硒代蛋氨酸對(duì)青鳉親本繁育和子代發(fā)育的影響

王 潔 宋 磊 王 歡 齊澈力木格 尹曉宇 于永利,2 康桂英 張學(xué)富 董 武* 楊景峰*

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,內(nèi)蒙古自治區(qū)毒物監(jiān)控及毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,通遼 028000;2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)與食品學(xué)院,通遼 028000;3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院,通遼 028000)

硒(Se)是生物體功能所必需的元素,在體內(nèi)發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。在畜牧業(yè)中,富硒產(chǎn)品常被用作膳食補(bǔ)充劑,并納入動(dòng)物預(yù)防保健的功能性飼料中[1]。但當(dāng)補(bǔ)充的硒濃度超過(guò)所需濃度的2倍時(shí),就會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的器官毒性[2]。研究發(fā)現(xiàn),鯉魚(yú)體內(nèi)的硒代蛋氨酸(Se-Met)主要在卵巢中沉積[3]。斑馬魚(yú)胚胎暴露于12.5、25.0、50.0和100.0 μg/L硒120 d,發(fā)現(xiàn)亞硒酸鹽的存在顯著抑制了斑馬魚(yú)體內(nèi)卵母細(xì)胞成熟,并增加了卵母細(xì)胞凋亡[4]。在含3.7～26.6 μg/(g d)有機(jī)硒(Se-Met)飼料組中,觀察到魚(yú)體內(nèi)雌二醇(E2)含量降低,并伴隨著產(chǎn)卵率顯著下降,造成嚴(yán)重的生殖障礙,這種障礙可能是Se-Met轉(zhuǎn)移到子代,進(jìn)而對(duì)子代產(chǎn)生毒性[5]。Chernick等[6]通過(guò)給青鳉(Oryziaslatipes)飼喂Se-Met,導(dǎo)致子代青鳉骨骼發(fā)育障礙。大型蚤對(duì)Se-Met更為敏感,過(guò)量Se-Met處理會(huì)導(dǎo)致其生殖停滯甚至死亡[7]。生殖機(jī)能與雌二醇含量以及細(xì)胞色素P450(CYP)19編碼的芳香化酶密切相關(guān)[8]。在青鳉體內(nèi)存在2個(gè)CYP19同源基因,其中CYP19a在卵巢中高表達(dá),CYP19b在大腦中高表達(dá)[9]。性腺發(fā)育受下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸調(diào)節(jié)[10]。大腦中合成并分泌促性腺激素釋放激素(GnRH),刺激垂體合成和釋放垂體促性腺激素(GTHs),從而刺激性腺中的類(lèi)固醇生成[11]。同時(shí),卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)對(duì)性腺的發(fā)育也起到至關(guān)重要的作用[12]。研究發(fā)現(xiàn),硒在“水體浮游動(dòng)植物-魚(yú)-水鳥(niǎo)”食物鏈中積累,導(dǎo)致水鳥(niǎo)出現(xiàn)筑巢率、繁殖率和胚胎發(fā)育率降低等中毒現(xiàn)象[13]。

青鳉屬于異性繁殖,其個(gè)體卵泡的卵黃發(fā)生過(guò)程和相關(guān)卵母細(xì)胞的成熟迅速,便于觀察[14-15]。目前關(guān)于Se-Met對(duì)魚(yú)類(lèi)生殖發(fā)育影響的報(bào)道較少。因此,本研究以青鳉為試驗(yàn)動(dòng)物,用添加Se-Met的飼料飼喂F0代親本,探討Se-Met暴露對(duì)青鳉性行為學(xué)變化、性腺組織學(xué)變化及性腺關(guān)聯(lián)基因表達(dá)變化的影響,評(píng)估Se-Met對(duì)青鳉繁殖的影響,并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

青鳉養(yǎng)殖系統(tǒng)購(gòu)買(mǎi)于北京愛(ài)生公司。小型魚(yú)行為系統(tǒng)購(gòu)買(mǎi)于法國(guó)VIEWPOINT公司。Se-Met購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Sigma Aldrich公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

