嗜黏蛋白阿克曼菌的生理功能及其在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用前景

王祥煌 杜雯鵑 徐 樂 許慶彪

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,武漢 430070)

2004年,Derrien等[1]首次分離出一種革蘭氏陰性、嚴(yán)格厭氧、不運(yùn)動(dòng)、無形成孢子的橢圓形細(xì)菌,該菌可以單獨(dú)或成對(duì)生長(zhǎng),是屬于阿克曼氏菌屬(Akkermansia)的新細(xì)菌,稱為嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila,AKK)。眾多研究表明,AKK在腸道中的相對(duì)豐度與代謝疾病和腸道疾病呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)[2-6]。近年來,國(guó)內(nèi)外深入研究了AKK對(duì)代謝疾病及腸道疾病的影響,然而畜禽作為代謝疾病及腸道疾病的重災(zāi)區(qū),AKK在畜禽方面的研究卻寥寥無幾。本文綜述了AKK的生物學(xué)功能及其在脂肪肝病、肥胖、糖尿病等代謝性疾病以及腸道疾病方面的研究,為推進(jìn)AKK在控制畜禽疾病的研究及應(yīng)用中提供參考。

1 AKK的生物學(xué)功能

1.1 調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝

脂肪肝和肥胖都屬于脂質(zhì)代謝疾病,在人類和動(dòng)物群體中經(jīng)常發(fā)生并導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問題。預(yù)計(jì)到2030年,肥胖及脂肪肝可能會(huì)影響超過85%的人口和70%～80%的馬和牛;目前,有60%以上的哺乳期奶牛發(fā)生脂肪肝,導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降;40%～60%的高泌乳奶牛在產(chǎn)犢后2～4周內(nèi)肥胖,導(dǎo)致中度至重度脂肪肝,患病奶牛的死亡率達(dá)25%;這類疾病將對(duì)全球奶業(yè)造成了巨大影響[7-8]。傳統(tǒng)治療奶牛脂肪肝的藥物有糖皮質(zhì)激素(地塞米松和去氫氧化可的松等)和葡萄糖前體物質(zhì)(乳酸銨、丙酸鎂、乳酸鈣等)等[9],治療時(shí)需要耗費(fèi)大量人力物力,且伴隨著奶牛水鹽代謝紊亂、免疫力下降等副作用。研究發(fā)現(xiàn),脂肪肝患者腸道AKK的相對(duì)豐度顯著低于健康對(duì)照組,脂肪肝發(fā)病率與AKK的相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[2];Everard等[3]觀察到AKK的相對(duì)豐度與小鼠及人類體重呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。研究AKK對(duì)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的機(jī)制將為AKK作為飼料添加劑治療奶牛圍產(chǎn)期發(fā)生的脂肪肝提供指導(dǎo),進(jìn)而改善奶牛泌乳期因脂肪肝產(chǎn)生的產(chǎn)奶量下降。

1.1.1 AKK對(duì)脂肪肝的治療作用

AKK作為下一代益生菌(next-generation probiotics,NGPs)[10-11],可以保護(hù)腸道屏障進(jìn)而防止細(xì)菌成分通過Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)轉(zhuǎn)移到門靜脈刺激巨噬細(xì)胞、激活芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AhR)途徑信號(hào),防止脂質(zhì)積累和肝臟細(xì)胞死亡來緩解脂肪肝[12-14]。過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators activated receptor α,PPARα)在脂肪酸攝取和氧化、脂質(zhì)代謝和胰島素敏感性的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用,AKK和槲皮素共同作用能上調(diào)PPARα的表達(dá)[15],進(jìn)而調(diào)節(jié)肝臟中的脂肪酸合成。AKK治療上調(diào)飼喂高脂飼糧(high fat diet,HFD)的脂肪肝小鼠L-天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的表達(dá),促進(jìn)了L-天冬氨酸從腸道運(yùn)輸?shù)礁闻K,進(jìn)而激活肝臟激酶B1(liver kinase B1,LKB1)-腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate activated protein kinase,AMPK)通路,刺激脂質(zhì)氧化,抑制氧化應(yīng)激及誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞損傷;AKK治療的小鼠顯示出線粒體拷貝數(shù)增加,肝臟能量代謝調(diào)節(jié)因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α(peroxisome proliferators-activated receptor γ coactivator-1α,PGC-1ɑ)、肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-1β(carnitine palmityl transferase-1β,CPT-1β)和線粒體復(fù)合物的表達(dá)增加,參與葡萄糖和脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)幕虮患せ?肝臟中脂質(zhì)代謝得到改善;此外,AKK治療還下調(diào)了脂肪生成酶乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)的表達(dá),增加了肝臟中游離脂肪酸移位酶(fatty acid translocase,FAT/CD36)活性和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(fatty acid transport protein 4,FATP4)含量,氧化肝臟內(nèi)積累的脂質(zhì),從而改善小鼠的脂肪肝,通過AKK治療的肥胖小鼠消除了肝脂肪變性、炎癥和肝臟損傷[16]。

