激活了Nrf2信號通路,顯著增加上述基因的表達,并且AST(80 μmol/L)能夠顯著提升Nrf2信號通路上的關鍵蛋白Nrf2和HO-1的表達,從而提高細胞的抗氧化能力。

4 結(jié) 論

AST能夠激活IPEC-J2細胞內(nèi)Nrf2信號通路,促進其下游基因HO-1、NQO1、HSP70和SOD2表達,增強IPEC-J2細胞抗氧化酶活性以及抗氧化相關基因的表達,降低炎癥和凋亡相關基因的表達,AST還能夠降低IPEC-J2細胞中Bax的蛋白相對表達量和Bax/Bcl-2蛋白比值,提高細胞抗凋亡能力,并且上調(diào)Nrf2信號通路上的關鍵蛋白Nrf2和HO-1的表達。綜合來看,80 μmol/L的AST更能夠發(fā)揮其生理功能,增強IPEC-J2細胞的抗氧化、抗炎和抗凋亡能力。