不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道結構和腸道微生物組成變化的比較

李鳴霄 強 俊,* 徐鋼春 周國勤 張茂友 陶易凡 路思琪 李 巖 陸 健 徐 跑,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院,無錫 214081; 2.中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心,農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點實驗室,無錫 214081;3.南京市水產(chǎn)科學研究所,南京 210036;4.蘇州水產(chǎn)技術推廣站,蘇州 215008)

過去20年里全球?qū)λa(chǎn)品的需求量迅速增長,而過度捕撈導致了天然漁業(yè)資源急劇下降,這就促使水產(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展[1]。隨著對水產(chǎn)動物營養(yǎng)需求的研究不斷深入,人工飼料的配方越來越完善,營養(yǎng)越來越全面,具有生產(chǎn)周期短、成本低、安全性高等優(yōu)點,飼喂人工配合飼料可以減小對養(yǎng)殖水體的污染,改善水產(chǎn)動物肌肉營養(yǎng)水平、提高免疫力、降低疾病發(fā)生率等[2-3]。目前大口黑鱸養(yǎng)殖模式可以分為4個階段,分別為仔魚期鹵蟲誘導開口、稚魚期使用微量配合飼料馴化轉(zhuǎn)食、幼魚期投喂人工配合飼料直至成熟個體[4-5]。然而,在苗種培育階段依舊存在死亡率高的問題,成為制約魚類苗種產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要瓶頸之一[6-7]。

近年來,許多專家學者針對魚類苗種培育的影響因素開展了相關研究,包括飼料的喂養(yǎng)方式、轉(zhuǎn)食的開始時間和持續(xù)時間等。例如,梭鱸(Sanderlucioperca)魚種可在孵化后第15天開始餌料馴化,降低了對消化能力或消化道發(fā)育的不利影響[4];而海鱸魚(Dicentrarchuslabrax)應在第20天進行馴化工作,有助于提高魚種的發(fā)育、存活和消化酶活性[8]。此外,轉(zhuǎn)食成功率也受到配方飼料營養(yǎng)成分的影響[9]。大口黑鱸(Micropterussalmoides),又名加州鱸,屬鱸形目、太陽魚科、黑鱸屬,原產(chǎn)于北美洲。大口黑鱸擁有快速的生長速度、廣泛的溫度耐受性和對新環(huán)境的適應可塑性,被認為是優(yōu)質(zhì)食物來源而引入中國,并成為中國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類之一。2021年年產(chǎn)量近70.21萬t[10],相比于2020年增長了13.33%。目前,針對滿足大口黑鱸營養(yǎng)需求的人工配合飼料的開發(fā)已經(jīng)較為完善,但有關苗種飼養(yǎng)和食性轉(zhuǎn)變的認知深度有限,苗種培育階段的大口黑鱸死亡率和生產(chǎn)成本仍然很高,極大地限制了產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。因此,進一步研究大口黑鱸對于餌料改變的適應與調(diào)控有助于優(yōu)化苗種培育過程,提高養(yǎng)殖存活率。

研究表明,在魚類仔稚魚養(yǎng)殖過程的高死亡率可能是由病原微生物引起的高發(fā)病率疾病所造成的[11-12],而關于改善水產(chǎn)養(yǎng)殖中魚種健康狀態(tài)的研究大多集中在益生菌調(diào)控[13-14]和加強養(yǎng)殖水處理[15]上,很少研究魚類養(yǎng)殖中與宿主相關微生物的多樣性和功能[11],這阻礙了我們對魚類發(fā)育階段中微生物群落建立的理解。在動物腸道中,微生物群落處于一種不斷動態(tài)變化的狀態(tài),而其組成結構受到宿主特征(如年齡、免疫和遺傳特征等)[16-17]、環(huán)境(如水體、飲食和藥物等)[18-19]以及微生物(如黏附能力、酶和代謝能力)等因素的影響[20]。因此,針對動物腸道微生物群組成及結構特征的變化情況將備受關注。16S rDNA是一種對特定環(huán)境樣品中所有細菌進行的高通量測序技術,以研究環(huán)境樣品中微生物群體的組成,解讀微生物群體的多樣性、豐富度以及群體結構,該技術被認為是最適于細菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的指標[21]。本研究通過16S rDNA高通量測序技術,對不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道微生物群進行分析,并通過組織切片觀察和消化酶活性測定比較不同養(yǎng)殖階段之間大口黑鱸腸道發(fā)育和消化功能的改變,有助于更好地了解大口黑鱸食性轉(zhuǎn)變的腸道生理過程,也為大口黑鱸的苗種培育提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 飼養(yǎng)與管理