1.1.2 AKK對(duì)肥胖的治療作用

在肥胖人群中,巴氏殺菌的AKK顯著降低血漿中總膽固醇含量,降低肥胖人群的胰島素水平和敏感性,顯著降低血漿脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)含量,進(jìn)而減少胰島素抵抗[17],抑制肥胖。在肥胖小鼠中,AKK恢復(fù)了血漿中1-棕櫚酰-甘油和2-棕櫚酰-甘油含量,導(dǎo)致PPARα表達(dá)的上調(diào),進(jìn)而改善肥胖[18],下調(diào)誘導(dǎo)脂肪形成的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARγ)的表達(dá),提高脂肪酸氧化和能量代謝[15]。AKK及其外膜囊泡增加血管生成素樣4(angiopoietin-like 4,angptl4)基因表達(dá),減小脂肪細(xì)胞的大小,上調(diào)低密度脂蛋白受體表達(dá),減少體內(nèi)三酰甘油的含量[19-20]。AKK上調(diào)飼喂HFD小鼠的回腸末端中胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)分泌和葡萄糖穩(wěn)態(tài),誘導(dǎo)褐色脂肪產(chǎn)熱來改善小鼠肥胖,該研究還證明了從AKK中分離純化的P9蛋白在白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)存在的條件下與細(xì)胞間黏附分子-2(intercellular adhesion molecule-2,ICAM-2)結(jié)合能激活GLP-1受體通路[21]。在體外細(xì)胞試驗(yàn)中,AKK裂解液下調(diào)3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂肪生成標(biāo)記物PPARγ、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein α,C/EBPα)、脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid-binding protein 4,FABP4)的表達(dá),減少脂肪酸代謝蛋白、脂肪形成蛋白的表達(dá),從而降低了脂肪細(xì)胞中脂肪酸和三酰甘油的產(chǎn)生,其中AKK裂解液能上調(diào)絲氨酸蛋白酶抑制因子3G(serpin peptidase inhibitory factor 3G,SERPINA3G)的表達(dá),并證明了SERPINA3G是脂肪細(xì)胞中一種有效的抗脂肪生成分子[22]。在模型動(dòng)物秀麗隱桿線蟲中,巴氏殺菌的AKK一方面上調(diào)了脂肪水解酶和脂肪酸β氧化相關(guān)基因表達(dá),加速了血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-2(angiotensin converting enzyme-2,ACE-2)的積累,增加了脂肪酰輔酶A脫氫酶的產(chǎn)生,進(jìn)而增加了脂質(zhì)氧化;另一方面通過抑制長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸蛋白等抑制脂質(zhì)的合成[23]。

1.2 改善肝臟纖維化

肝臟纖維化是慢性刺激和持續(xù)炎癥導(dǎo)致慢性肝臟損傷過程中出現(xiàn)的一種病理變化,是以肝臟星狀細(xì)胞激活為中心環(huán)節(jié),由多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同參與調(diào)控的復(fù)雜病變,具有修復(fù)和損傷雙重性,并最終可能進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝衰竭,甚至肝癌[24]。片吸蟲病在我國(guó)的32個(gè)省、市、自治區(qū)均有發(fā)生,羊的一般感染率為30%～50%,嚴(yán)重的羊群可高達(dá)100%;牛感染率一般為30%～60%,個(gè)別嚴(yán)重牧場(chǎng)可達(dá)90%以上[25]。研究發(fā)現(xiàn),肝臟片吸蟲數(shù)量與肝臟纖維化發(fā)生可能性呈正相關(guān)[26]。AKK既有改善肝臟纖維化的作用,也有促進(jìn)寄生蟲(蠕蟲)排出的作用,每日口服補(bǔ)充巴氏殺菌的AKK比活細(xì)菌具有更強(qiáng)的驅(qū)蟲作用[27],極可能為治療肝臟片吸蟲疾病提供新的方法,研究AKK治療肝臟纖維化機(jī)制,可為降低畜牧中與肝臟纖維化有關(guān)疾病提供新的思路。