按照楚文慶等[16]的方法和結(jié)果制備添加Se-Met的飼料和設(shè)置Se-Met暴露濃度,即2、10和50 μg/g Se-Met。首先配制含有1 mg/mL Se-Met的儲(chǔ)備溶液(溶劑為超純水),然后在玻璃培養(yǎng)皿中使用不同濃度的Se-Met稀釋液與20 g的干飼料充分混合,并用刮刀徹底混合以確保液體均勻分布。分別制作含2、10和 50 μg/g Se-Met的干飼料(即1 g干飼料中含有2、10和 50 μg Se-Met),用于成年青鳉飼喂。

從繁育群體中隨機(jī)選擇4～5月齡的性成熟雄性和雌性青鳉,將雄性和雌性青鳉分離并觀察1周,通過(guò)確認(rèn)可存活的胚胎來(lái)確定個(gè)體的生殖狀態(tài)。將選定的青鳉轉(zhuǎn)移到試驗(yàn)缸,并參考自然環(huán)境冬季的光照條件保持14 h∶10 h的光照/黑暗時(shí)間。在3 L的魚(yú)缸中分別放入雄性(5條/缸)和雌性青鳉(3條/缸),在24 ℃條件下孵育。試驗(yàn)缸內(nèi)水體使用前曝氣并過(guò)夜,配制成1‰鹽水。把17條青鳉隨機(jī)分配到4個(gè)組,每組3～5條魚(yú)。對(duì)照組投喂基礎(chǔ)干飼料,試驗(yàn)組分別投喂含2、10和50 μg/g Se-Met的干飼料。試驗(yàn)期7 d。

青鳉由內(nèi)蒙古民族大學(xué)毒物監(jiān)控及毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,青鳉繁育在養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。成魚(yú)保持在(28±1) ℃的封閉循環(huán)水條件下,用人工模擬光源對(duì)青鳉的生活周期進(jìn)行規(guī)律性調(diào)控(白天光照14 h,晚上黑暗10 h)。水硬度為60 mg/L(以CaCO3計(jì)算);水的鹽度使用NaCl調(diào)節(jié),電導(dǎo)率保持在450～500 μs/cm;pH使用NaHCO3調(diào)節(jié),保持在7.0～7.3。每天投喂3次商業(yè)干飼料和2次鹵蟲(chóng)溶液。

試驗(yàn)之前,青鳉在飼養(yǎng)缸內(nèi)適應(yīng)3 d,每天飼喂3次,并補(bǔ)充豐年蝦。在適應(yīng)期后,將青鳉喂養(yǎng)7 d,每天投喂約1%體重的含有或不含Se-Met的干飼料,減少豐年蝦的飼喂,確保飼料的攝入。喂養(yǎng)7 d后,使用新的魚(yú)缸并將雌性和雄性青鳉各1條混合飼養(yǎng)。在繁殖期間,魚(yú)類(lèi)保持相同的飼喂時(shí)間并控制飼料用量,鹵蟲(chóng)溶液的投喂量恢復(fù)正常以促進(jìn)產(chǎn)卵。每日吸取糞便,以保持水體清潔,并減少缸內(nèi)廢物中積累的Se-Met。觀察成魚(yú)的正常活動(dòng)、喂養(yǎng)狀況和應(yīng)激跡象。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 Se-Met在青鳉卵巢和精巢的殘留

將投喂10 μg/g Se-Met干飼料7 d的青鳉解剖,取精巢和卵巢,清洗后放1.5 mL Tube管中稱(chēng)重,并添加10 mL優(yōu)級(jí)純硝酸轉(zhuǎn)移到消解管中。將消解管放置于高溫消解儀的加熱塊上過(guò)夜,直到內(nèi)容物消失變清,然后將消解管取出并在室溫下冷卻約15 min。冷卻后,用超純水稀釋定容消化液至50 mL。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法測(cè)定硒濃度。

