基于指紋圖譜、抗氧化譜效相關(guān)性及多成分含量的訶子炮制方法優(yōu)選Δ

楊武杰，郝 季，鞠成國，2，張 強(qiáng)，安悅言，王 巍#（.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 6600；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)傳承基地，遼寧 大連 6600）

訶子為使君子科植物訶子Terminalia chebulaRetz.或絨毛訶子T. chebulaRetz. var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實，收載于2020 年版《中國藥典》（一部）。其味苦、酸、澀，性平，歸肺、大腸經(jīng)[1]。訶子中含有酚酸類、鞣質(zhì)類、三萜類等多種化學(xué)成分，具有抗氧化、抗癌、抗炎等多種藥理活性[2]。

訶子在臨床上存在生熟異用現(xiàn)象。清代張璐的《本經(jīng)逢原》記載“訶子苦澀降斂，生用清金止嗽，煨熟固腸止瀉”[3]。關(guān)于訶子的炮制方法首載于漢代張仲景的《金匱要略》：“治氣痢，以訶黎勒十枚，面裹煻灰火中煨之，令面黃熟，去核，細(xì)研為末”[4]。后世醫(yī)家多沿用“面裹煻灰火煨”或“濕紙裹煨”之法，直至南北朝雷敩在《雷公炮炙論》中載酒蒸之法——“凡修事，先于酒內(nèi)浸，然后蒸一伏時，其訶黎勒以刀削路，細(xì)銼，焙干用之”[5]。目前，在各省炮制規(guī)范中所載的訶子炮制方法多為單炒法、麩煨法、砂燙法、炒炭法，而少見煻灰火煨法及酒蒸法。

本研究以訶子生品（SP）、單炒品（DC）、麩煨品（FW）、砂燙品（ST）、煻灰火煨品（THH）、炒炭品（CT）、酒蒸品（JZ）為研究對象，分別建立其高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜，同時結(jié)合聚類分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）3 種化學(xué)計量學(xué)分析方法研究其經(jīng)不同方法炮制后指紋圖譜的差異，旨在探索訶子經(jīng)不同方法炮制后指紋圖譜信息的異同。

另外，研究發(fā)現(xiàn)，訶子所含的酚酸類、鞣質(zhì)類成分均有明確的抗氧化活性[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，訶子經(jīng)炮制后化學(xué)成分會發(fā)生轉(zhuǎn)化[7]，筆者推測其抗氧化活性也會隨之發(fā)生改變。同時，中醫(yī)藥古籍所載的訶子經(jīng)典炮制方法如煻灰火煨法在炮制過程中需要面皮包裹，操作繁瑣，且該法在現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)車間難以實現(xiàn)，因此尋找合適的現(xiàn)代炮制方法尤為重要。故本研究采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法測定訶子SP 及不同炮制品的體外抗氧化活性，并結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析（grey relation analysis，GRA）及偏最小二乘回歸分析（partial least squares regression，PLSR）研究訶子SP及不同炮制品抗氧化活性的譜效關(guān)系，探討訶子現(xiàn)代炮制方法與古法的異同，為尋找與經(jīng)典古法相近的現(xiàn)代炮制方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1100 型HPLC 儀、G1314A型可變波長檢測器（美國Agilent公司），F(xiàn)A1004B型萬分之一分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），METTLER AE240 型十萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），U3010型紫外-可見分光光度儀（日本Hitachi公司）。

1.2 主要藥品與試劑

10 批訶子藥材（編號S1～S10）的來源信息見表1，所有藥材均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院宋慧鵬副教授鑒定為使君子科植物訶子T. chebulaRetz.的干燥成熟果實；訶子次酸、沒食子酸、鞣花酸對照品（批號分別為MUST-22112801、MUST-13040103、MUST-14031010）均購自成都曼思特生物科技有限公司，安石榴苷對照品（批號J0201AS，其為安石榴苷A 與安石榴苷B 的混合物，安石榴苷A 與安石榴苷B 互為異構(gòu)體）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，柯里拉京、訶黎勒酸、1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖、訶子酸對照品（批號分別為PRF9101742、PRF8112302、PRF9091704、PRF8071201）均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，所有對照品的純度均大于98%；DPPH（純度＞97%）購自上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，水為超純水。

