過(guò)瘤胃煙酰胺對(duì)育肥羊腸道形態(tài)、屏障和轉(zhuǎn)運(yùn)功能以及揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

張藝偉 馬智聰* 韓 強(qiáng) 褚玲娜 李浙烽 馮長(zhǎng)東 吳 昊 王 翀** 魏筱詩(shī)**

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,杭州 311300;2.浙江省長(zhǎng)興縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,長(zhǎng)興 313100;3.長(zhǎng)興縣畜牧獸醫(yī)站,長(zhǎng)興 313199;4. 杭州康德權(quán)飼料有限公司,杭州 311107)

湖羊是我國(guó)一級(jí)保護(hù)地方畜禽品種[1],今廣泛存在太湖流域及臨近地區(qū)[2-3],具有發(fā)育快、性早熟、四季發(fā)情、多胎且耐高溫高濕等優(yōu)良性狀[4-5]。湖羊產(chǎn)業(yè)鏈對(duì)我國(guó)羊肉、羊毛、羔皮等貢獻(xiàn)巨大[6]。內(nèi)蒙古、新疆、甘肅、貴州等省區(qū)實(shí)施退耕還草工程時(shí)需引進(jìn)優(yōu)良品種,湖羊成為首選品種之一,浙江湖州的供種量約10萬(wàn)頭以上,可占到整省供給的65%[7-8]。湖羊是浙江優(yōu)勢(shì)地方品種,省內(nèi)以湖州居多,在2015年農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)對(duì)“湖州湖羊”實(shí)施國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志登記保護(hù)。

腸道是反芻動(dòng)物重要的消化器官,大量的過(guò)瘤胃營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在后腸道消化吸收[9],小腸營(yíng)養(yǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)可影響過(guò)瘤胃營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在腸道的轉(zhuǎn)運(yùn),從而影響機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝[10-12]。此外,腸道上皮是機(jī)體抵御外源性病原體的重要屏障[13-14]。因此,腸道的健康及其組織結(jié)構(gòu)的完整性,對(duì)于反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收與屏障抵御功能有重要作用[15]。

煙酰胺(nicotinamide, NAM)是維生素B3的衍生物[16-17],作為輔酶Ⅰ與輔酶Ⅱ的前體物質(zhì)參與脂代謝、糖代謝以及蛋白質(zhì)代謝[18-21]。研究表明,NAM能改善肉雞空腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu),促進(jìn)消化吸收,并改善小腸的黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)[22]。此外,補(bǔ)飼NAM可促進(jìn)羔羊小腸形態(tài)發(fā)育,提高空腸葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT2)、鈉-葡萄糖共同轉(zhuǎn)運(yùn)體1(SGLT1)和回腸GLUT2的基因相對(duì)表達(dá)量[23]。前期研究中發(fā)現(xiàn),補(bǔ)飼過(guò)瘤胃煙酰胺(rumen protected NAM,RPN)能夠顯著增加育肥湖羊平均日增重及心臟、肝臟和脾臟重量,顯著提高肝臟指數(shù)以及胴體重,并且顯著降低育肥湖羊背最長(zhǎng)肌的黃度值,改善其屠宰性能[24]。本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上,探究RPN對(duì)育肥湖羊腸道結(jié)構(gòu)形態(tài)、屏障功能、轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)以及后腸道內(nèi)容物揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)含量的影響,旨在為NAM在湖羊生產(chǎn)中的應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

選取16只體況良好、體重[(20.45±1.18) kg]相近的健康育肥公湖羊,隨機(jī)分為2組,分別為對(duì)照組(飼喂基礎(chǔ)飼糧)和試驗(yàn)組(額外添加1 g/d RPN),每組8只。RPN由杭州某飼料有限公司提供(NAM含量為60%,過(guò)瘤胃率為83.6%)。RPN于每日08:00晨飼前撒在一小部分基礎(chǔ)飼糧上,用手誘導(dǎo)湖羊采食,保證湖羊采食完全后再飼喂基礎(chǔ)飼糧?；A(chǔ)飼糧每日飼喂2次(08:00和14:00),湖羊自由進(jìn)食和飲水。預(yù)試期7 d,正試期90 d。基礎(chǔ)飼糧為商品化育肥期飼糧(營(yíng)養(yǎng)成分等詳見(jiàn)朱錦鵬等[24]發(fā)表的文章)。