1.3.2 性腺組織發(fā)育

收集青鳉卵巢、精巢和F1代胚胎,并固定于4%多聚甲醛(PFA)溶液中4 ℃過(guò)夜,經(jīng)過(guò)梯度濃度酒精脫水、置換酒精(100%酒精+100%二甲苯1次,二甲苯2次,每次10 min)后組織浸蠟包埋。獲取3 μm精巢切片、5 μm卵巢切片和5 μm F1代胚胎切片,用于蘇木精-伊紅(HE)染色,在50 ℃的水浴中展片完全。將載玻片平放在37 ℃展片機(jī)上架子上烤干,再放入37 ℃恒溫烘干箱烘干。每組3個(gè)及以上生物學(xué)重復(fù)。依據(jù)HE染色試劑盒提供方法和步驟進(jìn)行染色,即常規(guī)脫蠟及梯度酒精置換二甲苯,蘇木素染色2 min,水洗分化液分化3 min,之后伊紅染色液染色21 s,梯度酒精脫水,二甲苯透明,干燥后,封片,并在光學(xué)顯微鏡下鏡檢觀察性腺組織變化,使用Image軟件進(jìn)行不同發(fā)育時(shí)期卵細(xì)胞、精子計(jì)數(shù)。

1.3.3 求偶行為和游泳距離

青鳉求偶行為測(cè)試在2 L的青鳉合缸專(zhuān)用缸中進(jìn)行。各組隨機(jī)選取青鳉按雌雄比1∶1配對(duì)放入燒杯中過(guò)夜,試驗(yàn)于次日光照開(kāi)始1 min后拍攝記錄青鳉的求偶行為,記錄時(shí)間為20 min。青鳉雄魚(yú)的接近(approaching)、追隨(following)、求偶方向(courting orientation)、求偶圓舞(courting round dance)以及交配(copulation)等發(fā)生頻次被定量為青鳉求偶行為指標(biāo)[17]。各種求偶行為參數(shù)定義如下。接近:雌性青鳉停留或者游得很慢時(shí),可以觀察到雄性青鳉通過(guò)游泳來(lái)縮短與雌性青鳉的距離。追隨:通常表現(xiàn)為雄性青鳉跟隨雌性青鳉后面游泳,二者游泳速度大致相同,2個(gè)個(gè)體之間的距離幾乎不變,一般不超過(guò)5 cm。求偶方向:雄性青鳉在雌性青鳉的下面,嘴部位于雌性青鳉腹部位置,二者以相同的速率很緩慢地游動(dòng),并且方向相同,也可以理解為追求取向。求偶圓舞:一般來(lái)說(shuō),雄性青鳉在雌性青鳉周?chē)焖僖苿?dòng),典型情況下,雄性青鳉在雌性青鳉前面順時(shí)針或者逆時(shí)針繪制一個(gè)水平或者垂直的圓圈,之后快速恢復(fù)到之前的求偶方向,這種舞蹈經(jīng)常連續(xù)重復(fù)幾次,有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)雄性青鳉只在雌性青鳉面前進(jìn)行一個(gè)小小的轉(zhuǎn)身,這種情況被認(rèn)定為不完整的求偶舞蹈。交配:當(dāng)雌性青鳉接受了雄性青鳉的求偶,二者會(huì)游至上層,尾鰭緊緊貼合,身軀水平呈60°角,全身及鰭快速而精細(xì)地顫抖,緩慢下沉,持續(xù)時(shí)間為15～30 s,到達(dá)高潮。

記錄求偶行為之后,使用小型魚(yú)行為系統(tǒng)分別測(cè)量各組亮-暗5 min交替下游泳距離,每組測(cè)定3個(gè)重復(fù)。

1.3.4 大腦和性腺中生殖相關(guān)基因的表達(dá)

收集青鳉大腦和性腺并切取1/2放入2.0 mL離心管中,每組測(cè)定3個(gè)重復(fù)。使用Trizol方法提取總RNA,純化后使用ND-1000(ThermoFisher Scientifific公司,美國(guó))進(jìn)行RNA定量。使用250 ng總RNA與高容量cDNA逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。根據(jù)已在NCBI上發(fā)表的青鳉基因序列,利用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物,以18S為看家基因,檢測(cè)CYP19a、CYP19b、GnRHb、催乳素(PRL)、FSHb、LHb以及生長(zhǎng)乳素(SL)的mRNA相對(duì)表達(dá)水平,引物序列見(jiàn)表1。根據(jù)Dong等[18]的方法使用StepOnePlusTMReal-Time PCR System用于PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 15 min,95 ℃ 40個(gè)周期15 s。采用2-△△Ct方法來(lái)計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.3.5 F1代青鳉魚(yú)胚胎組織變化