表1 10批訶子藥材的來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 訶子SP及不同炮制品的制備

（1）SP：取凈訶子，砸去果核，留取果肉，即得[1]。

（2）THH：取凈訶子，用面皮裹后置于煻灰火（木材燃燒后所得灰燼，翻動可見火星而無明火）中，燒至面皮焦黃色（大概燒15 min），取出，放涼，砸去面皮及果核，留取果肉，即得[4]。

（3）DC：取凈訶子置鍋內(nèi)，文火加熱，炒至深黃色（大概炒5 min），取出，放涼，砸去果核，留取果肉，即得[8]。

（4）FW：取凈訶子與麩皮同置鍋中[藥材-麥麩（100∶30，m/m）]，文火加熱，緩慢翻動，以（140±10） ℃煨至黃褐色（大概煨20 min），取出，篩去麩皮，放涼，砸去果核，留取果肉，即得[9]。

（5）ST：取凈河砂置鍋內(nèi)炒燙，倒入凈訶子，以（160±10） ℃翻炒6 min，取出，篩去河砂，放涼，砸去果核，留取果肉，即得[7]。

（6）CT：取凈訶子置鍋內(nèi)，武火加熱，炒至亮黑色（大概炒6 min），取出，放涼，砸去果核，留取果肉，即得[10]。

（7）JZ：取凈訶子加入黃酒浸潤30 min，置于蒸鍋中，蒸24 h，70 ℃烘干，砸去果核，留取果肉，即得[5]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液

分別精密稱取訶子次酸、沒食子酸、安石榴苷、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸、1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖、訶子酸對照品各適量，分別置于10 mL容量瓶中，加入50%乙腈定容制得相應(yīng)對照品溶液。吸取上述各對照品溶液適量，混合，制得每1 mL含12.25 μg訶子次酸、20.00 μg 沒食子酸、32.10 μg 安石榴苷、17.60 μg 柯里拉京、23.64 μg訶黎勒酸、52.80 μg鞣花酸、18.00 μg 1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖、60.72 μg 訶子酸的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液

取訶子SP及不同炮制品，粉碎，過65目篩。精密稱取0.1 g各樣品粉末，加入50%乙腈25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷，以提取溶劑補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液2 mL 用提取溶劑定容至10 mL 容量瓶中，再經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得指紋圖譜用供試品溶液；將該指紋圖譜用供試品溶液以50%乙腈依次稀釋，得質(zhì)量濃度分別為8.0、4.0、2.0、1.0、0.50、0.25 μg/mL的系列溶液，作為測定訶子SP及不同炮制品抗氧化活性用供試品溶液。

2.3 色譜條件

采用Dikma Platisil ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈為流動相A、0.1%甲酸-5%甲醇溶液為流動相B進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，2%A→4%A；5～10 min，4%A；10～12 min，4%A→6%A；12～25 min，6%A→13%A；25～38 min，13%A；38～40 min，13%A→14%A；40～52 min，14%A；52～55 min，14%A→16%A；55～82 min，16%A）；進(jìn)樣量為5 μL；流速為1 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長為270 nm。

2.4 訶子SP及不同炮制品的指紋圖譜研究

2.4.1 精密度試驗

取訶子SP（編號S1）按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以訶黎勒酸色譜峰（峰15）為參照，計算得各共有峰相對保留時間的RSD 為0.68%～1.22%（n＝6），相對峰面積的RSD為0.71%～1.16%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗

取訶子SP（編號S1）按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h 按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以訶黎勒酸色譜峰（峰15）為參照，計算得各共有峰相對保留時間的RSD 為0.84%～1.06%（n＝6），相對峰面積的RSD為0.69%～1.34%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗

取訶子SP（編號S1）按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以訶黎勒酸色譜峰（峰15）為參照，計算得各共有峰相對保留時間的RSD 為0.83%～1.47%（n＝6），相對峰面積的RSD為0.94%～1.21%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 指紋圖譜建立及相似度評價

取10 批訶子藥材，按“2.1”項下方法分別制備10 批SP及不同炮制品，按“2.2.2”項下方法分別制備各樣品的供試品溶液，再按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。將各樣品的色譜數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》，各樣品的分析條件均相同：設(shè)定藥材編號S1的SP樣品圖譜為參照圖譜，設(shè)置時間窗寬度為0.1 min，采用多點校正和Mark 峰匹配生成指紋圖譜（圖略），并采用中位數(shù)法生成各樣品的對照指紋圖譜。經(jīng)識別得到各樣品的20 個共有峰，見圖1A。各批次訶子SP、DC、FW、ST、THH、CT、JZ的相似度分別為0.959～0.996、0.923～0.990、0.952～0.983、0.935～0.993、0.915～0.997、0.924～0.999、0.980～0.997。

圖1 訶子SP 及不同炮制品的HPLC 對照指紋圖譜和混合對照品的HPLC圖

2.4.5 共有峰指認(rèn)

取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖1B），通過與對照指紋圖譜中各共有峰的保留時間進(jìn)行對比，共指認(rèn)出9個共有峰，分別為色譜峰2（訶子次酸）、3（沒食子酸）、6（安石榴苷A）、8（安石榴苷B）、12（柯里拉京）、15（訶黎勒酸）、18（鞣花酸）、19（1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖）、20（訶子酸）。

2.5 訶子SP及不同炮制品中8種成分的含量測定

2.5.1 線性關(guān)系及檢測限、定量限考察

取“2.2.1”項下各對照品溶液，用50%乙腈稀釋成系列質(zhì)量濃度的線性工作液，分別按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取“2.2.1”項下各對照品溶液，用50%乙腈稀釋成系列質(zhì)量濃度的溶液，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，分別以信噪比3∶1和10∶1對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢測限和定量限（其中安石榴苷峰面積為安石榴苷A 與安石榴苷B 峰面積之和）。線性關(guān)系及檢測限、定量限考察結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系及檢測限、定量限考察結(jié)果

2.5.2 精密度試驗

取訶子SP（編號S1）按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，8 種待測成分色譜峰峰面積的RSD 為0.36%～1.07%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗

取訶子SP（編號S1）按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h 按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，8種待測成分色譜峰峰面積的RSD 為0.28%～1.12%（n＝6），表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗

取訶子SP（編號S1）按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)一點法計算8種待測成分的含量。結(jié)果顯示，各成分含量的RSD 為0.23%～1.35%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗

取6份已知成分含量的訶子SP（編號S1）適量，按質(zhì)量比1∶1 加入各對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，計算加樣回收率。結(jié)果顯示，訶子次酸、沒食子酸、安石榴苷、柯里拉京、訶黎勒酸、鞣花酸、1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖、訶子酸的加樣回收率分別為100.3%～101.7%、98.60%～102.3%、99.76%～102.6%、100.4%～102.5%、98.43%～101.8%、99.6%～102.5%、98.24%～102.4%、98.39%～101.3%，RSD 分別為0.35%、1.14%、0.83%、0.75%、0.53%、0.86%、1.12%、0.94%（n＝6），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.5.6 含量測定

取“2.2.2”項下訶子SP及不同炮制品的供試品溶液（各10批），分別按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，采用外標(biāo)一點法計算樣品中8種成分的含量，并計算平均含量，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，訶子經(jīng)過不同炮制方法炮制后，8 種待測成分的含量均發(fā)生了改變，其中CT、JZ 由于經(jīng)過高溫及長時間蒸制，其8種待測成分的含量變化較其他炮制品更為明顯。