肝臟損傷是導(dǎo)致肝臟纖維化的原因之一,AKK通過增加抗凋亡因子B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukaemia-2,Bcl-2)的表達(dá),降低細(xì)胞毒性基因Fas和死亡受體5(death receptor 5,DR5)的表達(dá)來減少肝臟細(xì)胞凋亡,穩(wěn)定菌群結(jié)構(gòu),并釋放細(xì)胞因子從而改善伴刀豆球蛋白A誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷[28]。AKK還可以通過減少正常飲食小鼠中肝臟損傷相關(guān)酶(如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)活性來降低肝臟損傷[29]。AKK及其外膜囊泡改善肝臟組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并抑制α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(Platelet derived growth factor,PDGF)、組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)和Ⅰ型膠原α1(collagen type Ⅰ alpha 1,COL1a1)的表達(dá),使血糖、脂質(zhì)譜和肝臟損傷相關(guān)酶正?；?通過抑制結(jié)腸中肝臟纖維化基因標(biāo)記物、改善菌群結(jié)構(gòu)來減輕肝臟纖維化[30]。

肝臟星狀細(xì)胞作為肝臟衰竭發(fā)生和形成的最重要的細(xì)胞,肝臟星狀細(xì)胞活化可導(dǎo)致肝臟衰竭和肝臟纖維化,AKK能夠抑制肝臟星狀細(xì)胞的活化,進(jìn)而抑制肝臟纖維化[24,31]。如AKK及其外囊泡處理顯著降低在LPS刺激下的人肝臟星狀細(xì)胞(LX-2細(xì)胞)的TLR2、TLR4的表達(dá),減少TLRs數(shù)量,進(jìn)而減少LPS進(jìn)入肝臟損傷肝臟組織[30]。TLR4可以與LPS發(fā)生相互作用并通過轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)誘導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)肝臟星狀細(xì)胞的活化,活化的星狀細(xì)胞上調(diào)α-SMA和TIMP的表達(dá),促使肝臟纖維化的發(fā)生,PPARγ在正常星狀細(xì)胞中高表達(dá),并在星狀細(xì)胞活化過程中下調(diào)。滅活的AKK下調(diào)了TLR4的表達(dá),下調(diào)了LX-2細(xì)胞中α-SMA和TIMP的表達(dá),顯著降低了TGF-β含量,恢復(fù)了PPARγ的表達(dá),表現(xiàn)出對(duì)星狀細(xì)胞活化的抑制作用[24,31]。

1.3 改善糖代謝

隨著我國(guó)人民生活水平的提高,寵物糖代謝疾病如寵物糖尿病逐漸出現(xiàn),并逐漸成為威脅寵物的主要疾病[32]。寵物貓一般患Ⅱ型糖尿病[33],寵物犬一般患Ⅰ型糖尿病[34]。研究發(fā)現(xiàn)AKK具有改善Ⅰ型或Ⅱ型糖尿病的潛力。

AKK能促進(jìn)Ⅰ型糖尿病小鼠微生物群重塑,促進(jìn)小鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞產(chǎn)生黏液,減少隱窩深度,拮抗炎性腸道病原體定植,降低胰島中的LPS、TLR2和TLR4含量,增加抗菌肽再生胰島衍生蛋白3γ(regenerating islet-derived protein 3γ,Reg3γ)的表達(dá),促進(jìn)調(diào)節(jié)免疫,并以此來延緩Ⅰ型糖尿病的發(fā)展[35]。

胰島素抵抗是Ⅱ型糖尿病發(fā)病的主要環(huán)節(jié)[36],胰島素抑制了關(guān)鍵的糖異生酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxy kinase,PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6P)的表達(dá)[37],補(bǔ)充AKK后小鼠肝臟G6P和PEPCK表達(dá)顯著降低,說明肝臟中胰島素敏感性增加,胰島素抵抗降低,Ⅱ型糖尿病得到改善[3,38]。AKK能誘導(dǎo)飼喂HFD的糖尿病小鼠產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和抑制內(nèi)臟脂肪組織中促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生來減輕炎癥,從而導(dǎo)致胰島素信號(hào)增加,改善胰島素抵抗,改善Ⅱ型糖尿病[39]。