成年青鳉按照雌性和雄性1∶1的比例進(jìn)行交配產(chǎn)卵,12 h后收集F1代胚胎。在受精后第8天時(shí)將青鳉魚(yú)卵置于顯微鏡下觀察其受精和畸形情況,并記錄。在第10天時(shí),收集青鳉胚胎進(jìn)行固定并制作石蠟切片進(jìn)行HE染色,并進(jìn)一步在光學(xué)顯微鏡下觀察胚胎組織變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS 20.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析,數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,差異顯著性水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 Se-Met在青鳉卵巢和精巢的殘留

由表2可見(jiàn),對(duì)照組卵巢硒濃度為0.008 1 μg/g,10 μg/g Se-Met組卵巢硒濃度為0.016 1 μg/g;10 μg/g Se-Met組卵巢硒濃度是對(duì)照組的1.99倍,差異顯著(P<0.05)。對(duì)照組精巢硒濃度為0.007 8 μg/g,10 μg/g Se-Met組精巢硒濃度為0.007 2 μg/g;10 μg/g Se-Met組精巢硒濃度與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 Se-Met在青鳉卵巢和精巢的殘留

2.2 Se-Met對(duì)青鳉求偶行為及游泳距離的影響

由圖1可見(jiàn),與對(duì)照組相比,2 μg/g Se-Met組的接近、追隨、求偶方向、求偶圓舞和交配發(fā)生頻率沒(méi)有顯著差異(P<0.05);10、50 μg/g Se-Met組的接近、求偶方向和求偶圓舞發(fā)生頻率顯著降低(P<0.05),而追隨、交配發(fā)生頻率沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

由表3可見(jiàn),各組之間雌性和雄性青鳉的游泳距離沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

表3 Se-Met對(duì)青鳉游泳距離的影響

2.3 Se-Met對(duì)青鳉性腺組織發(fā)育的影響

正常青鳉卵巢組織由不同發(fā)育時(shí)期的卵細(xì)胞組成,根據(jù)張靜等[19]的研究將卵巢分為5個(gè)發(fā)育時(shí)期,Ⅰ期:染色質(zhì)核仁期;Ⅱ期:絨毛膜期;Ⅲ期:細(xì)胞核核仁期;Ⅳ期:卵黃形成期;Ⅴ期:成熟卵期。青鳉卵巢切片染色結(jié)果顯示,Ⅰ～Ⅳ期卵母細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的堆積,相反,Ⅴ期卵母細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),并且都出現(xiàn)不同程度的卵泡排列以及結(jié)構(gòu)凌亂等卵巢萎縮現(xiàn)象(圖2-A～圖2-D)。與對(duì)照組相比,50 μg/g Se-Met組的Ⅲ期卵細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高(P<0.05)(表4)。

雄性青鳉性腺組織發(fā)育良好,在精巢組織中可以看到精原細(xì)胞均分布于官腔中央及大小不一的生精小管中,隨著Se-Met濃度的升高,青鳉精原細(xì)胞數(shù)呈降低趨勢(shì)(圖2-E～圖2-H)。與對(duì)照組相比,10和50 μg/g Se-Met組的精子計(jì)數(shù)顯著降低(P<0.05)(表4)。

2.4 Se-Met對(duì)青鳉大腦和卵巢中生殖相關(guān)基因表達(dá)的影響

由表5可見(jiàn),與對(duì)照組相比,2 μg/g Se-Met組大腦和卵巢中各生殖相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05);10和50 μg/g Se-Met組雌魚(yú)和雄魚(yú)大腦中CYP19b的mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),10和50 μg/g Se-Met組卵巢中CYP19a的mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),10和50 μg/g Se-Met組卵巢中FSHb的mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),50 μg/g Se-Met組卵巢中GnRH1b的mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),50 μg/g Se-Met組卵巢中LHb的mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),10和50 μg/g Se-Met組卵巢中SL的mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

2.5 Se-Met對(duì)F1代青鳉胚胎狀態(tài)的影響

由表6可見(jiàn),與對(duì)照組相比,2 μg/g Se-Met組青鳉胚胎的未受精率和畸形率沒(méi)有顯著差異(P>0.05),而50 μg/g Se-Met組青鳉胚胎的未受精率顯著升高(P<0.05),10和50 μg/g Se-Met組青鳉胚胎的畸形率顯著升高(P<0.05)。其中,畸形主要表現(xiàn)為頭部浮腫、心囊浮腫、雙頭魚(yú)等(圖3-A～圖3-F)。

