抗菌肽在奶牛乳腺炎防治中的研究進(jìn)展

高 爽 童津津 姚 華 張 華

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206)

奶牛乳腺炎是由多種因素引起奶牛乳頭或乳腺組織發(fā)生炎癥性反應(yīng)的疾病,是規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)中的常見(jiàn)病和多發(fā)病之一[1]。該病可影響奶牛泌乳功能,導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)水平下降,甚至影響奶牛的繁殖能力,對(duì)奶牛養(yǎng)殖行業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前,奶牛乳腺炎主要應(yīng)用抗生素進(jìn)行治療,但抗生素的使用容易造成乳汁中藥物殘留以及治療效果下降等問(wèn)題[3]。我國(guó)自2020年1月1日起已全面禁用抗生素作為飼料添加劑。因此,在當(dāng)前養(yǎng)殖環(huán)境下,亟需開(kāi)發(fā)綠色安全、無(wú)毒副作用、無(wú)殘留、無(wú)耐藥性的抗生素替代品。

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是一類具有抗菌、抗病毒和抗真菌活性的防御性小分子肽,其廣泛存在于多細(xì)胞真核生物中,目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)3 200種AMPs[4]。AMPs可通過(guò)多種機(jī)制(如破壞細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)滲透壓和抑制DNA復(fù)制等)發(fā)揮抗微生物活性,同時(shí)還參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)[5]。由于AMPs具有廣譜抗菌、不易產(chǎn)生耐藥性、無(wú)細(xì)胞毒性等優(yōu)勢(shì),近些年AMPs被逐漸應(yīng)用于臨床治療、食品防腐以及畜牧業(yè)飼料添加劑等領(lǐng)域,被認(rèn)為是“后抗生素時(shí)代”減抗替抗最有前途的候選活性物質(zhì)之一。本研究擬對(duì)AMPs的來(lái)源及生物學(xué)作用進(jìn)行概述,列舉并歸納AMPs對(duì)奶牛乳腺炎的調(diào)節(jié)作用與機(jī)制,總結(jié)目前AMPs開(kāi)發(fā)與應(yīng)用方面存在的問(wèn)題,并對(duì)AMPs在奶牛乳腺炎防治領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行探討。

1 AMPs的來(lái)源

目前已知AMPs在微生物、植物、無(wú)脊椎動(dòng)物乃至更復(fù)雜的兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物等物種體內(nèi)均有表達(dá)。根據(jù)AMPs數(shù)據(jù)庫(kù)(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)報(bào)告,目前從各種生物中已鑒定出3 230種AMPs,其中358種來(lái)自細(xì)菌,360種來(lái)自植物,2 396種來(lái)自動(dòng)物(包括一些合成肽),從真菌、古生菌以及原生生物中分別發(fā)現(xiàn)20、5和8種AMPs。根據(jù)AMPs的生物學(xué)作用,可將其分為抗細(xì)菌肽、抗毒素肽、抗病毒肽、抗真菌肽、抗寄生蟲(chóng)肽、抗癌肽、抗糖尿病肽、傷口愈合肽、抗炎肽、抗氧化肽等[6](表1)。

AMPs的發(fā)現(xiàn)可追溯到1939年,Dubos等[7]從土壤樣本的芽孢桿菌中分離出一種抗菌劑,并將其命名為短桿菌肽。這是第1個(gè)被鑒定出的AMP,這種抗菌劑能夠保護(hù)小鼠免受肺炎球菌感染。最早報(bào)道的動(dòng)物來(lái)源的AMPs是吞噬細(xì)胞素(phagocytin),它于1956年分離自兔的白細(xì)胞[8]。1962年,Groves等[9]在牛奶中發(fā)現(xiàn)了牛乳鐵蛋白(bovine lactoferrin,BLf),30年后Bellamy等[10]從BLf的N端17～41處獲得牛乳鐵蛋白肽(bovine lactoferricin,BLfcin)。在之后的20年中,研究人員先后從蠟蟲(chóng)、天蠶蛹(天蠶素,cecropins)以及非洲爪蟾(爪蟾抗菌肽,magainins)中分離出AMPs[11-12]。AMPs幾乎存在于包括人類在內(nèi)的所有多細(xì)胞生物中,它們是免疫系統(tǒng)的重要組成部分。