1.4 改善腸道屏障與腸道炎癥

腸道屏障主要包括外黏液層與共生的腸道微生物群、抗菌肽和分泌性免疫球蛋白A分子、中央單細(xì)胞層與特殊的上皮細(xì)胞和內(nèi)部固有層[40]。腸道屏障功能的破壞及腸道炎癥導(dǎo)致幼齡動(dòng)物腹瀉,改善腸道屏障及腸道炎癥對(duì)幼齡動(dòng)物腹瀉的改善具有重要意義。幼齡動(dòng)物腹瀉給畜牧業(yè)造成巨大的損失,傳統(tǒng)治療方法一般為抗生素治療,但是容易引起病原微生物產(chǎn)生抗藥性,且在全面禁抗的大環(huán)境下,尋找新的治療方法迫在眉睫[41]。有研究發(fā)現(xiàn),腹瀉犢牛直腸中AKK的相對(duì)豐度與健康犢牛相比顯著降低,表明兩者存在相關(guān)關(guān)系[4]。而在另一項(xiàng)研究中,對(duì)照組仔豬腸道AKK的相對(duì)豐度比病毒性腹瀉仔豬多2.3倍,說明仔豬的腹瀉率與AKK的相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)[5]。在前期的研究中,AKK被發(fā)現(xiàn)具有保護(hù)腸道屏障及緩解腸道炎癥的作用。

1.4.1 改善腸道屏障功能

腸道屏障與動(dòng)物健康成長(zhǎng)息息相關(guān),多種疾病的發(fā)病伴隨著腸道屏障功能的破壞,包括但是不限于:仔豬斷奶應(yīng)激[42]、仔豬斷奶腹瀉[43]、熱應(yīng)激[44]、腸道炎癥、犢牛腹瀉[44]等。

腸道黏液捕獲細(xì)菌并防止上皮細(xì)胞損傷作為宿主防御的第1道防線,而腸道的緊密連接屏障抑制了細(xì)菌抗原從管腔滲漏到上皮組織,潘氏(Paneth)細(xì)胞產(chǎn)生的抗菌肽維持先天免疫進(jìn)而維持腸道屏障的完整性[45-46]。因此,腸道黏液和緊密連接是腸道發(fā)揮屏障功能的重要位點(diǎn)。Chelakkot等[47]研究表明,嗜黏蛋白阿克曼菌的細(xì)胞外囊泡(Akkermansiamuciniphilaextracellular vesicle,AmEVs)在AKK調(diào)節(jié)腸道屏障方面具有重要作用,并證實(shí)了AmEVs通過激活A(yù)MPK途徑調(diào)控緊密連接蛋白閉合蛋白(occludin),進(jìn)而對(duì)腸道通透性起調(diào)節(jié)作用。此外AKK外膜分離的Amuc_1100蛋白處理過的小鼠腸道中封閉蛋白-3(claudin-3)的表達(dá)高于未處理的飼喂HFD的小鼠[47-48],表明AKK通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白claudin-3和occludin來調(diào)控腸道屏障。在體外研究中,AKK處理增大了人克隆結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2細(xì)胞)的跨上皮細(xì)胞電阻,表現(xiàn)為腸上皮屏障功能的增強(qiáng)[49]。Ashrafian等[20]研究證明,在飼喂HFD的小鼠腸道中,屏障相關(guān)基因閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens protein-1,ZO-1)、occludin和封閉蛋白-1(claudin-1)以及封閉蛋白-2(claudin-2)的表達(dá)水平較低,而AKK或其外膜囊泡能夠上調(diào)ZO-1、occludin、claudin-1以及claudin-2的表達(dá),說明AKK通過增加腸道屏障相關(guān)基因表達(dá)來調(diào)控腸道屏障。相關(guān)研究證明,AKK還能增加小鼠回腸中?；视?內(nèi)源性大麻素)含量,而酰基甘油中的2-油酰甘油能通過刺激腸道L細(xì)胞來增加腸道肽的釋放,進(jìn)而改善腸道屏障功能[3]。也有研究表明,AKK能降低小鼠空腸中大麻素受體1(cannabinoid receptor 1,CB1)的表達(dá),阻斷CB1會(huì)降低腸道通透性[50],CB1的表達(dá)水平降低意味著腸道屏障的改善[48]。