3 討 論

硒作為生物體內(nèi)必需的微量營(yíng)養(yǎng)素,其主要功能是維持正常的新陳代謝[20]。硒缺乏與認(rèn)知和神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙有關(guān),且可引起黃鯰幼魚(yú)體內(nèi)活性氧(ROS)的過(guò)量產(chǎn)生,抑制其生長(zhǎng)并引起氧化應(yīng)激[21-22]。因此,外源硒的補(bǔ)充被認(rèn)為是對(duì)魚(yú)類(lèi)健康有益的[23]。與無(wú)機(jī)形式的硒相比,有機(jī)硒具有更好的生物利用度[24]。但過(guò)度補(bǔ)硒也會(huì)造成硒中毒。在內(nèi)分泌組織(甲狀腺、腎上腺、垂體、睪丸、卵巢)中的硒含量高于其他許多器官,研究發(fā)現(xiàn),精子的發(fā)生依賴(lài)于充足的硒供應(yīng),而硒過(guò)量可能損害卵巢功能[25]。應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是,硒含量過(guò)高或缺乏硒對(duì)人體健康有害,而硒元素在體內(nèi)正常運(yùn)作所需的劑量與有害劑量之間的差異很小,因此必須謹(jǐn)慎地補(bǔ)充。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量Se-Met對(duì)青鳉的生殖毒性,檢測(cè)到Se-Met在青鳉卵巢內(nèi)的殘留,并首次發(fā)現(xiàn)Se-Met喂飼造成青鳉求偶行為的減弱,也造成成熟卵母細(xì)胞減少、未成熟卵母細(xì)胞大量堆積、卵巢及卵細(xì)胞形態(tài)紊亂。結(jié)果提示,合理控制硒的攝入是非常重要的課題。

A～D分別為對(duì)照組、2 μg/g Se-Met組、10 μg/g Se-Met組、50 μg/g Se-Met組的卵巢。其中羅馬數(shù)字Ⅰ～Ⅴ分別對(duì)應(yīng)Ⅰ期:染色質(zhì)核仁期;Ⅱ期:絨毛膜期;Ⅲ期:細(xì)胞核核仁期;Ⅳ期:卵黃形成期;Ⅴ期:成熟卵期。E～H分別為對(duì)照組、2 μg/g Se-Met組、10 μg/g Se-Met組、50 μg/g Se-Met組的精巢。比例尺為50 μm。

表4 Se-Met對(duì)青鳉卵細(xì)胞和精子計(jì)數(shù)的影響

Naderi等[26]給斑馬魚(yú)進(jìn)行了為期60 d的Se-Met(3.5、11.1、27.4和63.4 μg/g硒)暴露,Se-Met導(dǎo)致斑馬魚(yú)聯(lián)想學(xué)習(xí)障礙,并闡明這種障礙與巴胺能神經(jīng)傳遞的失調(diào)有關(guān)。斑馬魚(yú)的神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)外源性毒物敏感,特別是在胚胎神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中,在過(guò)量硒處理的胚胎中觀察到斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)行為失調(diào),包括運(yùn)動(dòng)距離縮短和觸覺(jué)反應(yīng)遲鈍[27]。但目前尚未發(fā)現(xiàn)Se-Met改變求偶行為的報(bào)道,本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)Se-Met對(duì)青鳉求偶行為產(chǎn)生了影響,我們猜測(cè)這可能與體內(nèi)激素紊亂有關(guān)。