表1 數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄的AMPs的類型和數(shù)量

2 AMPs的生物學(xué)作用和機(jī)制

2.1 抗細(xì)菌和抗真菌作用及機(jī)制

據(jù)報(bào)道,病原微生物感染是引起奶牛乳腺炎的主要原因,其中致病性病原微生物的入侵是引起乳腺炎的主要病因[10]。目前為止已發(fā)現(xiàn)150多種奶牛乳腺炎致病菌,研究較多的是金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)和無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae,GBS)等病原菌[13]。AMPs具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn),且可清除致病菌產(chǎn)生的生物膜,同時(shí)對(duì)已產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌也能夠起到抑制作用[14]。

AMPs具有多種抗菌機(jī)制,其中之一為膜失穩(wěn)機(jī)制。細(xì)菌細(xì)胞膜是大多數(shù)陽(yáng)離子AMPs的主要靶點(diǎn)[15]。細(xì)菌細(xì)胞膜表面存在陰離子脂類、脂多糖(LPS,革蘭氏陰性菌)或磷壁酸(革蘭氏陽(yáng)性菌),使細(xì)菌膜帶負(fù)電荷。這些帶負(fù)電荷的物質(zhì)會(huì)與AMPs發(fā)生靜電作用,從而破壞膜結(jié)構(gòu)。對(duì)此,人們提出了不同的機(jī)制,即科學(xué)界最接受的3種假設(shè)——桶形壁、地毯(類洗滌劑)和環(huán)形孔機(jī)制[16]。雖然AMPs通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞裂解的能力已被廣泛證實(shí),但AMPs還可能具有更復(fù)雜的抗菌機(jī)制,即細(xì)胞內(nèi)損傷機(jī)制,包括對(duì)細(xì)胞壁的形成、大分子化合物的生物合成以及酶活性、代謝和翻譯的抑制[17]。AMPs可在不破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的情況下,干擾作為細(xì)胞壁和外膜主要成分的肽聚糖(PGN,革蘭氏陽(yáng)性菌)與LPS的生物合成。AMPs還可通過(guò)抑制一些關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)過(guò)程,如核酸和蛋白質(zhì)合成、與ATP相互作用或直接抑制某些ATP依賴酶的活性,從而達(dá)到抑制細(xì)菌繁殖的效果[18]。

AMPs的抗真菌機(jī)制是以細(xì)胞內(nèi)成分或細(xì)胞壁作為靶點(diǎn),破壞真菌細(xì)胞膜完整性并可造成膜結(jié)構(gòu)中孔的形成[19]。白色念珠菌和新型隱球菌是引起真菌性乳腺炎最常見(jiàn)的致病性真菌,乳頭受到損傷、病原體感染以及使用被污染的抗生素溶液、導(dǎo)管或注射器等情況會(huì)提高環(huán)境中真菌進(jìn)入乳腺組織并定植的概率[20]。棘球白素(echinocandin)家族可抑制存在于念珠菌和隱球菌中的1,3-β-葡聚糖合酶,從而導(dǎo)致細(xì)胞壁葡聚糖的排空、滲透壓不穩(wěn)定以及真菌細(xì)胞的溶解而發(fā)揮其抗真菌作用[21]。BLfcin及其相關(guān)肽與白色念珠菌細(xì)胞表面直接接觸后,可引起表面氣泡形成、細(xì)胞腫脹和塌陷等細(xì)胞壁的損傷[22]。

