胍基乙酸對(duì)育肥豬生長(zhǎng)性能、屠宰性能、血清生化指標(biāo)、肌纖維特性及肌肉發(fā)育相關(guān)調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)的影響

段浩楠 武殿閣 申帥峰 王雨佳 閆曉棟 陳寶江*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,保定 071001;2.河北廣瑞生物制品有限公司,石家莊 051500)

提高畜禽生長(zhǎng)性能是畜牧業(yè)永恒的目標(biāo),也是當(dāng)今社會(huì)和消費(fèi)者的共同訴求。我國(guó)是世界上豬肉最大的生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)[1],隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,消費(fèi)者對(duì)豬肉瘦肉率的需求不斷提高。因此,提高豬肉,特別是瘦肉產(chǎn)量是生豬養(yǎng)殖的主要趨勢(shì)[2]。瘦肉率的提高與骨骼肌的發(fā)育密切相關(guān),骨骼肌的基本功能單位是肌纖維,其發(fā)育與成肌細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)[3]。肌纖維的發(fā)育受營(yíng)養(yǎng)水平、外源性營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充、運(yùn)動(dòng)等因素的調(diào)節(jié)。近年來(lái),應(yīng)用外源性營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充調(diào)控瘦肉率的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注[4]。

胍基乙酸(guanidine acetic acid,GAA)又名胍乙酸[5],是一種新型營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑,是合成肌酸(creatine,Cr)及磷酸肌酸在體內(nèi)的直接前體。補(bǔ)充胍基乙酸能提高機(jī)體肌酸、磷酸肌酸和ATP含量[6-8],為動(dòng)物生長(zhǎng)和肌纖維發(fā)育提供了更多的能量。此外,胍基乙酸還具有提高動(dòng)物肉品質(zhì)、屠宰性能、抗氧化能力以及改善能量代謝等作用[9-12]。胍基乙酸由于安全無(wú)害、穩(wěn)定性好、易于吸收、價(jià)格低廉,被應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn),并表現(xiàn)出良好效果[13-14]。胍基乙酸合成肌酸過(guò)程中需要甲基供體提供甲基,同時(shí)會(huì)生成同型半胱氨酸[15]。甜菜堿又稱(chēng)三甲基甘氨酸,能將自身甲基轉(zhuǎn)移給同型半胱氨酸進(jìn)而重新生成蛋氨酸,促進(jìn)胍基乙酸合成肌酸[16]。目前胍基乙酸和甜菜堿在動(dòng)物生產(chǎn)上聯(lián)合應(yīng)用主要集中于改善能量代謝、瘤胃發(fā)酵和肉品質(zhì)[16-17],而對(duì)肌肉生長(zhǎng)研究較少。因此,本試驗(yàn)通過(guò)研究單獨(dú)添加胍基乙酸及聯(lián)合添加胍基乙酸和甜菜堿對(duì)育肥豬生長(zhǎng)性能和肌纖維發(fā)育的影響,為胍基乙酸在動(dòng)物生產(chǎn)中提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

胍基乙酸(有效含量≥98%)和甜菜堿(有效含量≥98%)均由石家莊某生物制品有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇體重[(86.00±1.00) kg]相近的杜長(zhǎng)大三元雜交育肥豬48頭,隨機(jī)分為3組,每組4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)4只豬(公母各占1/2)。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧,T1組在基礎(chǔ)飼糧中添加500 mg/kg胍基乙酸,T2組在基礎(chǔ)飼糧中添加500 mg/kg胍基乙酸+200 mg/kg甜菜堿。預(yù)試期3 d;正試期從預(yù)試期結(jié)束至對(duì)照組育肥豬達(dá)到110 kg出欄體重,為38 d?；A(chǔ)飼糧參照NRC(2012)肥育豬的營(yíng)養(yǎng)需要配制,其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于邯鄲市曲周縣中道農(nóng)牧有限公司進(jìn)行。試驗(yàn)前做好消毒準(zhǔn)備工作,試驗(yàn)正式開(kāi)始后,每日飼喂2次,自由飲水。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)性能

分別于試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)稱(chēng)重并記錄,記錄每天采食量,計(jì)算平均日增重(average daily gain,ADG)、平均日采食量(average daily feed intake,ADFI)和料重比(feed to gain ratio,F/G)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.4.2 屠宰性能

試驗(yàn)結(jié)束后,每個(gè)重復(fù)選取1頭接近平均體重的育肥豬進(jìn)行屠宰,參考《豬胴體性狀測(cè)定技術(shù)規(guī)范》(NY/T 825—2004)[18]測(cè)定宰前活重、胴體重、屠宰率、平均背膘厚度、眼肌面積、胴體直長(zhǎng)和胴體斜長(zhǎng)。