生殖內(nèi)分泌紊亂對(duì)魚(yú)類(lèi)繁殖的影響主要表現(xiàn)為雄性精子密度、活力下降;雌性卵母細(xì)胞生長(zhǎng)和成熟過(guò)程停滯,從而影響配子活力和生育能力[28]。斑馬魚(yú)暴露于草甘膦類(lèi)除草劑(0.065和6.500 mg/L)15 d后,出現(xiàn)初期卵泡數(shù)量增加、晚期卵泡數(shù)量減少等對(duì)卵巢成熟不利的現(xiàn)象,并且表明這些變化可能導(dǎo)致生殖毒性發(fā)生[29]。本研究發(fā)現(xiàn),青鳉在使用10和50 μg/g Se-Met處理后,卵巢組織中成熟的Ⅳ期細(xì)胞數(shù)量減少,而相應(yīng)的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的卵母細(xì)胞出現(xiàn)堆積,這可能是由于過(guò)量Se-Met引起激素紊亂導(dǎo)致卵巢功能損傷。給予0.2、0.4或0.8 mg/kg BW硒可促進(jìn)大鼠精子活力,而過(guò)量的硒補(bǔ)充(4.0和8.0 mg/kg BW)導(dǎo)致大鼠睪丸重量、精子濃度和活力下降,從而引起睪丸和附睪的組織病理學(xué)損傷[30]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的變化,隨著Se-Met濃度的升高,青鳉精子計(jì)數(shù)呈降低趨勢(shì)。

表5 Se-Met對(duì)青鳉大腦、卵巢中生殖相關(guān)基因表達(dá)的影響

Control:對(duì)照組;Se-Met:50 μg/g Se-Met組。圖A:正常受精卵;圖B:心囊浮腫畸形受精卵;圖C:雙頭畸形受精卵;圖D、圖E和圖F分別是圖A、圖B和圖C的組織切片HE染色圖。e:眼睛;y:卵黃囊;h:心臟。

過(guò)量的硒攝入被發(fā)現(xiàn)具有致畸風(fēng)險(xiǎn),由于可以通過(guò)母體的屏障滲透到胎盤(pán)和乳腺中,因此很多新生動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)發(fā)育異常、畸形率增高等硒中毒癥狀[31]。Gerhart等[32]持續(xù)28 d給黑頭鰷魚(yú)飼喂富硒飼料(1.21～26.5 μg/g硒),母體沒(méi)有產(chǎn)生明顯的生殖毒性,但卻檢測(cè)到胚胎硒濃度以劑量依賴(lài)性方式增加,并出現(xiàn)大量畸形,但不影響胚胎的孵化率或存活率。Chernick等[6]向成年青鳉飼料中添加Se-Met(12.5、25或50 μg/g),連續(xù)飼喂6 d后實(shí)施交配,所產(chǎn)胚胎孵化率降低,出現(xiàn)較多的畸形。這些研究都闡述了Se-Met飼喂造成子代的影響。這與本研究檢測(cè)的過(guò)量Se-Met補(bǔ)充造成子代畸形率及死亡率升高的結(jié)果相似。但目前Se-Met對(duì)母體卵巢和精巢的影響并沒(méi)有報(bào)道。本試驗(yàn)首次進(jìn)行了求偶行為和性腺的組織學(xué)變化的研究。

由CYP19基因編碼的芳香酶主要功能為促進(jìn)雄激素向雌性激素的轉(zhuǎn)化,以此來(lái)維持體內(nèi)性類(lèi)固醇水平的穩(wěn)定,青鳉基因組存在2個(gè)芳香酶同源基因,分別為CYP19a和CYP19b,其中CYP19a在卵巢中高表達(dá)[33]。Nikhil等[34]發(fā)現(xiàn)硒和銅的暴露可刺激羊卵巢顆粒細(xì)胞CYP19a1的表達(dá)增加。性腺的CYP19a是類(lèi)固醇生成途徑中的末端酶,并催化雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)變,因此,CYP19amRNA標(biāo)記表達(dá)可顯著干擾性類(lèi)固醇代謝,引起激素失衡[35]。與之前的報(bào)告結(jié)果相同,本試驗(yàn)檢測(cè)到在低濃度Se-Met處理后,卵巢中CYP19a的mRNA相對(duì)表達(dá)水平有下調(diào)的趨勢(shì);而高濃度Se-Met處理后,CYP19a的mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高,這可能暗示著卵巢誘導(dǎo)CYP19a表達(dá)是對(duì)芳香酶抑制的常見(jiàn)代償反應(yīng)。與斑馬魚(yú)相似,青鳉體內(nèi)CYP19b對(duì)雌激素激活比CYP19a更敏感[36]。CYP19b通常認(rèn)為與魚(yú)類(lèi)的繁育和求偶行為有密切關(guān)聯(lián)。有研究顯示,雌激素及類(lèi)污染物造成魚(yú)類(lèi)大腦中CYP19b表達(dá)的上調(diào)[37-39]。但我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Se-Met對(duì)CYP19b表達(dá)影響的報(bào)道。在本研究中,Se-Met處理的魚(yú)卵巢中CYP19b的mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高,表明雌激素和雄激素水平的平衡可能受到干擾。

