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    當(dāng)歸多糖改善先兆流產(chǎn)模型大鼠Th1/Th2失衡及保胎作用Δ

    2023-10-16 04:52:04張?zhí)┪?/span>周意園張昌容華詔召貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科貴陽(yáng)55000貴州醫(yī)科大學(xué)臨床微生物與免疫學(xué)教研室貴陽(yáng)55000貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院優(yōu)生研究中心貴陽(yáng)55000貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科貴陽(yáng)55000
    中國(guó)藥房 2023年19期
    關(guān)鍵詞:先兆比值胚胎

    孫 哲,劉 蓮,張?zhí)┪?,?琪,周意園,張昌容,華詔召#(.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科,貴陽(yáng) 55000;.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床微生物與免疫學(xué)教研室,貴陽(yáng) 55000;.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院優(yōu)生研究中心,貴陽(yáng) 55000;.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科,貴陽(yáng) 55000)

    先兆流產(chǎn)是女性妊娠早期出現(xiàn)的腰痛、下腹痛或陰道出血等癥狀,若不及時(shí)進(jìn)行干預(yù)治療最終會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn),甚至給母體生命安全帶來(lái)危害,嚴(yán)重影響孕婦身心健康及家庭幸福。免疫細(xì)胞分化異常及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子失衡是妊娠失敗及流產(chǎn)的重要原因,糾正Th1/Th2型細(xì)胞因子的病理偏移狀態(tài)可改善先兆流產(chǎn)患者內(nèi)分泌水平,并減輕其癥狀[1—2]。此外,磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信號(hào)通路與細(xì)胞代謝、免疫調(diào)節(jié)和激素水平調(diào)節(jié)有關(guān),參與介導(dǎo)了藥對(duì)黃芩-白術(shù)對(duì)先兆流產(chǎn)的治療過(guò)程[3]。激活PI3K/AKT信號(hào)通路可降低Th1/Th2比值,減輕免疫炎癥,進(jìn)而促進(jìn)腎移植存活[4];還可減輕巨噬細(xì)胞M1 極化,進(jìn)而通過(guò)抑制炎癥來(lái)改善脂多糖誘導(dǎo)的小鼠流產(chǎn)癥狀[5]。由此可知,通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)改善Th1/Th2平衡可能是防治先兆流產(chǎn)的重要手段。

    當(dāng)歸多糖是中藥當(dāng)歸中的天然多糖類(lèi)物質(zhì),可通過(guò)減少促炎因子的表達(dá)和釋放,進(jìn)而抑制妊娠期易栓癥模型大鼠的血栓形成[6]。此外,胡燕等[7]研究表明,當(dāng)歸多糖可上調(diào)PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá),并降低復(fù)發(fā)性流產(chǎn)模型大鼠的胚胎死亡率。但當(dāng)歸多糖是否可通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)改善先兆流產(chǎn)患者Th1/Th2平衡,并發(fā)揮保胎作用目前還不清楚。鑒于此,本研究通過(guò)構(gòu)建先兆流產(chǎn)大鼠模型,探究當(dāng)歸多糖調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號(hào)通路對(duì)其Th1/Th2 平衡及胚胎存活的影響,旨在闡明當(dāng)歸多糖防治先兆流產(chǎn)的作用機(jī)制。

    1 材料

    1.1 主要儀器

    RAYTO RT-2100C 型自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自北京華儀通泰環(huán)??萍加邢薰荆籋S-3090 型冰凍切片機(jī)購(gòu)自北京德耳斯儀器有限公司;EVOS M7000 型顯微鏡、AttuneTMNxT 型流式細(xì)胞儀均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;DYY-6C型雙穩(wěn)電泳儀、HE-120型電泳槽、VE-186型轉(zhuǎn)印電泳槽均購(gòu)自南京普陽(yáng)科學(xué)儀器研究所。