1.4.3 血清生化指標(biāo)

正式試驗(yàn)第19天和第38天,每個(gè)重復(fù)選取1頭接近平均體重的育肥豬,前腔靜脈采血5 mL,3 500 r/min離心10 min,取上清液后分裝于離心管,-80 ℃保存。血清總蛋白、白蛋白、尿素、葡萄糖、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯含量均采用江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司試劑盒測(cè)定,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.4 肌纖維特性

取經(jīng)10%中性甲醛溶液固定的背最長(zhǎng)肌樣品,依次經(jīng)過(guò)脫水、修剪、包埋、切片、染色和封片后,拍攝圖像并采集200倍圖片,通過(guò)Motic Images Advanced 3.2進(jìn)行分析,測(cè)量肌纖維直徑和橫截面積。

1.4.5 肌肉發(fā)育相關(guān)調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)

屠宰后采集背最長(zhǎng)肌肉樣,立即放入液氮罐凍存,隨后保存于-80 ℃冰箱。采用Trizon法提取背最長(zhǎng)肌中總RNA后檢測(cè)其濃度、純度和完整性。檢測(cè)合格后用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,所有引物由上海派森諾生物科技股份有限公司合成,實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列見(jiàn)表2。采用EDC-810型PCR儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)進(jìn)行分析。反應(yīng)體系:cDNA 1 μL,上、下游引物各0.4 μL,2×SYBR real-time PCR premixture 10 μL,補(bǔ)加RNase free ddH2O至20 μL。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因,采用2-△△Ct法[19]計(jì)算肌肉發(fā)育相關(guān)調(diào)節(jié)因子[肌細(xì)胞生成素(MyoG)、生肌決定因子(MyoD)、生肌因子5(Myf5)和肌肉生長(zhǎng)抑制素(MSTN)]基因相對(duì)表達(dá)量。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,P<0.05表示差異顯著,0.05≤P<0.10表示有趨勢(shì)。

2 結(jié) 果

2.1 胍基乙酸對(duì)育肥豬生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知,T1組和T2組的末重、平均日增重和平均日采食量顯著高于對(duì)照組(P<0.05);T1組和T2組的料重比顯著低于對(duì)照組(P<0.05),且T2組的料重比顯著低于T1組(P<0.05)。

2.2 胍基乙酸對(duì)育肥豬屠宰性能的影響

由表4可知,與對(duì)照組相比,T2組的胴體重有升高的趨勢(shì)(P=0.079)。T1組和T2組的屠宰率和眼肌面積顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。各組之間宰前活重、背膘厚度、胴體直長(zhǎng)、胴體斜長(zhǎng)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.3 胍基乙酸對(duì)育肥豬血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知,與對(duì)照組相比,T1組和T2組的第19天血清低密度脂蛋白含量有降低的趨勢(shì)(P=0.084)。T1組和T2組的第38天血清尿素含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05);T1組和T2組的第38天血清總蛋白含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05),且T2組的第38天血清總蛋白含量顯著低于T1組(P<0.05)。

2.4 胍基乙酸對(duì)育肥豬肌纖維特性的影響

由表6可知,各組之間肌纖維直徑無(wú)顯著差異(P>0.05)。T1組和T2組的肌纖維橫截面積顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表3 胍基乙酸對(duì)育肥豬生長(zhǎng)性能的影響

表4 胍基乙酸對(duì)育肥豬屠宰性能的影響

表5 胍基乙酸對(duì)育肥豬血清生化指標(biāo)的影響

表6 胍基乙酸對(duì)育肥豬肌纖維特性的影響

2.5 胍基乙酸對(duì)育肥豬肌肉發(fā)育相關(guān)調(diào)節(jié)因子表達(dá)的影響

由表7可知,T2組的肌肉MyoG基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。各組之間肌肉MSTN、MyoD基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比,T2組的肌肉Myf5基因相對(duì)表達(dá)量有升高的趨勢(shì)(P=0.093)。

表7 胍基乙酸對(duì)育肥豬肌肉發(fā)育相關(guān)調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 胍基乙酸對(duì)育肥豬生長(zhǎng)性能的影響