已有研究證明,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)能增加肌凝蛋白輕鏈激酶轉(zhuǎn)錄和緊密連接的活性,導(dǎo)致occludin內(nèi)吞,進(jìn)而增強(qiáng)滲漏通路的通透性[51],AKK能夠減少葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠釋放的TNF-α等促炎細(xì)胞因子含量[52],改善腸道的通透性。除此之外,AKK將黏液中難以消化的寡糖鏈降解和釋放,供產(chǎn)丁酸菌使用,增加腸道中丁酸鹽含量[53]。研究證明,丁酸鹽通過上調(diào)緊密連接蛋白claudin-1的轉(zhuǎn)錄來增強(qiáng)腸上皮屏障功能,這無疑是AKK作用于腸道屏障的一種途徑[53-55]。AKK增加小鼠腸道中短鏈脂肪酸含量,增加DSS處理后慢性約束應(yīng)激小鼠中每根絨毛中杯狀細(xì)胞(作用為釋放黏液)的數(shù)量,說明AKK改善了腸道屏障[39,56]。還有研究發(fā)現(xiàn),AKK能黏附在腸上皮細(xì)胞,增強(qiáng)單層腸上皮細(xì)胞完整性,表明其具有強(qiáng)化受損腸道屏障的能力[57]。腸道干細(xì)胞(intestinal stem cell,ISC)可以分化為杯狀細(xì)胞等細(xì)胞,AKK一方面利用腸道黏液,另一方面以G蛋白偶聯(lián)受體41/43(G protein-coupled receptor 41/43,GPR41/43)依賴的方式增強(qiáng)ISC增殖,通過激活Wnt信號(hào)通路,促進(jìn)分泌腸上皮細(xì)胞的分化而增加了黏液的產(chǎn)生,并增加腸道中乙酸、丙酸含量,保證ISC的增殖分化環(huán)境[58]。高果糖飲食和約束應(yīng)激加重了對(duì)小鼠空腸黏膜屏障的損傷,增加了腸道細(xì)胞的凋亡,降低了緊密連接蛋白表達(dá),破壞Paneth細(xì)胞分泌抗菌肽,降低了核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白6(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 6,NLRP6)的表達(dá),促進(jìn)自噬能力,促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。AKK定植通過維持Paneth細(xì)胞的數(shù)量及抗菌肽的分泌,增加NLRP6的表達(dá),促進(jìn)緊密連接蛋白的表達(dá),負(fù)調(diào)控核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路,降低腸道細(xì)胞凋亡,抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá),從而增強(qiáng)了黏膜屏障的防御功能[46]。此外,最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),AKK的LPS中間產(chǎn)物二磷酸腺苷-七聚糖通過α蛋白激酶1(alpha protein kinase 1,ALPK1)/具有叉頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域的TRAF相互作用蛋白[TNF receptor associated factor (TRAF)-interacting protein with a Forkhead-associated (FHA) domain,TIFA]途徑調(diào)節(jié)與腸道屏障有關(guān)基因,包括黏蛋白2(mucin 2,MUC2)及緊密連接蛋白基因claudin-3、occludin的表達(dá)[59]。AKK保護(hù)腸道屏障機(jī)制如圖1所示,AKK對(duì)腸道屏障的保護(hù)作用的主要結(jié)果及文獻(xiàn)來源如表1所示。

1.4.2 緩解腸道炎癥

已有研究表明,AKK對(duì)代謝性炎癥[38]及腸道炎癥[52]具有顯著改善作用。其中急性或慢性胃腸道炎癥是威脅仔豬、犢牛等幼齡動(dòng)物成長(zhǎng)及健康的重要因素[60],AKK治療炎癥機(jī)制為解決幼齡動(dòng)物腸道炎癥提供新的治療思路和理論指導(dǎo)。