    1.2 主要藥品與試劑

    當(dāng)歸多糖(批號(hào)CY110320,純度98%)購(gòu)自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司;米非司酮(批號(hào)410003-201301,純度99.5%)、米索前列醇(批號(hào)410004-201502,純度98.9%)購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司;PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002(批號(hào)L9908,純度≥98%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;大鼠雌激素、孕激素、干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)、白細(xì)胞介素4(interleukin-4,IL-4)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(批號(hào)分別為CB10268-Ra、CB11530-Ra、CB10173-Ra、CB10216-Ra、CB11057-Ra)購(gòu)自上海科艾博生物技術(shù)有限公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、FITC 標(biāo)記的抗大鼠CD4 抗體、APC 標(biāo)記的抗大鼠IFN-γ 抗體、PE標(biāo)記的抗大鼠IL-4 抗體和兔源抗大鼠磷酸化PI3K(p-PI3K)、PI3K、磷酸化AKT(p-AKT)、AKT、GAPDH 一抗以及HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司;外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分離試劑盒購(gòu)自北京匯智和源生物技術(shù)有限公司。

    1.3 動(dòng)物

    本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)SD大鼠(雄性大鼠27只,約7周齡,體重215~245 g;雌性大鼠54只,約8周齡,體重210~240 g),購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)合格證號(hào)為SCXK(渝)2022-0011。所有大鼠均飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi),動(dòng)物房?jī)?nèi)環(huán)境條件設(shè)為溫度22~25 ℃、相對(duì)濕度55%~60%、光照/晝夜各12 h循環(huán)。本研究通過(guò)了貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)為20220018)。

    2 方法

    2.1 造模、分組與給藥

    取SD 雌性大鼠,灌胃己烯雌酚(2 mg/kg)1 次使其發(fā)情[8],然后與SD 雄性大鼠以2∶1 的比例合籠過(guò)夜,次日清晨檢查選出成功受孕的雌鼠(成功受孕特征為雌鼠陰道中有陰栓),此時(shí)記為妊娠第1天。取成功受孕的雌鼠50只,采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對(duì)照組、模型組、當(dāng)歸多糖組、LY294002組和當(dāng)歸多糖+ LY294002組,每組10只。于妊娠第1天開(kāi)始給藥處理:對(duì)照組和模型組大鼠均灌胃10 mL/kg 生理鹽水+腹腔注射10 mL/kg 生理鹽水,當(dāng)歸多糖組大鼠灌胃200 mg/kg 當(dāng)歸多糖[7]+腹腔注射10 mL/kg生理鹽水,LY294002組大鼠灌胃10 mL/kg生理鹽水+腹腔注射5 mg/kg LY294002[9],當(dāng)歸多糖+LY294002 組大鼠灌胃200 mg/kg 當(dāng)歸多糖+腹腔注射5 mg/kg LY294002;每天給藥1 次,連續(xù)給藥7 d。于妊娠第8天,模型組和各給藥組大鼠參照文獻(xiàn)[8]制備先兆流產(chǎn)大鼠模型,即上午8:00灌胃8.3 mg/kg米非司酮,并于下午6:00灌胃100 μg/kg米索前列醇誘發(fā)先兆流產(chǎn)。對(duì)照組大鼠以同樣步驟灌胃等量生理鹽水。然后于妊娠第9天,各組大鼠繼續(xù)按照上述給藥方法給藥4 d。

    2.2 樣本收集及處理

    于妊娠第13天,通過(guò)吸入乙醚麻醉各組大鼠后自腹主動(dòng)脈采集血液,離心后分組采集血清保存在—80 ℃冰箱中備用;再次采集適量腹主動(dòng)脈血,按PBMC 分離試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作分離出其中PBMC,以含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)備用;稱(chēng)定大鼠體重后斷頭處死,開(kāi)腹摘取子宮及卵巢備用。

    2.3 大鼠血清中激素和Th1、Th2型細(xì)胞因子水平測(cè)定

    取“2.2”項(xiàng)下大鼠血清于冰水浴中解凍后,按照ELISA 試劑盒方法檢測(cè)血清中雌激素、孕激素、IFN-γ、TNF-α、IL-4水平。

    2.4 大鼠子宮卵巢指數(shù)及胚胎死亡率測(cè)定

    取“2.2”項(xiàng)下各組大鼠的子宮及卵巢,使用小剪刀剪開(kāi)子宮后觀察胚胎生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù),正常發(fā)育胚胎呈淡紅色且個(gè)體較大,胎鼠輪廓清晰且胎膜完整;死亡胚胎個(gè)體小并呈“竹節(jié)狀”,胎膜結(jié)構(gòu)不完整或不存在,胚胎呈黑褐色并有消失跡象或已經(jīng)消失。按下述公式計(jì)算各組孕鼠胚胎死亡率:胚胎死亡率=死亡胚胎數(shù)/(正常胚胎數(shù)+死亡胚胎數(shù))×100%。取出胚胎后,剝離宮腔及卵巢的脂肪組織,稱(chēng)定子宮和卵巢質(zhì)量,按下述公式計(jì)算各組孕鼠子宮卵巢指數(shù):子宮卵巢指數(shù)(mg/g)=[子宮質(zhì)量+卵巢質(zhì)量(mg)]/體重(g)。