生長(zhǎng)性能是衡量養(yǎng)豬經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo),提高生長(zhǎng)性能對(duì)于提高養(yǎng)豬競(jìng)爭(zhēng)力尤為關(guān)鍵。Jayaraman等[20]和Li等[21]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加胍基乙酸顯著提高了育肥豬的平均日增重和飼料效率;De Souza等[22]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加0.06%胍基乙酸顯著提高了肉雞的平均日增重、平均日采食量和飼料效率;Lin等[23]研究發(fā)現(xiàn),胍基乙酸能顯著提高牛蛙的末重。本試驗(yàn)結(jié)果表明,試驗(yàn)組育肥豬的末重、平均日增重和平均日采食量均顯著提高,料重比顯著降低,與前人報(bào)道結(jié)果[21,24-25]一致。這是因?yàn)樘砑与一宜峥梢詼p少體內(nèi)甘氨酸和精氨酸的消耗[26],為動(dòng)物生長(zhǎng)提供了更多的蛋白質(zhì);同時(shí),添加胍基乙酸可以提高機(jī)體肌酸和磷酸肌酸儲(chǔ)備,磷酸肌酸可迅速轉(zhuǎn)化為ATP為動(dòng)物生長(zhǎng)提供能量。此外,本試驗(yàn)結(jié)果表明,胍基乙酸基礎(chǔ)上補(bǔ)充甜菜堿,料重比顯著低于單獨(dú)添加胍基乙酸組。這可能是因?yàn)殡一宜嵩诤铣杉∷徇^(guò)程中需要蛋氨酸提供甲基,同時(shí)會(huì)生成同型半胱氨酸,甜菜堿可與同型半胱氨酸在甜菜堿同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶作用下重新生成蛋氨酸,促進(jìn)了肌酸的合成[16-17],從而為育肥豬生長(zhǎng)提供了更多的ATP。

3.2 胍基乙酸對(duì)育肥豬屠宰性能的影響

胴體重、屠宰率、胴體斜長(zhǎng)、胴體直長(zhǎng)是影響生豬生產(chǎn)的重要經(jīng)濟(jì)性狀,眼肌面積和背膘厚度是胴體瘦肉率的評(píng)價(jià)指標(biāo)。He等[27]研究發(fā)現(xiàn),隨著胍基乙酸添加量的增加,育肥豬胴體重和瘦肉百分比有升高趨勢(shì)。本研究結(jié)果表明,試驗(yàn)組育肥豬屠宰率和眼肌面積均顯著提高,且胍基乙酸基礎(chǔ)上補(bǔ)充甜菜堿組胴體重與對(duì)照組相比有升高的趨勢(shì),與Jayaraman等[20]報(bào)道一致。這可能是因?yàn)殡一宜釣榧∪馍L(zhǎng)提供了更多的肌酸、磷酸肌酸和ATP[27-29],提高了肌肉產(chǎn)量。另外,有研究發(fā)現(xiàn),生長(zhǎng)激素能直接促進(jìn)脂肪分解[30],減少胴體脂肪沉積,胍基乙酸還能促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌[5],進(jìn)而提高育肥豬眼肌面積。綜上所述,飼糧中添加胍基乙酸和甜菜堿能提高育肥豬屠宰率,促進(jìn)肌肉發(fā)育。

3.3 胍基乙酸對(duì)育肥豬血清生化指標(biāo)的影響

總蛋白、白蛋白、尿素含量可反映機(jī)體蛋白質(zhì)代謝和氨基酸平衡。Zhang等[31]研究發(fā)現(xiàn),在羔羊飼糧中添加胍基乙酸后,血清總蛋白含量顯著升高,血清尿素含量顯著降低。Ren等[24]報(bào)道,羔羊飼糧中添加胍基乙酸和甜菜堿能顯著提高血清總蛋白含量。本研究結(jié)果表明,試驗(yàn)組育肥豬第38天血清中總蛋白含量顯著升高,尿素含量顯著降低。這可能是因?yàn)殡一宜岷吞鸩藟A能夠提高胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)含量[32-34],激活了哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路,促進(jìn)了蛋白質(zhì)的合成[35],同時(shí)胰島素還能通過(guò)減少蛋白質(zhì)的分解來(lái)提高機(jī)體氮沉積。尿素含量降低的原因可能是胍基乙酸增加了微生物蛋白合成[24],促進(jìn)了非蛋白氮的利用。總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白是衡量血脂代謝的重要指標(biāo),低密度脂蛋白含量的升高會(huì)導(dǎo)致脂肪合成增多。本研究結(jié)果表明,試驗(yàn)組育肥豬第19天血清低密度脂蛋白含量有降低的趨勢(shì),與張翼[36]等研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)殡一宜岷吞鸩藟A通過(guò)影響脂肪酸合成酶(FAS)和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1(CPT-1)的基因表達(dá)[37],減少了脂肪的合成。