圖1 AMPs的抗菌機(jī)制模型

2.2 抗病毒作用及機(jī)制

口蹄疫病毒和皰疹病毒是導(dǎo)致奶牛乳腺炎發(fā)生的病毒類致病微生物。AMPs主要通過(guò)3種機(jī)制發(fā)揮抗病毒作用:1)阻止病毒與細(xì)胞膜的融合;2)與病毒的膜相接觸,破壞目標(biāo)病毒的包膜;3)與病毒的聚合酶發(fā)生作用,抑制病毒的復(fù)制[24-25]。硫酸乙酰肝素是一種帶負(fù)電荷的糖胺聚糖,其有助于單純皰疹病毒(herpes simplex viruses,HSV)附著于在宿主細(xì)胞表面,而B(niǎo)Lf和BLfcin可通過(guò)與硫酸乙酰肝素結(jié)合來(lái)抑制HSV與宿主細(xì)胞表面的結(jié)合[26]。Shestakov等[27]研究了與牛桿菌素十二肽有遠(yuǎn)親關(guān)系的合成肽1080在體內(nèi)外阻斷單純皰疹病毒2型(HSV-2)感染的能力,并發(fā)現(xiàn)其對(duì)硫酸乙酰肝素有較高的結(jié)合活性,在體外能夠以劑量依賴的方式減少HSV-2的感染。當(dāng)小鼠感染低劑量的病毒時(shí),合成肽1080能夠完全阻斷病毒的復(fù)制,證明了其在預(yù)防小鼠HSV-2感染方面特別有效。

2.3 抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制

乳腺炎的發(fā)生會(huì)使奶牛機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),從而引起免疫系統(tǒng)的充分激活。研究表明,患乳腺炎奶牛的乳汁和血清內(nèi)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等細(xì)胞因子表達(dá)量均上調(diào),致使乳腺組織中磷酸化的p38蛋白(p-p38)、p38蛋白激酶以及Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)表達(dá)量增加,這說(shuō)明p38-絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MARK)通路中相關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化是導(dǎo)致奶牛乳腺炎發(fā)生的重要因素[28]。另外,MARK通路的活化會(huì)激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路,而奶牛乳腺上皮細(xì)胞損傷與TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)[29]。

AMPs被認(rèn)為是動(dòng)植物先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分,也稱為陽(yáng)離子宿主防御肽(cationic host defense peptides,CHDP)。AMPs對(duì)先天免疫系統(tǒng)的保護(hù)性激活是提高感染早期清除能力的關(guān)鍵機(jī)制之一,其作用包括募集白細(xì)胞、調(diào)節(jié)嗜中性粒細(xì)胞的反應(yīng)性以及影響抗原特異性免疫[23]。相反,在有炎癥和/或病原體攻擊的情況下,AMPs通過(guò)抑制TLR/NF-κB和MAPK通路從而選擇性抑制特定的促炎反應(yīng),并通過(guò)增加腸道β-防御素的表達(dá)來(lái)增加機(jī)體抗病能力[30]。因此,可將AMPs定義為可通過(guò)平衡炎癥來(lái)促進(jìn)免疫穩(wěn)態(tài)的分子。

截至目前的研究表明,AMPs選擇性調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的分子機(jī)制非常復(fù)雜,主要包括細(xì)胞內(nèi)肽的攝取、與一些細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)伴侶或受體和多種信號(hào)通路發(fā)生相互作用以及介導(dǎo)不同轉(zhuǎn)錄因子參與免疫反應(yīng)[31]。AMPs在宿主免疫系統(tǒng)中的作用見(jiàn)圖2。

TLR:Toll樣受體 Toll-like receptor;LPS:脂多糖 lipopolysaccharide;DCs:樹(shù)突細(xì)胞 dendritic cells;AMPs:抗菌肽 antimicrobial peptides;pDC: 漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞 plasmacytoid dendritic cell。

3 AMPs對(duì)奶牛乳腺炎的調(diào)節(jié)作用

3.1 AMPs在奶牛體內(nèi)的分布

哺乳動(dòng)物先天性免疫反應(yīng)包括抗菌化合物的產(chǎn)生,如無(wú)機(jī)物質(zhì)(即過(guò)氧化氫或一氧化氮)和抗菌蛋白(即溶菌酶、組織蛋白酶G和乳鐵蛋白等)。奶牛的AMPs主要屬于Cathelicidin和防御素(defensin)家族,其次還有陰離子抗菌肽及BLfcin,大部分存在于中性粒細(xì)胞以及黏膜和皮膚的上皮細(xì)胞[33]。