    2.5 大鼠子宮組織形態(tài)觀察

    剪下“2.2”項(xiàng)下各組大鼠的一部分子宮組織,包埋后于液氮內(nèi)速凍,修剪為小方塊后置于冰凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行連續(xù)切片,得到厚約5 μm的切片進(jìn)行復(fù)溫;以預(yù)冷丙酮固定10 min,再進(jìn)行HE染色,經(jīng)洗滌、封片后,采用光學(xué)顯微鏡觀察并任選6個(gè)視野采集圖像。

    2.6 大鼠外周血中Th1、Th2細(xì)胞比例及兩者比值測(cè)定

    取“2.2”項(xiàng)下各組大鼠的PBMC 并計(jì)數(shù),每組取約2×106個(gè)PBMC,以FITC 標(biāo)記的抗大鼠CD4 抗體孵育,洗滌后以固定/透化稀釋液和透化緩沖液孵育;依次孵育APC 標(biāo)記的抗大鼠IFN-γ 抗體和PE 標(biāo)記的抗大鼠IL-4抗體,再次洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其中Th1、Th2細(xì)胞的比例并計(jì)算Th1/Th2比值。

    2.7 大鼠子宮組織中PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定

    取“2.2”項(xiàng)下各組大鼠的子宮組織,提取其總蛋白并于沸水浴中加熱變性,對(duì)總蛋白進(jìn)行定量分析。取20μg 總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(在120 V 恒壓下電泳80 min),然后在40 mA 穩(wěn)定電流下濕轉(zhuǎn)90 min至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,以3%牛血清白蛋白封閉2 h;依次加入兔源抗大鼠p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、GAPDH 一抗(稀釋比例均為1∶2 000),4 ℃孵育過(guò)夜;洗膜后,加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(稀釋比例為1∶1 000),室溫孵育2 h。化學(xué)發(fā)光法顯色后采集各組蛋白條帶圖像,運(yùn)用Image-pro 6.0圖像分析軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白和內(nèi)參蛋白(GAPDH)條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平,PI3K、AKT的磷酸化水平分別以p-PI3K與PI3K相對(duì)表達(dá)水平的比值和p-AKT與AKT相對(duì)表達(dá)水平的比值表示。

    2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用±s表示,組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

    3 結(jié)果

    3.1 大鼠血清中雌激素與孕激素水平測(cè)定結(jié)果

    與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清中雌激素、孕激素水平均顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,當(dāng)歸多糖組大鼠血清中雌激素、孕激素水平均顯著升高(P<0.05),而LY294002組大鼠血清中雌激素、孕激素水平均顯著降低(P<0.05)。與當(dāng)歸多糖組比較,當(dāng)歸多糖+LY294002 組大鼠血清中雌激素、孕激素水平均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 各組大鼠血清中激素和Th1、Th2 型細(xì)胞因子水平測(cè)定結(jié)果(±s,n=10,pg/mL)

    表1 各組大鼠血清中激素和Th1、Th2 型細(xì)胞因子水平測(cè)定結(jié)果(±s,n=10,pg/mL)

    a:與對(duì)照組比較,P<0.05;b:與模型組比較,P<0.05;c:與當(dāng)歸多糖組比較,P<0.05。

    IL-4 19.84±3.59 6.23±1.02a 17.52±3.14b 2.20±0.43b 7.49±1.15c組別對(duì)照組模型組當(dāng)歸多糖組LY294002組當(dāng)歸多糖+LY294002組雌激素1.28±0.14 0.59±0.07a 1.23±0.16b 0.29±0.05b 0.63±0.08c孕激素154.81±32.40 83.25±11.73a 146.34±30.12b 27.96±5.50b 91.12±12.06c IFN-γ 2.64±0.35 5.87±0.63a 2.95±0.40b 7.74±0.75b 5.53±0.58c TNF-α 23.79±4.10 64.82±8.25a 29.35±4.33b 86.43±9.41b 56.10±7.94c