試驗用魚選自中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興基地的剛孵化2 d的卵黃囊仔魚,在圓形水泥池中飼養(yǎng)。參考大口黑鱸苗種培育模式,出膜平游后第3天開始投喂豐年蟲,也稱為鹵蟲(含有41%～62%粗蛋白質(zhì),2%～8%粗脂肪),持續(xù)到第11天。該階段選擇在04:00—22:00進行投喂,第1天間隔2 h投喂1次,幼魚開口后逐漸延長間隔時間至6 h投喂1次。魚苗攝食后頭部往后均為紅色,可以此判斷魚苗的饑飽情況,日投餌料為魚體重的40%～70%,前期高,后期低。

從第12天開始,對魚苗投喂鹵蟲和商品飼料(含有48%粗蛋白質(zhì),5%粗脂肪)的混合飲食,其中商品化微量飼料的比例緩慢增加(每天增加4%的商品飼料),持續(xù)到第36天,此時的大口黑鱸已完全使用商品飼料投喂。隨后大口黑鱸在循環(huán)水系統(tǒng)中繼續(xù)使用商品飼料飼養(yǎng),直至成長為成熟個體(試驗周期為6個月),期間根據(jù)魚體大小及時調(diào)整飼料的口徑。該階段每天在07:00、12:00和17:00 3個時間點投喂。商品飼料購自無錫某生物科技有限公司。

整個適應和養(yǎng)殖期間水質(zhì)參數(shù)如下:溫度為(28±1) ℃;溶解氧含量>6.0 mg/mL;pH為7.2～7.6;氨氮含量<0.1 mg/L;亞硝酸鹽含量<0.01 mg/L。

1.2 試驗設計及樣品采集

在養(yǎng)殖第5、25、45和180天,隨機選取20尾大口黑鱸樣本,分別代表開口攝食期、轉(zhuǎn)食人工配合飼料期、適應人工配合飼料期以及成魚養(yǎng)殖期4個不同階段。用100 mg/L MS-222預先麻醉,快速解剖取出腸道組織(第5天仔魚由于體積太小,不能完整的取出腸道組織,故將整條魚作為1個樣本),立即置于液氮中快速冷凍并儲存在-80 ℃冰箱中,用于后續(xù)腸道消化酶活性測定。在4個階段再各挑選大口黑鱸16尾,麻醉后采集腸道組織,置于液氮中快速冷凍并-80 ℃保存,用于腸道微生物16S rDNA測序。另外,再隨機挑選共20尾大口黑鱸(每個階段5尾),麻醉后解剖,截取腸道中段,保存于4%多聚甲醛中,用于制作腸道切片(第5天仔魚采用整魚縱切的方式,而對第25、45和180天的大口黑鱸腸道進行截面橫切)。

1.3 腸道組織切片

腸道樣品在4%多聚甲醛固定24 h后,酒精梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋后,使用YD-202型切片機切片,厚度為6～8 μm,蘇木精-伊紅(HE)染色,中性樹膠封片,在Eclipse Ci-L(Nikon,日本)拍照顯微鏡下觀察并攝像。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件(Media Cybernetics Corporation, 美國)統(tǒng)一以毫米作為標準單位,分別測量每張切片中4根完整絨毛高度。

1.4 腸道消化酶活性測定

取約1.0 g腸道樣品在冷凍的磷酸鹽緩沖液(PBS,50 mmol/L,pH=7.4)中研磨,然后在4 ℃下3 000×g離心20 min,吸取上清液用于測定腸道消化酶活性。淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性參照Qiang等[22]方法進行測定。

1.5 腸道微生物16S rDNA測序

1.5.1 DNA的提取和高通量測序

按照DNA提取試劑盒E.Z.N.A.?Water DNA Kit(Omega Bio-Tek,Norcross,美國)的說明,從采集的4個階段,共64個腸道樣本中提取總基因組DNA,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA。將各個階段每2個腸道DNA混合成為1個樣本,建立4組文庫,分別命名為5dph(孵化后天數(shù))、25dph、45dph和180dph,選用特定引物341F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進行PCR擴增。PCR擴增過程如下:98 ℃預變性30 s;接著98 ℃變性10 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,持續(xù)進行35個循環(huán);循環(huán)結束后72 ℃最終延伸10 min。將PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,判斷擴增后的DNA濃度是否達到了試驗擴增要求。測序在杭州聯(lián)川生物技術股份有限公司Illumina(Kapa Biosciences, Woburn,美國)的平臺上進行。