在牛中性粒細(xì)胞顆粒中共檢測(cè)到7種Cathelicidins,包括indolicidin、牛骨髓抗菌肽(bovine myeloid antimicrobial peptides,BMAPs-27、28、34)和細(xì)菌素(bactenecins,Bac-1、5、7)[34]。防御素是哺乳動(dòng)物天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分,根據(jù)它們二硫鍵的排列、連接方式及表達(dá)位置的差異,可分為α-防御素、β-防御素和θ-防御素[35]。牛源β-防御素主要有氣管抗菌肽(tracheal antimicrobial peptide,TAP)、舌抗菌肽(lingual antimicrobial peptide,LAP)、腸β-防御素(enteric β-defensin,EBD)以及牛中性粒細(xì)胞β-防御素(bovine neutrophil β-defensins,BNBD l-13)[36]。BLf是一種80 ku的鐵結(jié)合糖蛋白,被認(rèn)為是一種重要的宿主防御分子,在體內(nèi)具有廣泛的生理功能[37]。BLfcin是BLf在酸性條件下經(jīng)胃蛋白酶水解產(chǎn)生,由25個(gè)氨基酸組成,對(duì)應(yīng)于BLf的17～41殘基[38]。BLfcin的抑菌效果是BLF的400倍,具有在消化道中不易被降解、耐熱、無(wú)抗原性等優(yōu)點(diǎn),且對(duì)大多數(shù)奶牛乳腺炎致病菌均有抑制和殺滅活性,對(duì)耐抗生素的細(xì)菌也有抑制作用[39]。

3.2 奶牛乳腺炎發(fā)生時(shí)AMPs的表達(dá)量變化

當(dāng)病原體侵入奶牛乳腺后,會(huì)迅速激活動(dòng)物機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的免疫細(xì)胞和腺體分泌AMPs,包括α-防御素、β-防御素以及牛乳腺上皮細(xì)胞分泌的BLf[40]。這些AMPs經(jīng)細(xì)胞合成后分泌到牛奶中,發(fā)揮其抗菌和免疫調(diào)節(jié)活性,這在宿主機(jī)體對(duì)乳腺炎的防御中起著至關(guān)重要的作用。

有研究表明,BMAPs-27的表達(dá)量在奶牛經(jīng)歷第4次泌乳期時(shí)呈上調(diào)趨勢(shì),而B(niǎo)MAP-28的表達(dá)量在第3次和第4次泌乳期低于前2次泌乳期[41]。因此,抗菌肽在奶牛乳腺中的表達(dá)量在奶牛不同的泌乳階段中會(huì)有所不同。LAP的濃度與體細(xì)胞計(jì)數(shù)(somatic cell count,SCC)有明顯的關(guān)聯(lián)性,SCC較低的奶牛,乳腺上皮細(xì)胞較完整,可產(chǎn)生高濃度的LAP,LAP濃度隨乳腺炎的嚴(yán)重程度而不同。奶牛乳腺炎經(jīng)抗生素治療后SCC降低,Kawai等[42]檢測(cè)到BLf的濃度也隨著SCC的降低而降低,并且通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定了由S.aureus引起的亞臨床型奶牛乳腺炎的乳清,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BLf的蛋白質(zhì)表達(dá)量比健康對(duì)照組高2.28倍,基因本體論(gene ontology,GO)分析揭示BLf富集于“抗菌體液反應(yīng)”(GO:0019731)和“天然免疫反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)”(GO:0045089)通路;蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析表明,BLf與indolicidin具有良好的相互作用表征,這表明它們作為AMPs和固有免疫系統(tǒng)關(guān)鍵成分可對(duì)機(jī)體起到雙重保護(hù)作用[43]。另一項(xiàng)研究表明,BLf在健康奶牛的牛奶和乳腺中的表達(dá)水平很低,但在患有臨床型乳腺炎的奶牛中表達(dá)量明顯升高,且牛的BLf基因多態(tài)性與乳腺炎的耐藥性或易感性密切相關(guān)[44]。