表1 AKK對(duì)腸道屏障的保護(hù)作用

續(xù)表1項(xiàng)目Items處理方式Treatment method主要結(jié)果Main result文獻(xiàn)來源Reference sourceC57BL/6N小鼠C57BL/6N mice灌胃AKK給結(jié)腸炎糞菌移植受體小鼠增加絨毛中杯狀細(xì)胞數(shù)量[56]Caco-2細(xì)胞、HT29細(xì)胞Caco-2 cells, HT29 cell測(cè)定AKK與細(xì)胞的結(jié)合能力,測(cè)定跨膜電阻AKK與細(xì)胞顯著結(jié)合,提高單層細(xì)胞完整性[57]C57BL/6J小鼠C57BL/6J mice灌胃AKK給抗生素、約束應(yīng)激、高果糖共同產(chǎn)生的腸道屏障受損小鼠上調(diào)claudin-1、claudin-3、ZO-1基因表達(dá),上調(diào)抗菌肽相關(guān)基因表達(dá),減輕空腸細(xì)胞凋亡和自噬,恢復(fù)炎癥小體NLRP6的表達(dá)[46]C57BL/6小鼠;類器官、無菌小鼠;C57BL/6 mice; organoid, GF mice灌胃AKK給正常的無特定病原體小鼠;AKK處理類器官小鼠;灌胃AKK給無菌小鼠、輻射和甲氨蝶呤處理的腸道屏障受損小鼠增加隱窩高度,增加杯狀細(xì)胞數(shù)量、潘氏細(xì)胞數(shù)量,上調(diào)溶菌酶1基因表達(dá),增加分化相關(guān)細(xì)胞因子含量,激活Wnt信號(hào),產(chǎn)生乙酸和丙酸[58]

Akkermansiamuciniphila:嗜黏蛋白阿克曼菌;AmEVs:嗜黏蛋白阿克曼菌的細(xì)胞外囊泡Akkermansiamuciniphilaextracellular vesicle;HFD:高脂飼糧 high fat diet;AMPK:腺苷酸激活蛋白激酶 adenosine 5′-monophosphate activated protein kinase;LPS:脂多糖 lipopolysaccharide;CB1:大麻素受體1 cannabinoid receptor 1;TLR2:Toll樣受體2 Toll-like receptor 2;IL-1β:白細(xì)胞介素-1β interleukin-1β;IL-6:白細(xì)胞介素-6 interleukin-6;IL-8:白細(xì)胞介素-8 interleukin-8;IL-10:白細(xì)胞介素-10 interleukin-10;TNF-α:腫瘤壞死因子-α tumor necrosis factor-α;TLR4:Toll樣受體4 Toll-like receptor 4;NF-κB:核因子-κB nuclear factor-κB;ZO-1:閉鎖小帶蛋白-1 zonula occludens protein-1;occludin:閉合蛋白;claudin-1:封閉蛋白-1;claudin-2:封閉蛋白-2;DSS:葡聚糖硫酸鈉 dextran sodium sulfate;Reg3g:再生胰島衍生蛋白3g regenerating islet-derived protein 3g;claudin-4:封閉蛋白-4;NLRP6:核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白6 nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 6。表2同 the same as Table 2。