生殖功能是由HPG軸,也稱(chēng)為GnRH-促性腺激素類(lèi)固醇軸調(diào)控。GnRH在HPG軸控制生殖內(nèi)分泌方面也發(fā)揮重要作用[40]。GnRH可介導(dǎo)FSH和LH的分泌[41]。FSH和LH在卵泡發(fā)育的階段主要依賴(lài)于細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)分子相互作用的網(wǎng)絡(luò)。靶組織(性腺)對(duì)FSH和LH的反應(yīng)性在很大程度上取決于其特異性受體的表達(dá)[42]。在自然排卵周期中FSH和LH水平出現(xiàn)周期激增,LH水平的增高可促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟并觸發(fā)排卵,然而,FSH水平的過(guò)度升高與萎縮性卵巢有關(guān)[43]。暴露于有毒環(huán)境下,化學(xué)物質(zhì)可以通過(guò)影響激素作用或干擾下丘腦和/或垂體影響卵巢功能,甚至通過(guò)破壞濾泡直接導(dǎo)致卵巢衰竭,最終破壞神經(jīng)內(nèi)分泌反饋,導(dǎo)致FSH和LH水平升高[44]。Peng等[45]研究也表明,GnRH以及FSH的表達(dá)上調(diào)可能是由毒性物質(zhì)引起的GnRH負(fù)反饋調(diào)節(jié)導(dǎo)致。在本研究中,高濃度的Se-Met造成卵巢卵泡發(fā)育障礙,同時(shí)也檢測(cè)到GnRH、FSH和LH的mRNA相對(duì)表達(dá)水平上調(diào)。

在脊椎動(dòng)物中,PRL主要由垂體泌乳素合成和釋放,并在生長(zhǎng)發(fā)育、代謝、泌乳、免疫調(diào)節(jié)、行為和繁殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用[46]。研究表明,PRL基因在卵巢疾病中起著重要的作用。接觸內(nèi)分泌干擾物的鯰魚(yú)卵巢中PRL水平升高[47]。本研究中發(fā)現(xiàn),Se-Met沒(méi)有顯著引PRL的mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高。PRL在魚(yú)類(lèi)中的作用還有待觀察,但目前的研究可能暗示這種現(xiàn)象的發(fā)生。SL是一種魚(yú)類(lèi)特異性腺垂體肽激素,屬于生長(zhǎng)激素(GH)/PRL家族[48]。該激素被認(rèn)為在早期卵子生成、性腺成熟和性腺類(lèi)固醇生物合成期間起作用。SL可通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝來(lái)促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟,血漿SL水平在性成熟過(guò)程中升高[49]。借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn),SL可能在卵母細(xì)胞發(fā)育的早期階段發(fā)揮作用,因?yàn)槁殉睸LR轉(zhuǎn)錄本隨著卵母細(xì)胞成熟而下調(diào)[50]。此外,有研究表明,SL表達(dá)的降低可能會(huì)促進(jìn)GnRH的表達(dá)[51]。這與本研究結(jié)果相符,本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量Se-Met造成青鳉求偶行為指標(biāo)的低下,卻同時(shí)造成生殖關(guān)聯(lián)基因表達(dá)的增加,這可能是一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。雖然硒補(bǔ)充產(chǎn)品在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面廣泛被應(yīng)用,但硒的劑量選擇之間的臨界值非常小,因?yàn)樯愿叩膭┝烤涂赡軐?dǎo)致硒中毒。

4 結(jié) 論

Se-Met影響成年青鳉的繁育,造成其求偶行為指標(biāo)降低,卵巢組織中成熟卵泡數(shù)量減少和未成熟卵母細(xì)胞堆積,精原細(xì)胞數(shù)量減少。這種變化可能是由于Se-Met影響了CYP19b、CYP19a、GnRH1b、PRL、LHb、SL及FSHb表達(dá)而造成。本研究結(jié)果提示,給魚(yú)類(lèi)添加Se-Met時(shí)要嚴(yán)格控制使用劑量。