1.5.2 高通量測序結果初篩和數(shù)據(jù)分析

樣品在Illumina Nova-Seq平臺上進行測序,使用FLASH合并匹配端讀取。在特定的過濾條件下根據(jù)FQTRIM(v 0.94)對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量過濾以獲得高質(zhì)量的clean data。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均使用QIIME2軟件和R軟件(v 3.5.2),調(diào)用Vsearch9(v 2.3.4)軟件檢查并剔除嵌合體序列。通過SILVA(release 132)分類器對所得到的特征序列(features)進行分類比對,使用QIIME2軟件,獲取各樣本在門、綱、目、科、屬5個分類水平上的組成和豐度分布,對feature豐度矩陣中每個樣本的序列總數(shù)在不同深度下隨機抽樣,以每個深度下抽取到的序列數(shù)及其對應的feature數(shù)繪制稀疏曲線,并對每個樣本計算α-多樣性指數(shù),包括Chao1、Observed species, Shannon、Simpson指數(shù)及覆蓋率。采用Blast進行序列比對,每個代表性序列用SILVA數(shù)據(jù)庫對特征序列進行注釋。

1.6 統(tǒng)計分析

本試驗中使用SPSS 22.0軟件進行分析。用The Shapiro-wilk和The Levene檢驗腸道絨毛高度和消化酶活性的正態(tài)性和方差的同質(zhì)性,再應用one-way ANOVA進行單因素方差分析,根據(jù)Duncan氏法進行多重比較確定組間差異。此外,使用R包繪制稀疏曲線,使用QIIME2軟件進行β-多樣性和主坐標分析(PCoA)以評估樣品之間物種復雜性的差異,再使用Kruskal-Wallis H檢驗確定4個階段之間α-多樣性和分類水平上豐度差異的顯著性,使用Galaxy平臺(https://galaxyproject.org)對所有檢測到的細菌類群的豐度進行線性判別分析(LDA)效應大小(LEfSe)分析。在所有分析中,P<0.05表示為差異顯著,數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道結構變化

4個階段的腸道切片如圖1-A所示,其中第5天(a-1)腸道壁結構界限模糊,黏膜下層沒有發(fā)育完全,杯狀細胞等數(shù)量稀少,而第25(b-1)、45(c-1)和180天(d-1)腸道組織結構清晰,均由黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜組成,杯狀細胞等黏液細胞數(shù)量顯著增多,且主要分布于腸絨毛前端或近前端。此外,如圖1-B和表1所示,4個階段大口黑鱸的腸道絨毛高度存在顯著差異(P<0.05),對比于開口攝食階段的大口黑鱸,轉(zhuǎn)食、適應人工配合飼料和成魚養(yǎng)殖3個階段的大口黑鱸的腸道絨毛高度分別增加105%、218%、1 248%。

A圖中,BB:紋狀緣;CM:環(huán)肌;GC:杯狀細胞;IV:腸絨毛;LM:縱肌;SCE:單層柱狀上皮;Se:漿膜;SM:黏膜下層;TP:固有膜。B圖中,紅色箭頭標注的紅色細線代表腸道絨毛高度。In the figure A, BB: brush border; CM: circular muscle; GC: goblet cell; IV: intestinal villus; LM: longitudinal muscle; SCE: single columnar epithelium; Se: serosa; SM: sub mucosa;TP: tunica propria. In the figure B, the thin red line marked by the red arrow represents the height of the intestinal villus.

表1 不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道絨毛高度的變化

2.2 不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道消化酶活性變化

如表2所示,與開口攝食(第5天)鹵蟲相比,轉(zhuǎn)食人工配合飼料階段(第25天)的大口黑鱸3種消化酶活性都出現(xiàn)了顯著下降(P<0.05),而在第45天,適應了人工配合飼料的大口黑鱸腸道消化酶活性又出現(xiàn)回升,顯著高于第25天(P<0.05),但其中淀粉酶活性要顯著高于第5天大口黑鱸仔魚(P<0.05)。到了第180天成魚養(yǎng)殖期,大口黑鱸腸道中3種消化酶活性均達到最高值,但蛋白酶活性與第5天大口黑鱸相比并未表現(xiàn)出顯著差異(P>0.05),淀粉酶活性與第45天大口黑鱸相比也未表現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)。

表2 不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道消化酶活性的變化

2.3 腸道微生物

2.3.1 16S rDNA測序數(shù)據(jù)與排序

在過濾、質(zhì)量控制、引物、嵌合體和低置信度的數(shù)據(jù)去除后,本研究使用了來自4個文庫,32個樣本的總共1 721 562個clean data,平均每個樣品約有53 799個序列讀數(shù)。32個樣本中的特征序列features數(shù)量達到了1 825,各組的features數(shù)分別為599(5dph)、841(25dph)、402(45dph)、550(180dph)?；谧x數(shù)之間97%的相似性閾值對其進行聚類,鑒定出19個細菌門,34個綱,73個目,146個科和336個屬。如圖2所示,每個樣品中腸道菌群的測序深度都被完全捕獲,因此證實本研究數(shù)據(jù)的真實可靠,所有樣品都適合進一步分析。