AKK首先被發(fā)現(xiàn)具有緩解組織炎癥的功能,Schneeberger等[6]在小鼠研究中發(fā)現(xiàn),飼喂HFD的肥胖小鼠腸道中AKK的相對(duì)豐度顯著減少,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)測(cè)量發(fā)現(xiàn),16周的代謝性炎癥標(biāo)記物、巨噬細(xì)胞炎癥標(biāo)志物、LPS結(jié)合蛋白表達(dá)水平均顯著升高,而IL-6、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)表達(dá)水平?jīng)]有顯著升高,表明AKK可能與代謝炎癥相關(guān)?？诜嗀KK一方面改善腸道屏障,減少LPS及其受體的相互作用,從而抑制NF-κB和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNK)通路,激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng);另一方面降低肝臟中JNK磷酸化水平,增加NF-κB抑制蛋白水平,進(jìn)而降低代謝性炎癥[38]。AKK產(chǎn)生短鏈脂肪酸,其中的丁酸鹽已被證明通過抑制NF-κB通路和減少促炎基因表達(dá)來誘導(dǎo)抗炎反應(yīng)[53,61]。TLRs通過胞外區(qū)感應(yīng)組織中的危險(xiǎn)信號(hào),AKK通過激活細(xì)胞表達(dá)TLR2,而不激活細(xì)胞表達(dá)TLR5、TLR9和核苷酸結(jié)合寡聚化域蛋白2(nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2,NOD2)受體,經(jīng)相應(yīng)接頭蛋白進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo),激活相關(guān)的核內(nèi)基因,從而誘導(dǎo)感染性炎癥和非感染性炎癥,且在體外試驗(yàn)中,AKK中分離到的外膜蛋白Amuc_1100或AKK本體也被證明通過激活TLR2通路來誘導(dǎo)特定細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)和TNF-α的產(chǎn)生,進(jìn)而改善炎癥[48-49,57,62-63]。此外,AKK還可以分泌P9蛋白[21],通過細(xì)胞間黏附分子2(intercellular adhesion molecule 2,ICAM2)促進(jìn)L細(xì)胞分泌GLP-1或調(diào)節(jié)內(nèi)源性大麻素來調(diào)節(jié)腸道肽,進(jìn)而減輕代謝性炎癥[3,64]。Shen等[19]發(fā)現(xiàn)增加AKK在特定小鼠中的定植,抑制了促炎因子轉(zhuǎn)錄因子JNK1和JNK2的表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)。給小鼠灌服AKK還被證明能夠通過誘導(dǎo)內(nèi)臟脂肪組織中叉頭框蛋白P3(Forkhead box protein P3,Foxp3)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,而CD4+Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能通過抑制M1巨噬細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)來控制局部炎癥,從而防止脂肪組織炎癥[39]。

AKK治療腸道炎癥的研究中發(fā)現(xiàn),DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎導(dǎo)致小腸潰瘍,破壞腸隱窩和腸壁導(dǎo)致炎癥浸潤(rùn),使得腸黏膜結(jié)構(gòu)幾乎不完整,而在用AKK治療小鼠后,小腸組織學(xué)損傷得到改善,小腸黏膜顯示出輕度/中度黏膜炎癥浸潤(rùn)[52]。此外,該研究還證明,在腸道炎癥的小鼠中觀察到腸道促炎細(xì)胞因子TNF-α、白細(xì)胞介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)、IL-6和白細(xì)胞介素-12α(interleukin-12α,IL-12α)以及趨化因子巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein 1α,MIP-1α)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)和角化細(xì)胞源性生長(zhǎng)因子(keratinocyte-derived cytokine,KC)含量增加,而在飼喂AKK的小鼠上促炎因子和趨化因子含量均有顯著下降,說明AKK改善炎癥水平與減少促炎因子及趨化因子含量有關(guān)[52]。還有研究表明,對(duì)于結(jié)腸炎小鼠,Amuc_1100蛋白通過上調(diào)程序性死亡受體-1(programmed cell death-1,PD-1)或直接抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的激活,進(jìn)而減少結(jié)腸內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),表明AKK調(diào)節(jié)小鼠CD8+T細(xì)胞來改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎,AKK能夠減小炎癥細(xì)胞大小,進(jìn)而改善炎癥[20,65]。對(duì)微生物群的不適當(dāng)T細(xì)胞反應(yīng)被認(rèn)為是炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制之一,而AKK能夠誘導(dǎo)小鼠免疫球蛋白G1抗體和抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng),進(jìn)而減輕炎癥性腸病[66]。