    3.2 大鼠血清中Th1、Th2型細(xì)胞因子水平測(cè)定結(jié)果

    與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清中IFN-γ、TNF-α水平均顯著升高(P<0.05),IL-4水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,當(dāng)歸多糖組大鼠血清中IFN-γ、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05),IL-4水平顯著升高(P<0.05);而LY294002組大鼠血清中IFN-γ、TNF-α水平均顯著升高(P<0.05),IL-4 水平顯著降低(P<0.05)。與當(dāng)歸多糖組比較,當(dāng)歸多糖+LY294002 組大鼠血清中IFN-γ、TNF-α 水平均顯著升高(P<0.05),IL-4 水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

    3.3 大鼠子宮卵巢指數(shù)及胚胎死亡率測(cè)定結(jié)果

    與對(duì)照組比較,模型組大鼠子宮卵巢指數(shù)顯著降低(P<0.05),胚胎死亡率顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,當(dāng)歸多糖組大鼠子宮卵巢指數(shù)顯著升高(P<0.05),胚胎死亡率顯著降低(P<0.05);而LY294002 組大鼠子宮卵巢指數(shù)顯著降低(P<0.05),胚胎死亡率顯著升高(P<0.05)。與當(dāng)歸多糖組比較,當(dāng)歸多糖+LY294002 組大鼠子宮卵巢指數(shù)顯著降低(P<0.05),胚胎死亡率顯著升高(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 各組大鼠子宮卵巢指數(shù)及胚胎死亡率測(cè)定結(jié)果(±s,n=10)

    表2 各組大鼠子宮卵巢指數(shù)及胚胎死亡率測(cè)定結(jié)果(±s,n=10)

    a:與對(duì)照組比較,P<0.05;b:與模型組比較,P<0.05;c:與當(dāng)歸多糖組比較,P<0.05。

    胚胎死亡率/%3.35±0.82 71.54±9.36a 9.42±1.75b 94.62±12.31b 68.95±10.11c組別對(duì)照組模型組當(dāng)歸多糖組LY294002組當(dāng)歸多糖+LY294002組子宮卵巢指數(shù)/(mg/g)11.42±2.46 2.28±0.43a 10.03±2.21b 1.37±0.10b 2.65±0.39c

    3.4 大鼠子宮組織形態(tài)觀察結(jié)果

    對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)正常,細(xì)胞結(jié)構(gòu)規(guī)則且排列緊密;模型組大鼠子宮內(nèi)膜變薄且結(jié)構(gòu)不完整,細(xì)胞排列疏松,間質(zhì)內(nèi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),產(chǎn)生病理?yè)p傷;當(dāng)歸多糖組大鼠子宮組織病理?yè)p傷相比模型組減輕,LY294002 組大鼠子宮組織病理?yè)p傷相比模型組加重;當(dāng)歸多糖+LY294002 組大鼠子宮組織病理?yè)p傷相比當(dāng)歸多糖組加重。結(jié)果見(jiàn)圖1。

    圖1 各組大鼠子宮組織形態(tài)觀察顯微圖(HE染色)

    3.5 大鼠外周血中Th1、Th2細(xì)胞比例及兩者比值測(cè)定結(jié)果

    與對(duì)照組比較,模型組大鼠外周血中Th2細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05),Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2比值均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較,當(dāng)歸多糖組大鼠外周血中Th2 細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05),Th1 細(xì)胞比例、Th1/Th2 比值均顯著降低(P<0.05);而LY294002 組大鼠外周血中Th2細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05),Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2比值均顯著升高(P<0.05)。與當(dāng)歸多糖組比較,當(dāng)歸多糖+LY294002 組大鼠外周血中Th2 細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05),Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2比值均顯著升高(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2、表3。

    圖2 各組大鼠外周血中Th1、Th2 細(xì)胞比例檢測(cè)的流式細(xì)胞圖

    表3 各組大鼠外周血中Th1、Th2 細(xì)胞比例及兩者比值測(cè)定結(jié)果(±s,n=10)