2.3.2 不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道微生物α-和β-多樣性分析

本研究計算了4個α-多樣性指數(shù)(Chao1、Observed species、Shannon和Simpson指數(shù))(圖3),這些指標代表了微生物群落的豐富度和多樣性。結果發(fā)現(xiàn),第25天大口黑鱸稚魚腸道中微生物的α-多樣性指數(shù)顯著高于其他3組(P<0.05)。

此外,通過評估β-多樣性,以量化4個階段之間腸道微生物群落組成的差異,采用基于加權和未加權矩陣的PCoA,根據(jù)腸道微生物群落組成研究樣品間的關系。如圖4的PCoA圖所示,每個符號代表了樣品的腸道微生物群,其中第1主成分和第2主成分的貢獻率分別為15.55%和10.56%,37.00%和27.82%。圖中4組樣本之間的圓點分布離散,樣本95%置信區(qū)域距離較大,表明隨著食性的改變和個體的發(fā)育,4個階段大口黑鱸的腸道微生物群組成呈現(xiàn)顯著的不同。

圖2 不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道樣品的

*:P<0.05;**:P<0.01。下圖同 the same as below。

a:未加權距離矩陣主坐標分析 PCoA of unweighted UniFrac distance matrix;b:加權距離矩陣主坐標分析 PCoA of weighted UniFrac distance matrix。

2.3.3 不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道細菌門相對豐度變化

為了探究不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道內(nèi)菌群組成之間的變化差異,從門水平進行了分析。腸道菌群中12個最豐富features的相對豐度由累計柱狀圖(圖5-a)表示。其中變形菌門(Proteobacteria)相對豐度最高,占所有腸道微生物的90.61%。其他如厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)這4種細菌門分別占比為4.38%、2.34%、1.88%、0.44%。與第5天相比,第25天厚壁菌門相對豐度更豐富(圖5-b)。此外,擬桿菌門(圖5-c)和軟壁菌門(圖5-d)分別是第5和45天腸道菌群組成中特有的,它們在其他3組中相對豐度極低甚至沒有(圖5-b～圖5-d),但梭桿菌門相對豐度(圖5-e)在4組之間并未表現(xiàn)出顯著差異。

圖5 不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道中細菌門相對豐度

2.3.4 不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道細菌屬相對豐度變化

在屬(圖6-a)水平上,比較了12個優(yōu)勢菌群的相對豐度,發(fā)現(xiàn)第5天大口黑鱸腸道內(nèi),氣單胞菌屬(Aeromonas)處于最優(yōu)勢地位,占所有腸道微生物的93.45%,而隨著大口黑鱸的不斷發(fā)育和食性的改變,腸道菌群組成中該屬的占比不斷減少,分別為33.72%、23.52%和1.72%(圖6-b),在第180天大口黑鱸腸道中完全退出優(yōu)勢地位。假單胞菌屬(Pseudomonas)是第25和45天大口黑鱸腸道中共有的優(yōu)勢菌群,卻在另外2組大口黑鱸腸道中相對豐度占比極低(圖6-c)。第25天大口黑鱸腸道中還出現(xiàn)了37.64%的不動桿菌屬(Acinetobacter)和5.83%的乳球菌屬(Lactococcus)(圖6-d),雖然第45天腸道中也出現(xiàn)了不動桿菌屬,但相對豐度較低。此外,第45天大口黑鱸腸道中還存在7.42%的支原體(Mycoplasma)、5.82%的芽孢桿菌屬(Bacillus)和16.99%的腸桿菌屬(Enterobacter)。發(fā)育成為成熟個體(第180天)后,在大口黑鱸腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多個新優(yōu)勢菌群,分別為鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、大腸埃希菌屬-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、鯨桿菌屬(Cetobacterium)和檸檬酸桿菌屬(Citrobacter),占比分別為37.85%、23.21%、17.19%、9.00%和6.23%。