AKK改善微生物群落,被證明通過微生物-宿主相互作用改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[52]。一項(xiàng)研究表明,核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)缺失小鼠消除了AKK對(duì)急性結(jié)腸炎的保護(hù)作用,證明AKK通過激活炎癥小體NLRP3緩解DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎或AKK對(duì)結(jié)腸炎的保護(hù)作用依賴于NLRP3的激活[67]。膳食色氨酸通過AhR減輕了DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎,AKK上調(diào)AhR靶向基因細(xì)胞色素P4501A1(CYP1A1)、IL-10、白細(xì)胞介素-22(interleukin-22,IL-22)的表達(dá),增加微生物色氨酸代謝途徑中吲哚乙酸(IAA)和吲哚丙烯酸的含量,進(jìn)而激活A(yù)hR信號(hào),從而緩解結(jié)腸炎癥[13]。在非AhR途徑中,AKK可將色氨酸代謝為吲哚、IAA、吲哚乳酸等,IAA可以上調(diào)血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)通路,抑制RAW264.7細(xì)胞系中LPS誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激[68]。AKKFSDLZ36M5菌株含有metE基因,metE基因負(fù)責(zé)蛋氨酸的形成,蛋氨酸是一種支持蛋白質(zhì)合成和調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫反應(yīng)和屏障功能的必需氨基酸,補(bǔ)充FSDLZ36M5菌株顯著增加了黏蛋白的含量,降低了炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[69]。在重組TNF-α誘導(dǎo)的豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2細(xì)胞)炎癥模型中,活性AKK下調(diào)鈣信號(hào)通路中一些關(guān)鍵基因的表達(dá),如L型鈣通道α1亞基(calcium channel, voltage-dependent, L type, alpha 1S subunit,CACNA1S)、嘌呤能受體P2X1(purinergic receptor P2X1,P2RX1)和嘌呤能受體P2X(purinergic receptor P2X,P2RX);非活性AKK通過下調(diào)細(xì)胞周期基因細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1C(cyclin dependent kinase inhibitor 1C,CDKN1C)的表達(dá)減少細(xì)胞凋亡;兩者均下調(diào)了磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號(hào)通路上游受體的表達(dá),從而直接降低TNF-α、IL-8、IL-1β和IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)[60],進(jìn)而降低細(xì)胞炎癥水平,表明AKK對(duì)仔豬的腹瀉存在潛在的治療作用。AKK緩解腸道炎癥機(jī)制如圖2所示,AKK對(duì)腸道炎癥的緩解作用的主要結(jié)果及文獻(xiàn)來源如表2所示。

2 AKK在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用前景

在最新的研究中,AKK能夠改善脂質(zhì)代謝,減輕了飼喂HFD雞的脂肪肝出血性綜合征,從而促進(jìn)蛋雞的健康、蛋品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,并表示AKK有作為添加劑提高蛋雞生產(chǎn)的潛力[70]。在另一項(xiàng)研究中,AKK通過Wnt信號(hào)通路增加黏蛋白的分泌,增加腸道干細(xì)胞的增殖,減輕沙門氏菌誘導(dǎo)的雛雞腸道損傷,包括結(jié)腸黏膜損傷指數(shù),顯著減少炎癥因子TNF-α和IL-1β含量及體重、腸黏膜評(píng)分[71],表明AKK具有改善雛雞腹瀉的潛力。這些研究結(jié)果表明,AKK有作為飼料添加劑改善家禽脂質(zhì)代謝與腸道疾病的潛力,但在其他動(dòng)物上的研究并不深入,今后應(yīng)深入研究AKK對(duì)不同養(yǎng)殖動(dòng)物的影響,明確其對(duì)動(dòng)物各類疾病的治療作用。

表2 AKK對(duì)腸道炎癥的緩解作用

續(xù)表2項(xiàng)目Items處理方式Treatment method主要結(jié)果Main result文獻(xiàn)來源Reference sourceC57BL/6小鼠C57BL/6 mice灌胃AKK給DSS結(jié)腸炎小鼠FSDLZ36M5菌株下調(diào)促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá),上調(diào)抑炎因子IL-10的表達(dá),增加黏蛋白含量[69]IPEC-J2細(xì)胞IPEC-J2 cells活的或非活性AKK處理TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥降低細(xì)胞凋亡速率,減少炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-8的產(chǎn)生,下調(diào)鈣信號(hào)通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路[60]

3 小結(jié)與展望

綜上所述,AKK作為下一代益生菌,通過調(diào)節(jié)PPARα、L-天冬氨酸、GLP-1的表達(dá)改善脂質(zhì)代謝[72];通過調(diào)節(jié)TGF-β信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)、肝臟損傷相關(guān)酶活性、TLRs通路改善肝臟纖維化;通過調(diào)節(jié)抗菌肽Reg3γ、G6P、PEPCK的表達(dá)改善糖代謝;通過改善緊密連接蛋白、黏液、腸道肽保護(hù)腸道屏障;通過T細(xì)胞、PI3K-Akt途徑、色氨酸代謝等改善腸道炎癥。AKK作為下一代益生菌在動(dòng)物試驗(yàn)與臨床研究表現(xiàn)出安全性,但其產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用需要更多的投入與研究。推進(jìn)AKK作為飼料添加劑在畜牧業(yè)的應(yīng)用及研究,可為畜禽疾病防控提供潛在的解決方案。