4 AMPs在奶牛乳腺炎防治中的應(yīng)用現(xiàn)狀

4.1 在奶牛乳腺炎診斷中的應(yīng)用

與體細(xì)胞相比,蛋白標(biāo)記物與炎癥的相關(guān)性更為密切。由于AMPs的存在與SCC密切相關(guān),因此AMPs可作為檢測(cè)奶牛乳腺炎的炎性標(biāo)志物之一[45]。因此,臨床上已逐漸建立起以AMPs為包被物的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。ELISA不僅保持了高度的特異性,同時(shí)提高了奶牛乳腺炎檢測(cè)的靈敏度。Addis等[46]開(kāi)發(fā)了一種高性能的牛奶pan-cathelicidin ELISA,并發(fā)現(xiàn)不同的奶牛乳腺炎致病菌誘導(dǎo)的Cathelidin釋放豐度不同,這種方法比SCC能更好地反映疾病的嚴(yán)重程度,并且可用于疾病的分類、研究不同病原體引起乳腺炎的能力以及監(jiān)測(cè)疾病的恢復(fù)情況。Puggioni等[47]使用Cathelidin ELISA檢測(cè)來(lái)自亞臨床乳腺炎牛群的牛奶樣本,其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為95.24%,準(zhǔn)確率為61.89%,證明了該方法在區(qū)分亞臨床型乳腺炎、隱性乳腺炎以及奶牛健康評(píng)估方面均具有良好的特異性和較高的敏感性。

4.2 在奶牛乳腺炎防治中的應(yīng)用

治療乳腺炎最有效的方法就是向乳房?jī)?nèi)注入抗生素,但長(zhǎng)期且大量濫用抗生素會(huì)導(dǎo)致一系列副作用,例如耐藥菌株的產(chǎn)生、治療效果的下降、易造成二次感染、在乳制品中殘留等問(wèn)題,殘留在牛奶中的抗生素也會(huì)誘發(fā)人的超敏反應(yīng)[48]。在尋找抗生素替代品的過(guò)程中,研究人員對(duì)AMPs進(jìn)行了大量的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。AMPs可用于奶牛飼料添加劑,改善奶牛生產(chǎn)性能,提高其免疫力。同時(shí),AMPs可制成多種劑型,用于奶牛乳腺炎的預(yù)防和治療。有研究表明,將AMPs作為飼料添加劑添加到奶牛飼糧中可治愈奶牛的隱性乳腺炎,并通過(guò)提高產(chǎn)奶量和降低SCC影響奶牛的產(chǎn)奶性能,對(duì)控制奶牛乳腺炎的發(fā)病率有顯著作用[49]。

乳酸鏈球菌素(nisin)是乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種含34個(gè)氨基酸的小分子抗菌肽,其單獨(dú)使用或與溶菌酶、抗生素聯(lián)合使用可清除奶牛乳腺炎臨床金黃色葡萄球菌分離株產(chǎn)生的生物膜,具有預(yù)防或治療與葡萄球菌生物膜相關(guān)感染的潛力[50]。此外,nisin還被制成復(fù)合型牛乳頭清洗消毒劑,應(yīng)用于大型牧場(chǎng)后能有效降低乳腺炎的發(fā)病率和牛奶中SCC;與其他消毒劑相比,該AMPs消毒劑顯著降低了牧場(chǎng)的生產(chǎn)成本[51]。葉滔等[52]以菌絲霉素為原料,制備的成膜劑對(duì)奶牛隱性乳腺炎的預(yù)防率達(dá)到95%,是預(yù)防奶牛隱性乳腺炎的理想制劑。楊磊[53]從牛脾臟中分離鑒定出新型AMPs并命名為BSN-37,其富含脯氨酸和精氨酸,BSN-37其對(duì)革蘭氏陰性菌有較高的抑菌活性,包括臨床耐藥E.coli菌株。