3.4 胍基乙酸對(duì)育肥豬肌纖維特性的影響

肌纖維的發(fā)育與肌纖維數(shù)量和肌纖維橫截面積有關(guān),豬的肌纖維數(shù)量在出生后不會(huì)發(fā)生改變,但會(huì)增粗和變長(zhǎng)[38]。Lu等[39]報(bào)道,飼糧中添加胍基乙酸可顯著提高育肥豬肌纖維橫截面積。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明,試驗(yàn)組肌纖維橫截面積均顯著高于對(duì)照組,與Li等[40]研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)檠a(bǔ)充胍基乙酸后,肌肉MyoG、Myf5等生肌因子的基因相對(duì)表達(dá)量提高[41],同時(shí)添加胍基乙酸能提高機(jī)體胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的含量,從而促進(jìn)肌肉內(nèi)蛋白的沉積,進(jìn)而促進(jìn)了肌肉的生長(zhǎng)和肌纖維的肥大。

3.5 胍基乙酸對(duì)育肥豬肌肉發(fā)育相關(guān)調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)的影響

骨骼肌的發(fā)育包括以下4個(gè)過(guò)程:中胚層干細(xì)胞分化產(chǎn)生成肌細(xì)胞[42]、成肌細(xì)胞分化融合產(chǎn)生肌管、肌纖維形成、肌纖維成熟[43]。肌細(xì)胞的增殖與分化是肌纖維發(fā)育過(guò)程中必不可少的過(guò)程,它決定了肌細(xì)胞的命運(yùn)和肌肉的最終結(jié)構(gòu)。骨骼肌的分化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程[44],由肌源性調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors,MRFs)調(diào)控[45]。MRFs家族包括Myf5、生肌因子4(Mrf4)、MyoD和MyoG[46]。MyoD和Myf5基因主要在成肌細(xì)胞的形成過(guò)程中發(fā)揮作用。MyoG基因是肌肉發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子,主要負(fù)責(zé)驅(qū)動(dòng)終末分化,不僅能促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化和融合[47],而且能有效激活該過(guò)程所需的靶基因[48-49]。有研究發(fā)現(xiàn),MyoG基因相對(duì)表達(dá)量的下調(diào)能抑制成肌細(xì)胞的融合和肌肉細(xì)胞分化[50-52];Davie等[48]報(bào)道,骨骼肌缺乏MyoG基因會(huì)導(dǎo)致小鼠在出生時(shí)死亡,這表明MyoG基因?qū)τ诩∪馍L(zhǎng)發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用。Ibrahim等[53]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加胍基乙酸能顯著提高鴨子肌肉中MyoG基因相對(duì)表達(dá)量。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),胍基乙酸基礎(chǔ)上補(bǔ)充甜菜堿組肌肉MyoG基因相對(duì)表達(dá)量顯著升高,并且Myf5基因相對(duì)表達(dá)量有升高的趨勢(shì)。Lu等[39]報(bào)道,胍基乙酸顯著提高了育肥豬背最長(zhǎng)肌中MyoD、Myf5等基因相對(duì)表達(dá)量。MSTN是一種具有重要生理功能的負(fù)調(diào)節(jié)因子,也稱(chēng)為生長(zhǎng)分化因子-8,主要作用是抑制肌細(xì)胞生長(zhǎng)和分化[54-55]。Farshidfar等[56]研究發(fā)現(xiàn),胍基乙酸及其代謝物肌酸能通過(guò)下調(diào)MSTN基因相對(duì)表達(dá)量來(lái)消除其對(duì)肌肉生長(zhǎng)的抑制作用。Lu等[39]研究發(fā)現(xiàn),胍基乙酸能顯著降低育肥豬背最長(zhǎng)肌中MSTN基因相對(duì)表達(dá)量。但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),胍基乙酸對(duì)MSTN基因相對(duì)表達(dá)量并無(wú)顯著影響,造成不同結(jié)果的原因有待進(jìn)一步研究。綜上所述,飼糧中添加胍基乙酸和甜菜堿能提高背最長(zhǎng)肌MyoG基因相對(duì)表達(dá)量,進(jìn)而促進(jìn)肌纖維的發(fā)育。

4 結(jié) 論

飼糧中添加胍基乙酸和甜菜堿能提高育肥豬生長(zhǎng)性能、屠宰性能和肌纖維橫截面積,促進(jìn)肌纖維的增殖與分化,且聯(lián)合添加胍基乙酸與甜菜堿的促生長(zhǎng)效果優(yōu)于單獨(dú)添加胍基乙酸。