    表3 各組大鼠外周血中Th1、Th2 細(xì)胞比例及兩者比值測(cè)定結(jié)果(±s,n=10)

    a:與對(duì)照組比較,P<0.05;b:與模型組比較,P<0.05;c:與當(dāng)歸多糖組比較,P<0.05。

    組別對(duì)照組模型組當(dāng)歸多糖組LY294002組當(dāng)歸多糖+LY294002組Th1細(xì)胞比例/%1.87±0.40 6.23±0.85a 2.04±0.51b 10.12±0.96b 5.86±0.72c Th2細(xì)胞比例/%5.42±0.76 1.14±0.23a 5.03±0.83b 0.60±0.08b 1.37±0.22c Th1/Th2比值0.35±0.05 5.46±0.94a 0.41±0.08b 16.87±1.85b 4.28±0.72c

    3.6 大鼠子宮組織中PI3K、AKT磷酸化水平測(cè)定結(jié)果

    與對(duì)照組比較,模型組大鼠子宮組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 比值均顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,當(dāng)歸多糖組大鼠子宮組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 比值均顯著升高(P<0.05),而LY294002 組大鼠子宮組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 比值均顯著降低(P<0.05)。與當(dāng)歸多糖組比較,當(dāng)歸多糖+LY294002組大鼠子宮組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 比值均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖3、表4。

    圖3 各組大鼠子宮組織中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖

    表4 各組大鼠子宮組織中PI3K、AKT 磷酸化水平測(cè)定結(jié)果(±s,n=10)

    表4 各組大鼠子宮組織中PI3K、AKT 磷酸化水平測(cè)定結(jié)果(±s,n=10)

    a:與對(duì)照組比較,P<0.05;b:與模型組比較,P<0.05;c:與當(dāng)歸多糖組比較,P<0.05。

    組別對(duì)照組模型組當(dāng)歸多糖組LY294002組當(dāng)歸多糖+LY294002組p-PI3K/PI3K 0.78±0.13 0.41±0.04a 0.75±0.10b 0.12±0.03b 0.44±0.07c p-AKT/AKT 0.84±0.12 0.43±0.06a 0.79±0.13b 0.15±0.03b 0.47±0.08c

    4 討論

    目前,臨床對(duì)先兆流產(chǎn)的治療以服用孕激素、注射黃體酮等方法為主,但長(zhǎng)期采用上述方法治療存在局限性并有一定副作用,因此尋找更安全有效的防治流產(chǎn)的方法具有重要臨床意義[1—2]。Th1/Th2 的動(dòng)態(tài)平衡在妊娠過(guò)程中起到重要作用。Th1/Th2型細(xì)胞應(yīng)答出現(xiàn)生理性失衡,會(huì)導(dǎo)致Th1細(xì)胞分泌的促炎因子IFN-γ、TNF-α等增加及Th2 細(xì)胞分泌的抑炎因子IL-4、IL-10 等減少,進(jìn)而引發(fā)免疫炎癥,這是造成先兆流產(chǎn)的主要病理基礎(chǔ)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)增強(qiáng)妊娠期婦女Th1/Th2 的動(dòng)態(tài)平衡向Th2偏移可促使胚胎正常發(fā)育生長(zhǎng),降低流產(chǎn)的發(fā)生概率[10—11]。本研究通過(guò)灌胃米非司酮和米索前列醇建立先兆流產(chǎn)大鼠模型,結(jié)果顯示,造模大鼠雌激素與孕激素分泌異常降低,Th1/Th2 免疫失衡且偏向Th1,促使Th1 型細(xì)胞因子表達(dá)并減輕Th2 型細(xì)胞因子表達(dá),誘發(fā)免疫炎癥,造成子宮及卵巢形態(tài)受損,引發(fā)胚胎死亡,最終導(dǎo)致先兆流產(chǎn),這提示模型構(gòu)建成功。