BLf及其衍生肽的優(yōu)點(diǎn)是具有廣譜的抗菌性,且不會(huì)引起細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生,這擴(kuò)大了它們?cè)谀膛Ｈ橄傺字委熤凶鳛榭股靥娲返膽?yīng)用潛力。在體內(nèi)試驗(yàn)中,Kawai等[54]在患有亞臨床乳腺炎的奶牛乳導(dǎo)管內(nèi)注射了BLf水解液。結(jié)果顯示,乳腺組織中的細(xì)菌含量在注射后的第1天明顯減少,并在注射后的第14天達(dá)到治愈的效果。此外,BLf在乳腺內(nèi)注射后可顯著降低奶牛乳汁中的細(xì)菌計(jì)數(shù)和LPS濃度,顯現(xiàn)出比抗生素更理想的治療效果[55]。在體外條件下,BLf還可顯著降低凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)在牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制率[56]。BLf對(duì)停乳鏈球菌的生長(zhǎng)也有抑制作用,并具有降低細(xì)菌內(nèi)化到小鼠乳腺上皮細(xì)胞的能力[57],因此,研究人員推測(cè)BLf可能是通過(guò)與細(xì)菌結(jié)合并阻止其黏附于乳腺上皮細(xì)胞,從而限制病原菌對(duì)細(xì)胞的侵襲。此外,BLfcin在體外試驗(yàn)中對(duì)奶牛乳腺炎病原體——饒氏無(wú)綠藻(Protothecazopfii),以及從臨床病例中分離出的引起真菌性乳腺炎的幾種真菌也表現(xiàn)出了殺滅作用[58]。

5 AMPs的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用策略

從動(dòng)物體內(nèi)分離抗菌肽不僅步驟繁瑣,產(chǎn)率較低,而且需要一些特殊的設(shè)備,合成抗菌肽的價(jià)格又相當(dāng)昂貴。近年來(lái),研究人員致力于利用基因工程技術(shù)將AMPs基因轉(zhuǎn)入特定生物體中,誘導(dǎo)內(nèi)源性AMPs的表達(dá);或者以母體肽為模板,設(shè)計(jì)并合成衍生肽,以解決AMPs來(lái)源不足、制備周期長(zhǎng)、純度低等問(wèn)題。Pie等[59]發(fā)現(xiàn)BLfcin可以改變其分子結(jié)構(gòu)以適應(yīng)離子強(qiáng)度的變化和疏水作用,這種轉(zhuǎn)變有利于其抗菌功能的發(fā)揮,可以考慮用于開(kāi)發(fā)針對(duì)特定病原體的新型治療劑。重組牛乳鐵蛋白多肽(recombinant bovine lactoferrin polypeptide,rbLfP)是牛乳鐵蛋白經(jīng)基因改造后由畢赤酵母真核表達(dá)載體分泌表達(dá)的一種重造蛋白質(zhì),對(duì)動(dòng)物臨床常見(jiàn)的金黃色葡萄球菌等病原菌均有很好的抑菌活性。李海濤等[60]研究發(fā)現(xiàn),rbLfP可通過(guò)改變細(xì)胞膜表面通透性,對(duì)菌體細(xì)胞膜的完整性造成損傷,導(dǎo)致菌體內(nèi)金屬離子、核酸和蛋白質(zhì)泄漏,從而起到抑菌作用,且rbLfP濃度越高,抑菌作用效果越明顯。王靜[61]使用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建了重組牛LAP-CATHL2抗菌肽,將重組牛LAP-CATHL2灌注到由細(xì)菌混合感染引起的奶牛乳腺炎動(dòng)物模型中,發(fā)現(xiàn)重組AMPs可降低SCC,且在治療72 h后降至正常范圍,該研究結(jié)果表明,重組牛LAP-CATHL2對(duì)細(xì)菌性奶牛乳腺炎有很好的預(yù)防和治療效果。菌絲霉素的衍生肽NZ2114和MP1102在體外能減少乳腺上皮細(xì)胞中內(nèi)化金黃色葡萄球菌的數(shù)量,2種AMPs均能減少小鼠乳腺炎模型乳腺組織中S.aureus的菌落數(shù)以及TNF-α和IL-6的濃度[62];付永巖等[63]將苯丙氨酸和脯氨酸以及精氨酸引入BLfcin18-28中進(jìn)行對(duì)稱改造,得到的新型AMPs具有溶血率低、細(xì)胞毒性小的優(yōu)點(diǎn),并能通過(guò)破壞細(xì)胞外膜、改變細(xì)胞滲透壓,起到殺菌或抑菌的效果。