圖6 不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道中細菌屬的相對豐度

2.3.5 不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道細菌種類變化

LDA效應大小LEfSe方法用于比較4個階段之間大口黑鱸腸道中所有檢測到的細菌類群的相對豐度。經(jīng)多次試驗調(diào)整后的Kruskal-Wallis秩和檢驗(P<0.05)和效應量分析(LDA評分>4)后檢測所有特征物種,確定了31、20和36個細菌分類群在3個比較組(LB5dph vs. LB25dph、 LB25dph vs. LB45dph、 LB45dph vs. LB180dph)中有顯著差異(圖7～圖9)。其中相比于第5天大口黑鱸,大多數(shù)變形菌門(61.90%)和所有的厚壁菌門在第25天的相對豐度更高(圖7);在食性轉(zhuǎn)變過程中,厚壁菌門和變形菌門在第25天相對豐度更高,而第45天軟壁菌門的相對豐度更高(圖8);到了第180天成魚階段,腸道中厚壁菌門和軟壁菌門相對豐度降低,未表現(xiàn)出顯著差異,而存在半數(shù)的變形菌門在該階段的相對豐度更高(圖9)。

a:LEfSe分析產(chǎn)生的分類學分支圖,圖中亮度和每個分類單元的豐度成正比;b:通過Kruskal-Wallis檢驗(P<0.05),LDA評分>4,直方圖中顯示的分類群豐度顯著不同。綠色:變形菌門中的細菌;紅色:厚壁菌門中的細菌;藍色:軟壁菌門中的細菌;紫色:放線菌門中的細菌;黃色:其他門中的細菌。下圖同。a:taxonomic cladogram produced from LEfSe analysis, brightness is proportional to abundance of each taxon;b: taxa shown in histogram are determined to differ significantly by Kruskal-Wallis (KW) sum-rank test (P<0.05) and have LDA score>4, the abundance of taxa shown in the histogram is significantly different. Green: bacteria in Proteobacteria; Red: bacteria in Firmicutes; Blue: bacteria in Tenericutes; Purple: bacteria in Actinobacteria; Yellow: bacteria in other phyla. The same as below.

圖8 線性判別分析效應大小分析比較了第25和45天2個階段之間大口黑鱸腸道中已確定的細菌類群的豐度

圖9 線性判別分析效應大小分析比較了第45和180天2個階段之間大口黑鱸腸道中已確定的細菌類群的豐度

為了確定哪些細菌受到轉(zhuǎn)食人工配合飼料的影響,我們計算了變形菌門、厚壁菌門和軟壁菌門下細菌物種的相對豐度(圖10、圖11)。試驗發(fā)現(xiàn),在第5天大口黑鱸中相對豐度更高的是變形菌門中的3個細菌物種,分別是糞桿菌屬某種(Faecalibacterium_sp.)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas_caviae)和維氏氣單胞菌(Aeromonas_veronii);第25天大口黑鱸中相對豐度更高的是變形菌門中3個細菌物種,分別是瓊氏不動桿菌(Acinetobacter_junii)、假單胞菌屬某種-CNE-2(Pseudomonas_sp._CNE_2)和變形假單胞菌(Pseudomonas_plecoglossicide),以及厚壁菌門中的1個細菌物種,格氏乳球菌(Lactococcus_garvieae);第45天大口黑鱸中相對豐度更高的是變形菌門中的2個細菌物種,分別是不動桿菌屬某種(Acinetobacter_sp.)和蒙氏假單胞菌(Pseudomonas_monteilii),以及軟壁菌門中的1個細菌,未培養(yǎng)-支原體屬某種(uncultured_Mycoplasma_sp.);第180天相對豐度更高的是變形菌門中的3個細菌物種,分別是弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter_freundii)、克雷白氏桿菌屬-未分類(Klebsiella_unclassified)、鄰單胞菌屬-未分類(Plesiomonas_unclassified)和大腸埃希菌-志賀氏菌屬-未分類(Escherichia_Shigella_unclassified),但細菌Escherichia_Shigella_unclassified相對豐度在4組之間并未存在顯著差異(P>0.05)。另外,氣單胞菌屬某種-VKM-B-2261(Aermononas_sp._VKM_B_2261)和未培養(yǎng)-氣單胞菌屬某種(uncultured_Aeromonas_sp.)在第5和25天大口黑鱸腸道中都存在,相對豐度顯著高于其他2組(P<0.05),而未培養(yǎng)-不動桿菌屬某種(uncultured_Acinetobacter_sp.)和假單胞菌屬某種-VS05-112(Pseudomonas_sp._VS05_112)在第25和45天大口黑鱸腸道中都顯著表達(P<0.05),但兩者之間不存在顯著差異(P>0.05)。