1.2 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束后,屠宰所有湖羊采集樣品。屠宰前湖羊禁食12 h,自由飲水。分離湖羊的十二指腸、空腸、回腸和盲腸,用于后續(xù)測(cè)定。剪取回腸和盲腸的中段腸管,取其內(nèi)容物放于凍存管,迅速置于液氮中,后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存,用于空腸和盲腸內(nèi)容物的VFA含量分析。

1.2.1 腸道組織形態(tài)的觀察

石蠟切片的制作及蘇木精-伊紅(HE)染色參考Zhang等[25]的方法,經(jīng)過(guò)組織梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋等一系列步驟制作空腸與回腸組織石蠟切片,最后進(jìn)行HE染色。使用正倒置一體熒光顯微鏡觀察腸道形態(tài)結(jié)構(gòu),對(duì)絨毛高度、隱窩深度與肌層厚度進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算絨毛高度與隱窩深度的比值(絨隱比)。

1.2.2 緊密連接蛋白表達(dá)測(cè)定

取空腸和回腸組織樣,使用細(xì)胞組織快速裂解液(RIPA)提取總蛋白,并測(cè)定蛋白濃度(BCA法,Protein Assay Kit, Thermo)。按照雅酶凝膠快速制備試劑盒進(jìn)行制膠,分離蛋白樣品,轉(zhuǎn)膜(聚偏二氟乙烯膜),封閉,孵育一抗二抗,曝光顯色,并采用Image J計(jì)算各組灰度值,用于數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 腸道葡萄糖、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)測(cè)定

使用TaKaRa RNAios Plus(Total RNA提取試劑)試劑盒提取各腸段組織的總RNA,測(cè)定RNA濃度和質(zhì)量后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser,TaKaRa)。葡萄糖、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相關(guān)基因的特異性引物序列見(jiàn)表1。使用TB Green Premix Ex Taq(TaKaRa)試劑盒檢測(cè)相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量,反應(yīng)體系為10 μL。

表1 葡萄糖、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相關(guān)基因的引物序列

1.2.4 腸道VFA含量的測(cè)定

腸道內(nèi)容物VFA含量的測(cè)定參考Kristensen等[26]的方法,正磷酸酸化后的空腸、盲腸內(nèi)容物樣品于冰上解凍,在4 ℃、13 000×g條件下離心10 min,吸取上清液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過(guò)濾后注入氣相色譜進(jìn)樣瓶,于氣相色譜儀(Agilent7890BGC)上機(jī)分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)初步整理,應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),Graphpad prism進(jìn)行圖片繪制。結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示,P<0.05為差異顯著,0.05≤P<0.10為差異有顯著的趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPN對(duì)湖羊腸道組織形態(tài)的影響

湖羊空腸及回腸的HE染色切片如圖1所示,所有試驗(yàn)組湖羊腸道結(jié)構(gòu)與形態(tài)完整。由表2可知,與CON組相比,RPN組湖羊空腸絨毛高度和肌層厚度顯著提高(P<0.05),隱窩深度與絨隱比均無(wú)顯著差異(P>0.05)。由表3可知,與CON組相比,RPN組湖羊回腸絨毛高度、隱窩深度、絨隱比及肌層厚度均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖中A和B分別為空腸和回腸,1、2、3分別為腸絨毛、隱窩和肌層。

表2 RPN對(duì)湖羊空腸形態(tài)的影響

表3 RPN對(duì)湖羊回腸形態(tài)的影響

2.2 RPN對(duì)湖羊空腸、回腸黏膜緊密連接蛋白表達(dá)的影響

如圖2-A所示,與CON組相比,RPN組空腸黏膜中封閉蛋白-2(Claudin-2)與閉合蛋白(Occludin)的蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05);如圖2-B所示,RPN組回腸黏膜中Claudin-2與Occludin的蛋白表達(dá)水平與CON組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。