盡管AMPs具有許多生物學(xué)功能,但靜脈給藥或口服無(wú)法取得理想的效果,這很可能是由于靜脈注射后AMPs被血清蛋白滅活或者是口服后被胃腸道中的酶所降解。近年來(lái),水凝膠和納米制劑作為AMPs的遞送系統(tǒng)受到了廣泛關(guān)注,這種藥物包封和遞送體系可以保護(hù)肽不被血清蛋白降解、提供理想的表征、改善藥物對(duì)靶組織的生物分布和選擇性,從而取得更好的治療效果[64]。Leng等[65]制備出的載BLfcin納米膠囊可通過(guò)破壞白色念球菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜導(dǎo)致菌體死亡,同時(shí)該制劑還增強(qiáng)了上皮細(xì)胞對(duì)白色念珠菌的自然殺傷特性。Manna等[66]從凝乳中提取出多肽并制成水凝膠,用含有16 μg/mL的凝乳肽-水凝膠處理S.aureus,發(fā)現(xiàn)S.aureus細(xì)菌死亡率為62.54%,凝乳肽-水凝膠還可顯著減少S.aureus和銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)生物膜的形成。近年來(lái),研究人員還將納米粒子和水凝膠的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái),形成納米凝膠(一種由離子鍵或非離子鍵組成的三維聚合物,它能在介質(zhì)中分散并能膨脹/收縮到一定的尺寸),可作為AMPs的新型藥物遞送系統(tǒng)[67]。Nordstr?m等[68]研究了陰離子聚-丙烯酸乙酯-共-甲基丙烯酸(MAA)納米凝膠作為陽(yáng)離子抗菌肽LL-37和DPK-060的載體,發(fā)現(xiàn)AMPs是向內(nèi)裝載在納米凝膠中,這保護(hù)了摻入的AMPs免受蛋白酶水解,同時(shí)也降低了多肽介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。

由于納米復(fù)合制劑可實(shí)現(xiàn)高效的AMPs包封、降低多肽毒性的同時(shí)提高其穩(wěn)定性,且能防止AMPs被相關(guān)蛋白酶降解,是一種很有前途的AMPs遞送系統(tǒng)。目前,納米制劑、水凝膠和納米凝膠作為抗菌肽的遞送系統(tǒng)僅在體外和試驗(yàn)動(dòng)物模型中進(jìn)行了評(píng)估,且應(yīng)用于奶牛乳腺炎防治方面的AMPs-納米復(fù)合制劑仍然較少。未來(lái)運(yùn)用基因工程技術(shù)或者化學(xué)合成方法改造制備AMPs,并將其制成穩(wěn)定且低毒的AMPs-納米復(fù)合制劑,用于奶牛乳腺炎的防治將會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。

6 小結(jié)與展望

乳腺炎是規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)中的一種高發(fā)疾病,其對(duì)奶牛健康和福利造成了嚴(yán)重的影響。廣譜抗生素常用于乳腺炎的預(yù)防和治療,但耐藥菌株的產(chǎn)生、治療效果下降以及乳汁中藥物殘留等問(wèn)題的解決刻不容緩。因此,尋找并開(kāi)發(fā)抗生素替代品已成為目前的當(dāng)務(wù)之急和研究熱點(diǎn)。AMPs是一類具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌等多種生物學(xué)活性的多肽,它在宿主先天性免疫中也扮演著重要的角色,了解AMPs在奶牛乳腺中的分布表達(dá)情況、作用機(jī)制及其與免疫系統(tǒng)的相互作用,有助于提高將其應(yīng)用于預(yù)防、診斷和治療奶牛乳腺炎中的可能性。目前,天然來(lái)源的AMPs有提取工藝復(fù)雜、成本高、半衰期短、對(duì)細(xì)胞有毒副作用等缺點(diǎn),限制了其在臨床治療上的應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,研究人員利用基因工程技術(shù)和化學(xué)合成方法生產(chǎn)的AMPs在很大程度上降低了其毒副作用,同時(shí)提高了抗菌性能;納米復(fù)合技術(shù)包被AMPs可以獲得穩(wěn)定性高、溶血活性和毒副作用更低的制劑。未來(lái)還需進(jìn)一步研究AMPs在牛乳腺上皮細(xì)胞中的作用機(jī)制以及調(diào)控奶牛機(jī)體免疫反應(yīng)的信號(hào)通路,并通過(guò)臨床試驗(yàn)驗(yàn)證AMPs單體或復(fù)合制劑、載AMPs納米復(fù)合制劑對(duì)奶牛乳腺炎的防治效果及安全性。