圖10 不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道中變形菌門下選定細菌物種的相對豐度

3 討 論

3.1 不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道發(fā)育及3種消化酶活性變化

腸道是魚類整個消化系統(tǒng)里最長的一段區(qū)系,是魚類消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所[23-24],腸道形態(tài)結構的正常發(fā)育是魚類腸道消化吸收功能和免疫屏障功能正常的重要保證。在本試驗中,從腸道組織切片觀察發(fā)現(xiàn),開口攝食階段(第5天)大口黑鱸腸道剛剛開始發(fā)育,各層結構界限模糊,但第25、45和180天腸道形態(tài)結構可以明顯的區(qū)分,且隨著養(yǎng)殖時間的推移,黏膜層中柱狀上皮細胞和杯狀細胞顯著增加,腸道絨毛高度也顯著增加,其中微絨毛結構的完善大大增加了柱狀上皮細胞的吸收能力,杯狀細胞能分泌消化酶和黏液來水解食物和保護上皮細胞[25]。這些結果表明,隨著養(yǎng)殖周期的延長,大口黑鱸腸道結構逐漸發(fā)育完善,褶皺增多,絨毛高度增加,接觸表面積增大,對食物的消化吸收能力不斷增強,有助于滿足大口黑鱸生長發(fā)育的營養(yǎng)所需。

圖11 不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道中厚壁菌門和軟壁菌門下選定細菌物種的豐度

研究表明,消化酶隨著魚類生長發(fā)育而不斷變化,消化酶的活性高低直接影響動物對飼料營養(yǎng)的利用程度,因此魚類腸道中消化酶活性的變化能很好地反映魚類生長狀況[26]。在本試驗中,從第5天開口攝食鹵蟲到適應人工配合飼料的第45天大口黑鱸,其腸道中淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶活性均表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢,說明苗種培育過程中大口黑鱸腸道消化能力減弱,對攝入的營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用率降低,可能是由于第25天大口黑鱸稚魚對攝食飼料的改變處于適應階段,其中配合飼料的營養(yǎng)物質(zhì)不易被直接消化吸收。而第5天大口黑鱸腸道消化酶活性高可能是因為攝入的鹵蟲通過自溶或作為激活大口黑鱸仔魚內(nèi)源性消化酶的酶原“供體”來協(xié)助消化過程[27]。因此,不同階段的大口黑鱸腸道消化酶活性的改變可能是導致仔稚魚死亡的原因之一[28]。此外,第45天大口黑鱸腸道淀粉酶活性顯著高于第5天仔魚,可能與腸道逐步發(fā)育和人工配合飼料中一定比例的淀粉含量對淀粉酶分泌具有的誘導作用有關[8]。

第180天大口黑鱸成魚腸道消化酶活性最高,這可能是因為商品化配合飼料中各營養(yǎng)成分搭配合理,能夠很好地滿足大口黑鱸生長所需,有利于消化和吸收;以及大口黑鱸成魚的可消化能需求量大,攝食量增加,腸道結構發(fā)育成熟,可以分泌大量的消化酶來分解食物[29-30]。但胰蛋白酶活性相比于第5天大口黑鱸未有顯著差異,可能是因為鹵蟲富含大量動物蛋白質(zhì),在大口黑鱸生長發(fā)育中最優(yōu)先被利用,需要更高的胰蛋白酶活性。

3.2 不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道中微生物群組成結構變化

腸道是一個復雜的系統(tǒng),腸道中微生物與宿主之間存在專性共生和兼性寄生關系[31],它們在宿主的生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝、免疫功能和抵抗病菌的入侵方面有著不可或缺的作用[32]。魚類腸道菌群的數(shù)量和組成結構受許多因素的影響,其中攝食飼料對腸道微生物的影響最大[32]。因此,研究不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道中微生物群落組成的變化,可以了解大口黑鱸魚種對食性轉(zhuǎn)變的適應過程,以及腸道微生物在維持大口黑鱸腸道健康中的作用。

魚類對飼料營養(yǎng)的需求與腸道菌群的組成密切相關[33]。人工配合飼料所使用的階段及配比,在魚體里面的消化吸收、中間產(chǎn)物以及自身攜帶的微生物等都不同,這些都顯著影響著魚類的腸道微生物種群結構[34]和腸道健康狀況[25]。本試驗中,第5、25、45和180天4個階段的大口黑鱸腸道樣本中微生物豐富度差異顯著,開口攝食、轉(zhuǎn)食和適應人工配合飼料,成魚養(yǎng)殖4個階段大口黑鱸的腸道微生物多樣性也表現(xiàn)出明顯的差異,其中第25天大口黑鱸腸道中有著最高水平的微生物多樣性和豐富度,可能是因為攝食混合飼料的大口黑鱸腸道內(nèi)環(huán)境適合更多的菌群定植。第45天的大口黑鱸腸道的微生物多樣性和豐富度都要低于第5天仔魚,這代表著人工配合飼料改變了大口黑鱸腸道中微生物群落的組成。郁二蒙等[35]研究也觀察到類似的結果,對大口黑鱸魚苗投喂冰鮮雜魚和人工配合飼料,發(fā)現(xiàn)飼料組大口黑鱸腸道微生物多樣性顯著降低。多項研究表明,β-多樣性指數(shù)隨著飼料成分的改變而變化[36-37]。在本試驗中,第5、25、45和180天大口黑鱸腸道樣本的PCoA結果顯示,食性轉(zhuǎn)變和生長發(fā)育對大口黑鱸腸道微生物群落有著一定的影響,4個階段的大口黑鱸樣本之間距離較遠,微生物組成結構差異性較大,這表明轉(zhuǎn)食過程會影響到大口黑鱸腸道微生態(tài)結構,在其他受到攝食飼料變化影響的動物研究中也觀察到類似的結果[38-39]。同時,本研究中某些微生物類群組成差異可能是我們使用了不同的采樣方法(第5天仔魚為整魚樣本,而第25、45和180天為腸道樣本)所造成的。