Claudin-2:閉合蛋白-2;Occludin:閉鎖蛋白;β-actin:β-肌動(dòng)蛋白。

2.3 RPN對(duì)湖羊十二指腸、空腸和回腸葡萄糖、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響

由表4可知,與CON組相比,RPN組十二指腸的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(SLC38A2)基因相對(duì)表達(dá)量具有增加趨勢(shì)(P=0.094),溶質(zhì)載體家族6成員19(SLC6A19)(P=0.053)、溶質(zhì)載體家族3成員2(SLC3A2)(P=0.066)的基因相對(duì)表達(dá)量均具有降低趨勢(shì)。

表4 RPN對(duì)湖羊十二指腸葡萄糖、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響

由表5可知,與CON組相比,RPN組空腸GLUT2和鈉-葡萄糖共同轉(zhuǎn)運(yùn)體1(SGLT1)基因相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。

由表6可知,與CON組相比,RPN組回腸GLUT2、SLC38A2、溶質(zhì)載體家族1成員5(SLC1A5)的基因相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05),SGLT1的基因相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。

表5 RPN對(duì)湖羊空腸葡萄糖、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響

表6 RPN對(duì)湖羊回腸葡萄糖、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響

2.4 RPN對(duì)湖羊空腸和盲腸VFA含量的影響

由表7可知,RPN組空腸的異戊酸和異位酸含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05),乙酸(P=0.058)和總揮發(fā)性脂肪酸含量(P=0.077)均具有增加的趨勢(shì)。

表7 RPN對(duì)湖羊空腸揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

由表8可知,與CON組相比,RPN組盲腸的各VFA含量、乙酸/丙酸和總揮發(fā)性脂肪酸含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 RPN對(duì)湖羊腸道組織形態(tài)的影響

腸道良好的結(jié)構(gòu)形態(tài)是動(dòng)物機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的重要保證[27],尤其是小腸的絨毛和隱窩結(jié)構(gòu),它們是判別反芻動(dòng)物機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的重要標(biāo)準(zhǔn)[28];除此之外,小腸的吸收功能會(huì)被小腸的收縮運(yùn)動(dòng)所影響,并且其肌層厚度一發(fā)生變化就會(huì)直接影響到小腸的收縮運(yùn)動(dòng)[29]。本試驗(yàn)在育肥湖羊飼糧中添加RPN能顯著提高空腸的絨毛高度與肌層厚度。研究顯示,NAM能提高仔鼠十二指腸和空腸的絨隱比[30]。在肉雞飼糧中補(bǔ)飼60、90 mg/kg NAM增加了肉雞空腸絨毛高度[22]。趙會(huì)會(huì)[23]的研究表明,在圍產(chǎn)后期奶山羊飼糧中添加5 g/d NAM提高了羔羊十二指腸和空腸的絨毛高度。這些結(jié)果表明,飼糧中添加RPN可改善湖羊腸道形態(tài)和促進(jìn)腸道發(fā)育。

表8 RPN對(duì)湖羊盲腸揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

腸道黏膜屏障的完整性能夠抵抗腸道有害病菌的入侵[31],而緊密連接蛋白是構(gòu)成腸屏障的重要蛋白分子,與腸道通透性息息相關(guān)[32]。其中,最主要的緊密連接蛋白是Occludin家族和Claudin家族等[33]。NAM是煙酸(nicotinic acid,NA)的酰胺形式。斷奶仔豬補(bǔ)飼NA可以增加小腸Occludin與Claudin-1的基因相對(duì)表達(dá)量[34]。動(dòng)物補(bǔ)飼NA可通過(guò)介導(dǎo)沉默調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)等能量代謝信號(hào)通路提高腸道上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá),從而促進(jìn)腸道黏膜屏障功能損傷修復(fù)[35]。SIRT1是NAD+依賴(lài)性蛋白脫乙酰酶,其活性可影響APMK的激活[36],也可抑制促炎癥因子的表達(dá)[37],隨著NAD+的濃度提高,腸道干細(xì)胞SIRT1的活性增加,使腸道上皮細(xì)胞促炎癥因子的表達(dá)下降,SIRT1迅速活化激活細(xì)胞核內(nèi)的AMPK,促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖,提高腸道上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)[38-39]。本試驗(yàn)中,添加RPN后能使空腸黏膜中Claudin-2與Occludin的蛋白表達(dá)水平顯著增加,表明RPN在維持腸道屏障緊密連接功能方面起著重要作用,我們推測(cè)添加RPN可能通過(guò)增加體內(nèi)NAD+濃度改善腸道屏障,有待進(jìn)一步明確。