    先兆流產(chǎn)在中醫(yī)中屬于“胎動(dòng)不安”“胎漏”“滑胎”,治療以扶脾固腎、養(yǎng)血益氣為主[8]。當(dāng)歸作為常用中藥材具有補(bǔ)腎益精、補(bǔ)血益氣的功效,可調(diào)節(jié)子宮局部免疫細(xì)胞分化及其分泌的與妊娠相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá),進(jìn)而降低誘導(dǎo)性流產(chǎn)模型小鼠胚胎死亡率[12]。當(dāng)歸多糖作為當(dāng)歸的主要活性成分之一,可通過(guò)促進(jìn)微血管形成而增加子癇前期模型大鼠胎盤(pán)血流灌注,促使其胎鼠存活,最終改善其不良妊娠結(jié)局[13]。本研究以當(dāng)歸多糖干預(yù)先兆流產(chǎn)模型大鼠后,可減輕其子宮組織病理?yè)p傷,促使其雌激素、孕激素分泌,升高其血清中IL-4水平、子宮卵巢指數(shù)、Th2 細(xì)胞比例,并降低其胚胎死亡率、Th1細(xì)胞比例、Th1/Th2比值和血清中IFN-γ、TNF-α水平,表明當(dāng)歸多糖可調(diào)控Th1/Th2免疫平衡并糾正其偏向Th1的失衡狀態(tài),減輕免疫炎癥及子宮損傷,促使胚胎存活,最終改善大鼠先兆流產(chǎn)癥狀。該結(jié)果提示,當(dāng)歸多糖在先兆流產(chǎn)的臨床治療中具有廣闊應(yīng)用前景。

    PI3K/AKT 信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)控免疫、激素分泌及細(xì)胞存活等介導(dǎo)妊娠過(guò)程,并與先兆流產(chǎn)的發(fā)生及治療相關(guān)[3],增強(qiáng)PI3K/AKT信號(hào)通路活性可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)及子宮變厚,進(jìn)而改善控制性超促排卵大鼠的子宮內(nèi)膜容受性并促進(jìn)胚胎植入[14]。Yang 等[15]研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT信號(hào)通路參與介導(dǎo)了菟絲子-茯苓藥對(duì)治療先兆流產(chǎn)的過(guò)程;且胡燕等[7]研究表明,當(dāng)歸多糖可激活PI3K/AKT 信號(hào)通路,進(jìn)而改善復(fù)發(fā)性流產(chǎn)模型大鼠激素水平和凝血指標(biāo)并降低其流產(chǎn)率。因而筆者預(yù)測(cè),當(dāng)歸多糖改善先兆流產(chǎn)模型大鼠Th1/Th2 平衡發(fā)揮保胎作用的藥理機(jī)制可能是激活了PI3K/AKT 信號(hào)通路。本研究結(jié)果顯示,先兆流產(chǎn)模型大鼠子宮組織中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 比值相比對(duì)照組大鼠降低,即PI3K、AKT 的磷酸化水平降低,以當(dāng)歸多糖處理后可逆轉(zhuǎn)其變化趨勢(shì);而以該通路抑制劑LY294002 干預(yù)先兆流產(chǎn)模型大鼠,可加重免疫炎癥及子宮損傷,進(jìn)一步損害胚胎發(fā)育并升高其死亡率,使大鼠先兆流產(chǎn)病情加重。這表明PI3K/AKT信號(hào)通路參與了先兆流產(chǎn)的發(fā)生過(guò)程,并介導(dǎo)了當(dāng)歸多糖對(duì)先兆流產(chǎn)模型大鼠的保胎作用及Th1/Th2 平衡的改善過(guò)程。本研究以當(dāng)歸多糖和LY294002 聯(lián)合處理先兆流產(chǎn)模型大鼠,可減弱當(dāng)歸多糖單獨(dú)處理對(duì)大鼠Th1/Th2免疫平衡偏向Th2的促進(jìn)作用,消除其對(duì)免疫炎癥及子宮損傷的減輕作用,最終逆轉(zhuǎn)其對(duì)大鼠先兆流產(chǎn)癥狀的改善作用。這進(jìn)一步證實(shí)了當(dāng)歸多糖改善先兆流產(chǎn)模型大鼠Th1/Th2平衡并對(duì)其發(fā)揮保胎作用是通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

    綜上所述,當(dāng)歸多糖可通過(guò)激活PI3K/AKT 信號(hào)通路,進(jìn)而調(diào)控Th1/Th2平衡并促使其偏向Th2,抑制免疫炎癥的發(fā)生及進(jìn)展,減輕子宮損傷并促使胚胎存活,從而發(fā)揮對(duì)先兆流產(chǎn)模型大鼠的保胎作用。

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