在本試驗中,4組大口黑鱸腸道中共鑒定出5個主要的細菌門類:變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門、軟壁菌門和擬桿菌門。Desai等[40]對飼喂用植物蛋白質(zhì)替代水產(chǎn)飼料中魚粉的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)腸道微生物組進行了鑒別,發(fā)現(xiàn)主要的細菌門為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門。Zhu等[36]研究飼料蛋白質(zhì)水平對吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)腸道菌群組成的影響時發(fā)現(xiàn)梭桿菌門、擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門4種主要的細菌門類。此外,李英英等[41]發(fā)現(xiàn)大黃魚(Pseudosciaenacrocea)腸道中的主要菌門是變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門和擬桿菌門。不同研究鑒別出的細菌門類的相對豐度各不相同,這些差異的原因可能與飼料、性別、年齡、生長環(huán)境等有關[42-44]。

研究表明,腸道雖然是機體抵御病原體的第1道防線,但也被認為是病原微生物入侵的主要門戶[45],因此,腸道功能和結構的完整性和穩(wěn)定性對動物體健康至關重要。腸道中的細菌、真菌、原生動物和病毒等微生物以協(xié)同、拮抗或共生關系相互作用,形成穩(wěn)定的腸道內(nèi)環(huán)境[46]。穩(wěn)定的腸道細菌群落是宿主抵抗病原菌入侵并發(fā)揮各種生物學功能的先決條件[47-48],但如果腸道微生物群失調(diào),會引起腸道屏障通透性改變,內(nèi)毒素分泌增加,誘導微生物群與宿主之間的穩(wěn)態(tài)平衡向促炎狀態(tài)轉(zhuǎn)變[49-50]。在本試驗中,細菌門分類水平上,4個階段的大口黑鱸腸道微生物群組成差異不大,其中80%以上為變形菌門,這與Larsen等[51]研究結果類似,認為變形菌門是大口黑鱸“核心腸道微生物群”中最重要的一部分。但在細菌屬分類中,4個階段的大口黑鱸腸道微生物群組成表現(xiàn)出明顯的差異,表明轉(zhuǎn)食人工配合飼料引起了腸道微生物群的改變。大口黑鱸開口攝食鹵蟲,腸道內(nèi)環(huán)境處于相應的穩(wěn)態(tài)平衡,各系統(tǒng)和器官之間相互協(xié)調(diào),腸道特有的屏障功能保護機體免受其他細菌和有毒物質(zhì)的危害[52],但由于人工配合飼料的加入,腸道微生物群組成發(fā)生了改變,微生態(tài)平衡被打破,引起腸道屏障功能受損和免疫力下降,進而增加對病原菌的易感性[53-54],這可能是大口黑鱸苗種培育工作難度大、死亡率高的原因之一。

變形菌門是魚類腸道中主要微生物門之一,在魚類營養(yǎng)代謝中發(fā)揮重要的作用,而它們的生態(tài)失調(diào)與腸道代謝和炎癥疾病有關[55-56]。在本試驗中,大口黑鱸腸道中鑒定出屬于該門的7個屬類,分別是氣單胞菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、腸桿菌屬、領單胞菌屬、克雷伯氏菌屬和檸檬酸桿菌屬。其中氣單胞菌屬的相對豐度隨著食性轉(zhuǎn)變和發(fā)育在大口黑鱸腸道內(nèi)發(fā)生了極顯著的變化,第5天大口黑鱸仔魚腸道中氣單胞菌屬相對豐度最高,且該屬下2個菌種,豚鼠氣單胞菌和維氏氣單胞菌相對豐度顯著高于第25天大口黑鱸稚魚。Zhu等[57]發(fā)現(xiàn),維氏溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的混合感染會引起潘陽湖野生花鼓魚(Hemibarbusmaculatus)的不斷死亡。Van Zwetselaar等[58]研究也表明,盡管氣單胞菌的致病性和毒力在該屬物種之間有著較大的差異,但往往都與動物體胃腸道感染有關。因此,我們認為大口黑鱸仔魚期死亡可能是高相對豐度的氣單胞菌群引起的腸道感染所導致的。