3.2 RPN對(duì)湖羊腸道轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的影響

RPN可以改善腸道形態(tài),提高腸道緊密連接蛋白的表達(dá)量,推測(cè)可能會(huì)影響腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。因此,本試驗(yàn)中檢測(cè)了十二指腸、空腸、回腸的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)。轉(zhuǎn)運(yùn)載體的相對(duì)表達(dá)量是衡量小腸吸收能力的重要指標(biāo)[40],進(jìn)入小腸的蛋白質(zhì)、脂肪以及碳水化合物會(huì)被消化酶降解為游離的氨基酸、果糖和葡萄糖等[41],然后通過(guò)相應(yīng)的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)載體的轉(zhuǎn)運(yùn)被小腸上皮細(xì)胞吸收,繼而進(jìn)入血液循環(huán)以供機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育及代謝使用[12]。前期研究顯示,添加NAM能提高羔羊空腸葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT5、SGLT1與回腸GLUT2的基因相對(duì)表達(dá)量,與本試驗(yàn)結(jié)果相似,但對(duì)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)無(wú)顯著影響[23]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),NAM可能影響氨基酸代謝[42],本試驗(yàn)中提高的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)一定程度支持了氨基酸代謝改變的結(jié)果。在機(jī)體內(nèi),NAD+和NADP+可作為輔酶參與糖酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑,外源補(bǔ)充N(xiāo)AM可提高體內(nèi)NAD+的濃度,進(jìn)而參與機(jī)體糖代謝[43-44]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,RPN提高腸道葡萄糖、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá),表明RPN可能促進(jìn)育肥湖羊?qū)ζ咸烟恰被岬鹊奈铡?/p>

3.3 RPN對(duì)湖羊腸道VFA含量的影響

腸道內(nèi)容物中的VFA是腸道微生物對(duì)碳水化合物的降解產(chǎn)物[45],能夠調(diào)節(jié)腸道pH,抑制有害病菌的增殖[46],保護(hù)腸道黏膜屏障[47],還能夠?yàn)閯?dòng)物機(jī)體和腸道細(xì)胞提供能源[48]。目前RPN對(duì)腸道VFA影響的研究較少,大多是NA對(duì)瘤胃VFA含量影響的研究。在水牛的精料混合物中添加NAM和NA,能提高胃腸道的總VFA濃度和VFA中丙酸比例[49]。楊艷等[50]研究發(fā)現(xiàn),適量添加NA能夠使瘤胃中總VFA、丙酸含量增加,降低乙酸/丙酸。本試驗(yàn)中,添加RPN能夠提高VFA含量以及乙酸/丙酸,推測(cè)丙酸可能在瘤胃被吸收,導(dǎo)致腸道中乙酸/丙酸升高?？漳c和盲腸的VFA含量變化不同可能與腸道內(nèi)微生物種類(lèi)、NAM水平以及腸道pH有關(guān)。上述結(jié)果表明,RPN能夠提高湖羊腸道VFA的含量。添加NA發(fā)現(xiàn)乙酸含量與瘤胃原生動(dòng)物數(shù)量呈負(fù)相關(guān)[51]。有研究表明,添加NA能夠影響腸內(nèi)菌的數(shù)量,可能改善腸道發(fā)酵[52-53]。所以,本試驗(yàn)推測(cè)RPN可能促進(jìn)腸道微生物的生長(zhǎng)與增殖,提高微生物蛋白產(chǎn)量[54],以維持腸道內(nèi)VFA之間的比例;此外,RPN也有可能通過(guò)影響NAD+和NADP+濃度影響腸道發(fā)酵環(huán)境[55]。

4 結(jié) 論

綜上所述,育肥湖羊補(bǔ)飼1 g/d RPN可改善其腸道形態(tài),促進(jìn)腸道屏障緊密連接和后腸道發(fā)酵;此外,還能夠提高湖羊腸道葡萄糖、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá),可能促進(jìn)腸道對(duì)葡萄糖等的吸收。