表3 訶子SP及不同炮制品中8種成分的含量測定結(jié)果（mg/g，n＝10）

2.6 訶子SP及不同炮制品的抗氧化能力測定

采用DPPH 自由基清除法進(jìn)行抗氧化能力測定[11—12]。精密量取“2.2.2”項下訶子SP 及不同炮制品抗氧化活性用供試品溶液各3 mL，分別置于具塞試管中，精密加入DPPH自由基溶液（0.25 mmol/L）1 mL，混合搖勻，密塞，室溫避光放置30 min。采用紫外-可見分光光度計測定517 nm 波長處各樣品的吸光度（A1）。以等體積50%乙腈代替DPPH 自由基溶液，同法操作，測定其吸光度（A2）；以等體積50%乙腈代替樣品溶液，同法操作，測定其吸光度（A0）。各樣品均測定3 次，取平均值，計算DPPH 自由基清除率：DPPH 自由基清除率（%）＝[1—（A1—A2）/A0]×100%。借助SPSS 22.0 軟件中Probit分析功能，通過Logit法計算訶子SP 及不同炮制品的自由基半數(shù)清除濃度（IC50）。結(jié)果顯示，訶子SP、DC、FW、ST、THH、CT、JZ 對DPPH 自由基的IC50分別為2.209、1.945、3.009、2.960、4.385、7.391、7.736 μg/mL，各樣品的IC50差異明顯，提示不同炮制工藝對訶子抗氧化活性具有不同影響，其中以DC（單炒品）抗氧化活性最強(qiáng)。

2.7 化學(xué)計量學(xué)分析

2.7.1 CA

采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。將收集的70批次訶子樣品（SP及不同炮制品各10批）的共有峰峰面積作為原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入該軟件，用組間連接法計算，采用平方歐氏距離為測度進(jìn)行CA，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，當(dāng)聚類距離為20 時，JZ 和CT 各自聚為一類，而SP、FW、DC、THH、ST 聚為另一類，表明SP、FW、DC、THH、ST 具有一定相似性，其指紋圖譜信息存在部分重疊。

圖2 訶子SP及不同炮制品的指紋圖譜聚類分析樹狀圖

2.7.2 PCA

將訶子SP及不同炮制品的共有峰峰面積作為原始數(shù)據(jù)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行PCA。結(jié)果顯示，KMO 值＞0.6，巴特利特球形檢驗顯著性＜0.05，表明各變量之間具有較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性，提示進(jìn)行PCA具有可行性。

篩選得到特征值＞1 的4 種主成分，其累計方差貢獻(xiàn)率為86.633%，說明這4 種主成分涵蓋了訶子SP 及不同炮制品指紋圖譜86.633%的信息。由主成分因子載荷矩陣可知，色譜峰19（1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄）、15（訶黎勒酸）、11、16、13、12（柯里拉京）、8（安石榴苷B）、5、6（安石榴苷A）對主成分1的貢獻(xiàn)較大；色譜峰7、2（訶子次酸）、4對主成分2的貢獻(xiàn)較大；而主成分3、4中未見貢獻(xiàn)較大的色譜峰。PCA 得分圖（圖3）顯示，訶子JZ、CT 均與SP 及其他炮制品具有顯著區(qū)別，而訶子SP及其他炮制品之間區(qū)分不明顯，與CA結(jié)果一致。

圖3 訶子SP及不同炮制品的PCA得分圖

2.7.3 OPLS-DA

將訶子SP及不同炮制品共有峰峰面積作為原始數(shù)據(jù)，采用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行OPLS-DA，結(jié)果見圖4。從圖4 可知，訶子JZ 和CT 能各自聚在一起，而SP 和其他炮制品聚在一起，結(jié)果與CA、OPLS-DA 結(jié)果保持一致，且OPLS-DA 分離效果較PCA 更好，更適用于訶子SP及不同炮制品的指紋圖譜數(shù)據(jù)分析。OPLS-DA模型的R2X為0.944、R2Y為0.512，均大于0.5，表明該模型對X矩陣和Y矩陣均有較好的解釋能力；Q2為0.456＞0.4，表明該模型對樣品變量有良好的預(yù)測能力。