在大口黑鱸的4個養(yǎng)殖階段之間,第25天大口黑鱸腸道內(nèi)變形菌門下假單胞菌屬(變形假單胞菌)、腸桿菌屬和不動桿菌屬(瓊氏不動桿菌)相對豐度表現(xiàn)更高。而變形假單胞菌是常見的水產(chǎn)生物致病菌,會誘發(fā)香魚(Plecoglossusaltivelis)的岀血性腹水病[59]和斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)的內(nèi)臟白點病[60]等;不動桿菌屬也是一種重要的條件致病菌,當動物體抵抗力降低時易引發(fā)機體感染[61],其中瓊氏不動桿菌可以與其他病原菌一起對石鰈(Kareiusbicoloratus)和牙鲆(Paralichthysolivaceus)有著較強的致病作用[62]。此外,其他腸道細菌如腸桿菌數(shù)量的上升也會使得腸道炎癥反應持續(xù)存在[63]。因此,苗種培育過程中食性改變引起了第25天大口黑鱸腸道微生物的生態(tài)失調(diào),進而誘導大口黑鱸對腸道炎癥的易感性,而在這種受損的腸組織中,腸道細菌如假單胞菌和腸桿菌等可能會通過從成熟細胞中獲取營養(yǎng)來快速生長,降低魚體免疫力,從而使炎癥反應持續(xù)下去[64],導致大口黑鱸的持續(xù)死亡。此外,本試驗中,第25天大口黑鱸稚魚腸道內(nèi)厚壁菌門的相對豐度顯著高于第5天大口黑鱸仔魚,而厚壁菌門被證實在代謝紊亂的病理變化中發(fā)揮重要作用[65]。其中厚壁菌門下乳球菌屬中格氏乳球菌在第25天大口黑鱸腸道中表現(xiàn)出較高相對豐度,它是乳球菌病的病原體,常常引起虹鱒[66]、梭魚(Lizahaematocheila)[67]和牙鲆[68]的組織病變和出血性敗血癥等病癥。

在本試驗中,相比于第5和25天大口黑鱸,第45和180天魚腸道中氣單胞菌屬相對豐度極低。其中第45天魚腸道中蒙氏假單胞菌和軟壁菌門中細菌相對豐度更高。蒙氏假單胞菌是革蘭氏陰性菌,它產(chǎn)生的活性物質(zhì)能對病毒產(chǎn)生鈍化作用,使病毒粒體缺乏完整性,從而無法在寄主體內(nèi)增殖,降低病毒的侵染能力[69],并具有利用多種油脂生長增殖的能力[70]。此外,第45天幼魚腸道中還存在芽孢桿菌屬,該屬中某些種類在魚體內(nèi)能起到抗氧化的作用[71]。這些結果表明,適應了人工配合飼料的大口黑鱸,腸道中有益菌群相對豐度增加,有助于提高魚體免疫力,抵御病原體的侵襲。雖然第180天和第45天大口黑鱸都飼喂人工配合飼料,但腸道微生物群落組成結構依舊具有一定的差異,這可能是受到飼料粒徑、腸道發(fā)育和生理狀態(tài)[72]等因素的影響。

4 結 論

本研究利用16S rDNA微生物多樣性和腸道組織切片以及酶活性檢測等手段,比較分析不同養(yǎng)殖階段的大口黑鱸腸道結構和腸道微生物群組成。結果表明,隨著大口黑鱸的養(yǎng)殖周期的延長,腸道結構不斷完善,絨毛高度增大,褶皺增多,消化吸收功能增強。此外,食性轉(zhuǎn)變和生長發(fā)育顯著改變了大口黑鱸腸道消化酶活性和微生物群落組成,苗種培育初期轉(zhuǎn)食人工配合飼料導致了腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失調(diào),變形假單胞菌、瓊氏不動桿菌和格氏乳球菌等容易誘發(fā)腸道炎癥和敗血癥的細菌相對豐度顯著升高;但隨著人工配合飼料的適應,大口黑鱸會調(diào)整進入新的穩(wěn)態(tài)。本研究有助于更好地了解大口黑鱸苗種培育過程,但是關于人工配合飼料成分、腸道微生物和大口黑鱸代謝之間的復雜關系還需要進一步的研究來闡述。