圖4 訶子SP及不同炮制品的OPLS-DA得分圖

結(jié)合重要變量投影結(jié)果，以變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值＞1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選訶子SP 及不同炮制品之間的差異性色譜峰。結(jié)果顯示，VIP值從大到小依次為色譜峰20（訶子酸，VIP＝2.149）、15（訶黎勒酸，VIP＝1.824）、3（沒食子酸，VIP＝1.787）、18（鞣花酸，VIP＝1.748）。

2.8 譜效關(guān)系分析

2.8.1 GRA

將訶子SP 及不同炮制品的IC50及共有峰峰面積導(dǎo)入SPSSPRO 在線分析平臺（https：//www.spsspro.com），對數(shù)據(jù)進(jìn)行均值化處理，并將共有峰峰面積作為自變量，IC50作為因變量進(jìn)行GRA，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，色譜峰7、2（訶子次酸）、9、18（鞣花酸）、3（沒食子酸）、4、1 與IC50的關(guān)聯(lián)度均大于0.6，說明上述色譜峰所對應(yīng)的成分與抗氧化活性聯(lián)系較為緊密。

表4 訶子SP及不同炮制品各共有峰和IC50的關(guān)聯(lián)度

2.8.2 PLSR

將訶子SP 及不同炮制品的IC50（因變量）和共有峰峰面積（自變量）導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PLSR，該模型的診斷參數(shù)如下：R2X＝0.992，R2Y＝0.980，Q2＝0.867，數(shù)值均大于0.5。這說明該模型有很好的解釋能力和預(yù)測能力。模型自動擬合出偏最小二乘回歸系數(shù)，系數(shù)為正時說明該色譜峰對應(yīng)的化合物與抗氧化活性呈正相關(guān)，系數(shù)為負(fù)時則為負(fù)相關(guān)。結(jié)果顯示，色譜峰1、3（沒食子酸）、4、6（安石榴苷A）、8（安石榴苷B）、10、11、12（柯里拉京）、13、15（訶黎勒酸）、20（訶子酸）所對應(yīng)的成分與訶子SP 及不同炮制品的抗氧化活性呈正相關(guān)，其余色譜峰對應(yīng)的成分與訶子SP及不同炮制品的抗氧化活性呈負(fù)相關(guān)。

結(jié)合重要變量投影結(jié)果，以VIP值＞1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選訶子SP 及不同炮制品的抗氧化活性主要藥效峰，分別是色譜峰20（訶子酸，VIP＝2.483）、15（訶黎勒酸，VIP＝2.283）、18（鞣花酸，VIP＝1.130）、12（柯里拉京，VIP＝1.084）、3（沒食子酸，VIP＝1.041）。

3 討論

筆者在前期實驗中發(fā)現(xiàn)，訶子中部分鞣質(zhì)類成分在高濃度甲醇中存在不穩(wěn)定現(xiàn)象，但在乙腈-水不同配比下，部分色譜峰選擇性較差，經(jīng)在洗脫體系中加入少量甲醇調(diào)節(jié)后分離效果得以改善，同時加入少量甲酸可以改善峰形，因此本研究最終選擇乙腈（A）、0.1%甲酸-5%甲醇溶液（B）組成流動相體系。另外，在測定前對訶子提取液進(jìn)行200～400 nm 波長范圍的吸收光譜掃描，發(fā)現(xiàn)其在270 nm波長處有最大吸收，因此本研究選擇檢測波長為270 nm。

訶子SP 及不同炮制品共標(biāo)定出20 個共有峰，指認(rèn)出其中9 個色譜峰。通過CA、PCA、OPLS-DA 3 種化學(xué)計量學(xué)方法分析，結(jié)果均顯示CT和JZ能各自區(qū)分為一類，而SP、DC、ST、FW、THH區(qū)分不明顯。對比3種分析方法，有監(jiān)督模式的OPLS-DA區(qū)分效果更明顯，更適用于多種炮制品指紋圖譜的分析。由OPLS-DA 結(jié)果可知，訶子酸、訶黎勒酸、沒食子酸、鞣花酸4種成分對訶子SP及不同炮制品指紋圖譜信息影響較大；結(jié)合含量測定結(jié)果可以看出，訶子炮制前后其訶子酸、訶黎勒酸、沒食子酸、鞣花酸的含量變化較明顯，這可能是因為炮制使訶子的化學(xué)成分發(fā)生了轉(zhuǎn)化。此外還可以看出，炮制時間和溫度不同，訶子的化學(xué)成分會發(fā)生不同程度的轉(zhuǎn)化，其中CT 經(jīng)過高溫炒至炭化，JZ 經(jīng)過24 h 長時間蒸制，導(dǎo)致大部分成分被破壞、分解，使得二者指紋圖譜信息與其他炮制品相比區(qū)別明顯。

《本經(jīng)逢原》首次提出訶子生熟異用的觀點，認(rèn)為炮制可使訶子固腸止瀉的作用增強(qiáng)，更適用于“腸澼”的治療?！澳c澼”與現(xiàn)代臨床潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）相對應(yīng)。本課題組前期對訶子SP 及不同炮制品治療UC的藥效學(xué)進(jìn)行了比較，證實了訶子在炮制后對UC的治療作用確有增強(qiáng)[7]，該作用與其對氧化應(yīng)激指標(biāo)的調(diào)控有關(guān)。同時文獻(xiàn)研究表明，訶子擁有強(qiáng)抗氧化活性，其清除自由基的能力為臨床常用藥依達(dá)拉奉的數(shù)倍[13]，通過抗氧化途徑能夠起到心臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、抗炎等作用[14—15]。本研究采用DPPH 自由基清除法測定了訶子SP 及不同炮制品的抗氧化活性，GRA 結(jié)果顯示，色譜峰7、2（訶子次酸）、9、18（鞣花酸）、3（沒食子酸）、4、1 所對應(yīng)的成分與抗氧化活性聯(lián)系較為緊密；結(jié)合PLSR，可初步判斷訶子酸、訶黎勒酸、柯里拉京、沒食子酸是訶子抗氧化活性的重要藥效成分。文獻(xiàn)亦報道這4種成分均具有明確的抗氧化作用[16—19]。結(jié)合訶子SP 及不同炮制品含量測定與抗氧化實驗中IC50結(jié)果可知，訶子CT和JZ中上述4種成分總含量均較SP明顯降低（4種成分總含量均在3%左右），所表現(xiàn)出的抗氧化活性也較低；而訶子SP及其他炮制品中上述4種成分的總含量高達(dá)20%以上，所表現(xiàn)出的抗氧化活性也明顯升高。雖然訶子的抗氧化活性是多種成分共同作用的結(jié)果，單從4個已知成分含量變化來評價其抗氧化活性不夠全面，但本研究結(jié)果足以證明不同炮制方法對訶子化學(xué)成分產(chǎn)生了不同的影響，進(jìn)而影響到其抗氧化活性。根據(jù)本研究結(jié)果可推測，化學(xué)成分的變化將導(dǎo)致訶子其他生物活性亦隨之變化，從而影響其臨床療效的發(fā)揮。

本研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)代常用炮制方法制備的訶子DC、FW、ST 與古法炮制的THH 的HPLC 指紋圖譜信息較為相似，均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，通過抗氧化譜效相關(guān)性分析所得的4種主要藥效成分（訶子酸、訶黎勒酸、柯里拉京、沒食子酸）總含量均較高，其中以DC的抗氧化活性最強(qiáng)；而訶子JZ與CT的4種抗氧化活性主要藥效成分總含量均較低，其抗氧化活性與其他炮制品相比大大減弱。

綜上所述，訶子DC具有與THH相似的化學(xué)成分及更優(yōu)的抗氧化活性，且單炒法操作簡單，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，因此可初步判斷單炒法是與訶子炮制經(jīng)典古法煻灰火煨法相近且更為優(yōu)良的現(xiàn)代炮制方法。